巴氏蘑菇多糖對糖尿病小鼠糖代謝調(diào)節(jié)機制*

何興帥，歐陽玉倩，馮翠萍，常明昌，孟俊龍，劉靖宇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

巴氏蘑菇多糖對糖尿病小鼠糖代謝調(diào)節(jié)機制*

何興帥，歐陽玉倩，馮翠萍**，常明昌，孟俊龍，劉靖宇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

以糖尿病小鼠代謝指標(biāo)和肌肉Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因表達(dá)為觀測點，探討巴氏蘑菇多糖（Agaricus blazei Murill polysaccharides，ABMP）的降血糖作用。體重（30±2）g的健康雄性小鼠隨機分為：正常對照組（NC組）、高血糖模型組（HM組）、低劑量組（LD組）、中劑量組（MD組）、高劑量組（HD組）、藥物治療組（DT組），每組8只。HM組、LD組、MD組、HD組和DT組腹腔注射2%四氧嘧啶3 d（200 mg·kg-1體重），禁食12 h后，血糖值高于11 mmol·L-1說明建模成功。NC組和HM組每天給予0.9%生理鹽水，LD組、MD組、HD組每天分別給予50 mg/kg·體重、100 mg/kg·體重、200 mg/kg·體重的ABMP，DT組每天給予200 mg/kg·體重的阿卡波糖。每周測1次體重，7周后，檢測血糖、胰島素、肝糖原含量和肌肉組織中Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，與NC組相比，HM組空腹血糖升高，差異顯著（P＜0.01），血清胰島素和肝糖原水平明顯降低（P＜0.01），肌肉中Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因的表達(dá)量下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與HM組相比，LD組、MD組、HD組和DT組空腹血糖值均下降，差異顯著（P＜0.05），血清胰島素和肝糖原含量均上升，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；肌肉中Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因的表達(dá)量升高。ABMP能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠體內(nèi)糖代謝，降低血糖。

巴氏蘑菇多糖；血糖；胰島素；Glut4；PI3K；Akt1；Akt2

巴氏蘑菇（Agaricus blazeiMurill，ABM） 營養(yǎng)豐富，除蛋白質(zhì)含量達(dá)40%～50%外，可溶性糖類含量亦高達(dá)38%～45%，是一種藥食兼用的中溫性食用菌[1-2]。研究表明，巴氏蘑菇多糖（ABMP）含有活性抗腫瘤成分，能夠增強機體免疫力，消除疲勞等作用，可以降低疾病的突變率，因而受到人們廣泛關(guān)注[3]。

巴氏蘑菇的降糖活性國內(nèi)外均有報道，目前研究[4-6]表明ABMP和多糖-蛋白復(fù)合體具有降血糖作用。楊旭東等[7-8]證實ABMP可降低胰島素抵抗作用，降低Ⅱ型糖尿病大鼠的胰島素和空腹血糖含量，改善其糖代謝紊亂的現(xiàn)象。Kim等[9]對治療組大鼠分別給予巴氏蘑菇中提取出的β-葡聚糖和寡糖，結(jié)果表明β-葡聚糖和寡糖能夠促進(jìn)胰島素分泌，增加胰島水平，從而降低血糖。但有關(guān)ABMP降血糖的機制目前還不甚清楚，因此，本試驗擬通過構(gòu)建糖尿病小鼠模型，研究ABMP對糖代謝相關(guān)指標(biāo)與信號通路PI3K/Akt影響，旨在探討ABMP的降血糖機制。

1 材料和方法

1.1 材料

巴氏蘑菇，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌工程技術(shù)中心提供。

ABMP參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行制備。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

1.2.1 實驗試劑

四氧嘧啶，Sigma公司；阿卡波糖片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT Master Mix、SYBRRPremix Ex Taq TMⅡ試劑盒，TaKaRa公司；DNA Marker，大連寶生物公司；瓊脂糖，西班牙Agarose；溴化乙錠、EB，BBI公司分裝產(chǎn)品；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒，上海永葉生物科技有限公司；糖原測試盒，南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器與設(shè)備

羅氏血糖儀和血糖試紙，德國羅氏診斷有限公司；DNM-9606酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；D-3752高速冷凍離心機，美國Sigma公司；XW-80A旋渦混合器，上海精科室業(yè)有限公司；Mx3000P熒光定量PCR儀，美國Stratagene公司；Eppendorf AG核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；-80℃冰箱，日本松下公司；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)，意大利BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

48只雄性小鼠，體重（30±2）g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，隨機分為正常對照組（normal control group，NC組）、高血糖模型組 （hyper glycemic model group，HM組）、低劑量組（low dose group，LD組）、中劑量組（middle dose group，MD組）、高劑量組（high dose group，HD組）、藥物治療組（drug treatment group,DT組）共6組，每組8只。HM組、LD組、MD組、HD組和DT組采用腹腔注射的方式，給予200 mg/kg·體重的四氧嘧啶（2%），適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，然后禁食12 h，測得空腹血糖含量均高于判定標(biāo)準(zhǔn)（11 mmol·L-1），說明建模成功。NC組和HM組以同樣量注射0.9%的生理鹽水，LD組、MD組和HD組每天注射50 mg/kg·體重、100 mg/kg·體重和200 mg/kg·體重的ABMP，DT組每天給予200 mg/kg·體重的阿卡波糖。連續(xù)7周，每周測量體重，之后測定其血糖含量；取全血，冷凍離心機離心，制備血清，然后參照試劑盒檢測小鼠胰島素；取小鼠肝臟，檢測肝糖原。以熒光定量RT-PCR法檢測小鼠肌肉中Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因的相對表達(dá)量，具體操作方法參照文獻(xiàn)[11]。其中引物序列（由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成）分別為：β-actin上游引物序列為：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，下游引物序列為5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’；Glut4上游引物序列為：5’-AACTGGACCTGTAACTTCA-3’，下游引物序列為5’-AGGAGGACGGCAAAT-3’；PI3K上游引物序列為：5’-GAAACAAAGCGGAGAACC TAT-3’，下游引物序列為5’-CTTGACTTCGCCGTC TACCAC-3’；Akt1上游引物序列為：5’-AAGGAG GTCATCGTCG-3’， 下 游 引 物 序 列 為 5’-GGTCGTGGGTCTGGAA-3’；Akt2上游引物序列為：5’-GCCACGACCCAACACCT-3’，下游引物序列為5’-TAGCCCGCATCCACTC-3’。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件為：5×Prime ScriptTM RT Master Mix，3 μL；Total RNA（總RNA），750 ng；滅菌雙蒸水（RNase Free ddH2O），總體系達(dá)到15 μL。37℃反應(yīng)15 min；反轉(zhuǎn)錄酶失活溫度85℃，反應(yīng)15 s；平衡溫度4℃。定量PCR反應(yīng)體系和條件：SYBRRPremix Ex Taq TMⅡ （Tli RhaseH Plus，耐熱性 RhaseH Plus）（2×），10.0 μL；PCR上游引物（10 μmol·L-1），0.8 μL；PCR下游引物（10 μmol·L-1），0.8 μL；ROX Reference Dye（50×，ROX染料），0.4 μL；DNA模板，1.0 μL；ddH2O，7.0 μL。定量PCR反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)30 s；95℃反應(yīng)5 s，60℃反應(yīng)34 s，42個循環(huán)；95℃反應(yīng)15 s；60℃反應(yīng)1 min；95℃反應(yīng)15 s。1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ABMP對各組小鼠體重的影響

ABMP對各組小鼠體重的影響見圖1。圖1顯示，試驗前各組平均體重?zé)o明顯差異。實驗階段NC組的小鼠，在飼養(yǎng)期間體重不斷增長，并且一直高于同一時期其他組。DT組和多糖組小鼠體重略下降后逐步上升。1周后，HM組體重較NC組明顯下降（P＜0.01）；HD和DT組體重較HM組上升（P＜0.05）。說明高劑量ABMP和阿卡波糖在第1周就表現(xiàn)出了緩解糖尿病小鼠體重下降的作用。給藥2周～ 7周，HM組小鼠平均體重均低于其他組，且較NC組差異最明顯（P＜0.01）；而多糖組和DT組體重較HM組上升（P＜0.01），且呈現(xiàn)出劑量依賴性。說明一定劑量的ABMP可緩解糖尿病所致的體重下降。

圖1 ABMP對各組小鼠體重的影響Fig.1 Effect of ABMP on body weight of mice

2.2 ABMP對各組小鼠空腹血糖的影響

ABMP對各組小鼠空腹血糖的影響見圖2。由圖2可見，實驗前NC組小鼠血糖值為6.5 mmol·L-1，HM組、LD組、MD組、HD組和DT組小鼠的血糖值依次為20.0 mmol·L-1、19.0 mmol·L-1、19.9 mmol·L-1、21.1 mmol·L-1、20.7 mmol·L-1和20.6 mmol·L-1，說明糖尿病模型建模成功。7周后，HM組小鼠血糖水平在此基礎(chǔ)上仍不斷上升。而LD組、MD組、HD組和DT組空腹血糖值顯著下降（P＜0.05）。說明隨ABMP濃度升高其降血糖作用增強。

圖2 ABMP對各組小鼠空腹血糖的影響Fig.2 Effect of ABMP on blood glucose in mice

2.3 ABMP對各組小鼠血清胰島素的影響

ABMP對各組小鼠血清胰島素的影響見圖3。

由圖3可見，與NC組比較，HM組胰島素含量降低（P＜0.01）。與HM組相比，LD組、MD組、HD組小鼠的胰島素含量都顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），存在一定的量效關(guān)系；DT組小鼠的胰島素含量升高（P＜0.01）。說明ABMP可通過提高胰島素含量這一途徑來影響血糖含量。

2.4 ABMP對各組小鼠肝糖原的影響

ABMP對各組小鼠肝糖原的影響見圖4。

圖4 ABMP對各組小鼠肝糖原的影響Fig.4 Effect of ABMP on hepatic glycogen in mice

圖4中的結(jié)果顯示，HM組較NC組含量低（P＜0.01）；多糖組、DT組較HM組含量升高（P＜0.05）。說明ABMP具有提高肝糖元含量的作用。

2.5 ABMP對各組小鼠肌肉Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因表達(dá)量的影響

ABMP對各組小鼠肌肉Glut4、PI3K、Akt1和 Akt2基因表達(dá)量的影響見圖5。

圖5 各組小鼠肌肉Glut4、PI3K、Akt1和Akt2基因表達(dá)量Fig.5 Muscle relative expression level of Glut4,PI3K,Akt1 and Akt2 in mice

由圖5可見，與NC組相比，HM組肌肉中Glut4、PI3K、Akt1和Akt2中mRNA表達(dá)量下降（P＜0.05）。隨ABMP濃度增加，肌肉中上述mRNA表達(dá)量均較HM組升高，其中HD組的表達(dá)量最高（P＜0.01）。DT組肌肉中上述mRNA表達(dá)量均升高（P＜0.01）。

3 討論

糖尿病病理特征是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞分泌功能下降，引起機體糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，最終引發(fā)多種并發(fā)癥從而嚴(yán)重威脅人類健康。空腹血糖多用于檢驗糖尿病。本實驗中試驗組注射四氧嘧啶，3d后測定其血糖含量，結(jié)果均高于判定標(biāo)準(zhǔn)（11 mmol·L-1），且在1周后，除NC組外，其他各組小鼠均明顯消瘦，體重下降，隨后幾周，ABMP各劑量組和DT組與HM組比較，體重極顯著升高，說明ABMP可改善糖尿病所致的體重降低。

肝糖原含量上升，會引起血糖下降，而在肝臟中，主要通過胰島素來調(diào)節(jié)。胰島素對于機體吸收葡萄糖，進(jìn)入肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞后進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃蛑酒鸬酱龠M(jìn)作用。試驗結(jié)果顯示在四氧嘧啶作用下，胰島素水平下降，肝臟中糖代謝異常，出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，糖原的合成與葡萄糖的攝取受阻，最終使血糖濃度上升。而ABMP能加強胰島素和肝糖原水平，最終起到調(diào)節(jié)糖代謝作用。

大量研究表明，許多藥物和植物可以通過調(diào)控胰島素相關(guān)基因表達(dá)這一途徑來達(dá)到降低血糖的目的[12-16]。PI3K作為該信號傳導(dǎo)途徑（PI3K/Akt）上的重要節(jié)點，其基因表達(dá)下調(diào)會對這一傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生阻礙。Akt位于PI3K下游，是這一通路中的遠(yuǎn)端節(jié)點分子，Akt不僅能反映通路中上游分子的活性狀態(tài)，對下游的Glut4等效應(yīng)因子也具有調(diào)節(jié)作用。Glut4是肌肉組織中重要的載體蛋白，用于葡萄糖的轉(zhuǎn)運，促進(jìn)葡萄糖通過細(xì)胞膜到達(dá)外周組織，并且被攝取和利用。本試驗結(jié)果顯示，ABMP能顯著上調(diào)Glut4、PI3K、Akt1和Akt2的基因表達(dá)量，因此認(rèn)為ABMP作用于胰島素受體，同時激活了PI3K，進(jìn)而使Akt1和Akt2活化，從而增強了胰島素信號傳遞的效應(yīng)。活化的Akt1、Akt2作用于Glut4向細(xì)胞外膜轉(zhuǎn)移，Akt表達(dá)增加使膜外Glut4的數(shù)量增加，而激活的PI3K作用于Glut4，并且使Glut4與膜發(fā)生融合，增加其對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，以便被外周組織吸收和利用，從而降低血糖水平。

綜上所述，ABMP能夠增加Glut4、PI3K、Akt1和Akt2中mRNA的表達(dá)量，提高胰島素水平，改善糖尿病機體高血糖的癥狀，對預(yù)防和緩解糖尿病具有一定的積極作用。

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Glucose Metabolic Regulation Mechanism of Polysaccharides from Agaricus blazei Murill on Diabetic Mice

HE Xing-shuai,OU YANG Yu-qian,FENG Cui-ping,CHANG Ming-chang,MENG Jun-long,LIU Jing-yu
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

To observe the metabolic indices of Agaricus blazei Murill polysaccharides(ABMP)on the diabetic mice,the hypoglycemic function of ABMP on the diabetic mice was discussed.In the test,healthy male mice of（30±2） g were randomly divided into six groups,named as normal control group(NC group),hyperglycemic model group(HM group),low dose group(LD group),middle dose group(MD group),high dose group(HD group)and drug treatment group(DT group).Mice in HM group, ABMP dose groups and DT group were injected intraperitoneally with 2%alloxan (200 mg·kg-1body weight).After 3 days,the mice were fasting for 12 h and the plasma glucose reached level of 11 mmol·L-1,which illustrated the success of building models.The hypoglycemic trail was carried out after modeling success.Mice in the NC group and HM group were given 0.9%normal saline,mice in the LD group,MD group,HD group were administered orally with different doses(50 mg·kg-1,100 mg·kg-1and 200 mg·kg-1body weight)of ABMP,and mice in DT group were given acarbose(200 mg·kg-1body weight)everyday.The weight was measured once a week,after 7 weeks,the content of fasting serum glucose,insulin concentration,hepatic glycogen and the expression levels of Glut4,PI3K,Akt1 and Akt2 in muscle were detected.The results showed that compared with the NC group,the content of fasting serum glucose in HM group was significantly increased (P＜0.01),the content of serum insulin and hepatic glycogen were significantly decreased(P＜0.01),and the expression levels of Glut4、PI3K、Akt1 and Akt2 in muscle were significantly decreased(P＜0.05).Compared with HM group,the content of fasting serum glucose was significantly decreased(P＜0.05)in ABMP dose groups and DT groups,the content of serum insulin and hepatic glycogen were significantly increased(P＜0.05),and the expression levels of Glut4、PI3K、Akt1 and Akt2 in muscle were increased with the increasing of polysaccharides concentrations,respectively.In conclusion,the results demonstrated that ABMP could regulate glucose metabolic of diabetic mice to ruduce the levels of serum glucose.

Agaricus blazei Murill polysaccharide;serum glucose;insulin;Glut4;PI3K;Akt1;Akt2

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0033-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.010

山西省自然科學(xué)基金（No.2010011043-1）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動經(jīng)費項目（No.412564）；山西省煤基重點科技攻關(guān)項目（FT2014-03-01）；山西省高校（2011）黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心資助。

何興帥（1991-），男，在讀碩士研究生，主要研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail:18234497256@163.com

**通信作者：馮翠萍（1970-），女，博士，教授，主要從事食品營養(yǎng)、加工與安全方面研究。E-mail:ndfcp@163.com

2017-01-20