響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黏質(zhì)沙雷氏菌利用菜籽餅粕產(chǎn)靈菌紅素工藝

陳新顏，操麗麗，楊培周,*，王康林，章 華，操新民，鄭 志，姜紹通

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工精深省級實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009；2.平光制藥股份有限公司，安徽 合肥 231131）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黏質(zhì)沙雷氏菌利用菜籽餅粕產(chǎn)靈菌紅素工藝

陳新顏1，操麗麗1，楊培周1,*，王康林2，章 華1，操新民1，鄭 志1，姜紹通1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工精深省級實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009；2.平光制藥股份有限公司，安徽 合肥 231131）

為篩選得到一株產(chǎn)靈菌紅素的黏質(zhì)沙雷氏菌為發(fā)酵菌種，采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件，提高黏質(zhì)沙雷氏菌生產(chǎn)靈菌紅素的效率，結(jié)果表明，黏質(zhì)沙雷氏菌最優(yōu)培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件為玉米粉用量10 g/L、菜籽餅粕用量21.7 g/L、硫酸鋅質(zhì)量濃度0.05 g/L、發(fā)酵液初始pH 5.8、接種量5.5%、裝液量80 mL/250 mL三角瓶、溫度27 ℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵液中靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)到11.56 g/L。本研究為高溫菜籽餅粕原料發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素提供理論依據(jù)。

黏質(zhì)沙雷氏菌；靈菌紅素；菜籽餅粕；響應(yīng)面優(yōu)化；發(fā)酵

油菜籽作為油脂原料，是人類生活和生產(chǎn)的主要食用油來源之一[1]。菜籽餅粕是菜籽油加工的副產(chǎn)品[2]，組分復(fù)雜，其中粗蛋白含量占35%～42%；含有的碳水化合物多為不易消化的戊糖，戊聚糖和粗纖維分別占8%和10%～12%；磷、鈣、錳、硒含量高，磷含量中的60%～70%為植酸磷；煙酸和膽堿的含量高；此外，菜籽餅粕含有較多的異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮、硫氰酸酯、腈、單寧、芥子堿、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子不但影響日糧的適口性[3]，還易引起動物的甲狀腺腫大[4]，高價值合理利用是解決目前我國菜籽餅粕利用的一個出路[5]。

屬于天然紅色素的靈菌紅素是由黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）表達(dá)的次生代謝產(chǎn)物[6]。靈菌紅素具有抗腫瘤、抑制癌細(xì)胞增殖[7]和免疫抑制[8]等活性，在一定劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)良好的抗腫瘤及免疫抑制活性，且引起細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制完全不同于當(dāng)前的臨床藥物，具有潛在的巨大的應(yīng)用價值和市場前景[9]。研究開始在靈菌紅素發(fā)酵生產(chǎn)條件優(yōu)化方面展開了探索[10-14]，已經(jīng)報道的發(fā)酵原料都屬于化工產(chǎn)品，如乙醇[15]、甘油-丙酮[16]等。以農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物特別是利用價值低的副產(chǎn)物菜籽餅粕還鮮有報道。課題組從臭鱖魚腸道內(nèi)分離出一株產(chǎn)紅色素的黏質(zhì)沙雷氏菌，通過結(jié)構(gòu)分析鑒定證明該紅色素為靈菌紅素，并對該菌的發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的條件進(jìn)行初步研究[17]，抑癌實(shí)驗(yàn)表明該靈菌紅素具有強(qiáng)烈抑制人肺癌細(xì)胞A549和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的功能[18]，具有良好的應(yīng)用前景。本研究將菜籽餅粕作為營養(yǎng)組分添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過分析不同組分配方對黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素的影響，提高靈菌紅素的產(chǎn)量，同時實(shí)現(xiàn)菜籽餅粕高值化利用，為高效低成本生產(chǎn)高附加值的靈菌紅素提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

菜籽餅粕購于安徽肥西油菜籽油加工廠，是高溫壓榨菜籽油的副產(chǎn)物；種子培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、10 g/L甘油、2 g/L NaCl；發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L菜籽餅粕、10 g/L碳源、2 g/L無機(jī)鹽離子。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo Electric公司；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 上海博訊公司；PHS-25數(shù)顯酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 黏質(zhì)沙雷氏菌生長曲線的繪制

采用比濁法測定菌體含量，取適量發(fā)酵液進(jìn)行10 倍稀釋，以未接種的培養(yǎng)基做等量對照，在波長600 nm處，測定細(xì)胞懸浮液的吸光度，在3 個250 mL的三角瓶中分別裝50 mL種子培養(yǎng)基，分別加入活化12 h種子液1 mL，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，每隔1 h測定在波長600 nm處的吸光度，繪制黏質(zhì)沙雷氏菌的生長曲線。

1.3.2 靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈菌紅素的檢測

配制不同質(zhì)量濃度的靈菌紅素酸性（pH 3）甲醇溶液（1、2、3、4、5、6 g/100 mL），在535 nm波長處測定吸光度；根據(jù)不同質(zhì)量濃度的靈菌紅素溶液在535 nm處的吸光度，繪制靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2為0.999 7，吸光度和靈菌紅素質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系明顯。取20 mL發(fā)酵液離心去除上清液，通過攪拌將沉淀懸浮于甲醇體系中。細(xì)胞超聲波輔助浸提（超聲波超聲時間10 s、工作間隙3 s、工作次數(shù)7 次、工作最大功率200 W），室溫條件下浸提10 min，收集融入色素的甲醇溶液，反復(fù)提取直到甲醇溶液不變色。將收集的甲醇溶液進(jìn)一步離心，得上清液，調(diào)節(jié)pH值至3，在535 nm波長處測定吸光度，計(jì)算靈菌紅素產(chǎn)量。

1.3.3 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

以靈菌紅素產(chǎn)量為指標(biāo)，分別考察發(fā)酵時間（6、12、18、24、30、36 h）、碳源（蔗糖、玉米粉、紅薯粉、甘油、淀粉、麥芽粉和小麥粉）、菜籽餅粕-玉米粉質(zhì)量比（1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1）、無機(jī)鹽種類（磷酸氫二鉀、硫酸錳、氯化鈣、硫酸鋅、二氯化碳、氯化鈉、磷酸二氫鈉、七水硫酸鎂）、硫酸鋅用量（0、0.05、0.10、0.15、0.25、0.35、0.45 g/L）、發(fā)酵溫度（22、24、26、28、30、32 ℃）、搖床轉(zhuǎn)速（100、150、200、250、300 r/min）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、裝液量（50、60、70、80、90、100 mL）、初始pH值（5.83、6、7、8、9、10）和菜籽餅粕用量（0、5、10、15、20、25、30 g/L）對靈菌紅素產(chǎn)量的影響。單因素試驗(yàn)是在基本培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，對各因素進(jìn)行考察時先固定其他參數(shù)，然后對目標(biāo)因素進(jìn)行考察，基本培養(yǎng)的設(shè)置條件分別為：發(fā)酵時間30 h、10 g/L甘油（碳源）、2 g/L NaCl（無機(jī)鹽離子）、0.1 g/L硫酸鋅、30 ℃、200 r/min搖床轉(zhuǎn)速、5%接種量、80 mL裝液量/250 mL、初始pH 7、20 g/L菜籽餅粕（氮源）。

1.3.3.2 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取菜籽餅粕用量、玉米粉用量、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、無機(jī)鹽用量、溫度為PB試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)六因素PB試驗(yàn)方案。

1.3.3.3 響應(yīng)面分析

以PB試驗(yàn)因素的影響程度為基礎(chǔ)，篩選出3 個影響靈菌紅素產(chǎn)量的主要因素，研究主要因素的最佳水平以及主要因素之間是否存在交互性，通過響應(yīng)面分析確定最佳的發(fā)酵條件。

1.3.4 靈菌紅素的分離純化

在最優(yōu)發(fā)酵條件下提取并純化靈菌紅素，將溶有靈菌紅素的酸性甲醇溶液在70 ℃條件下真空濃縮，取2 倍體積的氯仿對濃縮物進(jìn)行萃取濃縮。將得到的粗品進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫劑為乙酸乙酯；收集硅膠柱中紅色部分，對收集到的洗脫液進(jìn)行濃縮，在真空冷凍干燥機(jī)中干燥得成品。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏質(zhì)沙雷氏菌的生長曲線

黏質(zhì)沙雷氏菌在0～5 h處于適應(yīng)期，6～15 h處于對數(shù)期，16～18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，19 h后進(jìn)入衰亡期。選擇培養(yǎng)12 h的種子液進(jìn)行接種，這種菌種中后期活性大，適應(yīng)性強(qiáng)，延滯期短。

圖1 黏質(zhì)沙雷氏菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Serratia marcescens

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

以玉米粉為碳源，配制相同的發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得的最佳發(fā)酵時間為24 h（圖2a）；玉米粉和紅薯粉兩種碳源獲得靈菌紅素產(chǎn)量最大，由于玉米粉的價格便宜，性價比高，碳源選為玉米粉（圖2b）；當(dāng)菜籽餅粕-玉米粉質(zhì)量比2∶1時靈菌紅素的產(chǎn)量最高（圖2c）；添加Zn2+的發(fā)酵培養(yǎng)基中靈菌紅素的產(chǎn)量比未添加的空白高，其余的離子對產(chǎn)量影響均呈負(fù)相關(guān)，添加的最優(yōu)無機(jī)鹽為硫酸鋅（圖2d）；高質(zhì)量濃度的Zn2+對靈菌紅素可能有輕微的抑制效果（圖2e）；發(fā)酵最適溫度為26 ℃（圖2f）；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時，靈菌紅素產(chǎn)量最大，最優(yōu)轉(zhuǎn)速為200 r/min（圖2g）；添加5%接種量的發(fā)酵培養(yǎng)基靈菌紅素產(chǎn)量最大，最優(yōu)接種量為5%（圖2h）；裝液量達(dá)到80 mL時，靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)到最大，最優(yōu)裝液量80 mL（圖2i）；最優(yōu)pH值為6（圖2j）；最優(yōu)菜籽餅粕的質(zhì)量濃度為20 g/L（圖2k）。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of one-factor-at-a-time experiments

2.3 影響靈菌紅素發(fā)酵產(chǎn)量的PB試驗(yàn)結(jié)果

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table1 Plackett-Burman (PB) design with experimental values of prodigiosin production

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，取單因素試驗(yàn)結(jié)果中上升區(qū)間的兩個水平設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)。裝液量：65～80 mL；菜籽餅粕用量：15～20 g/L；玉米粉用量：5～10 g/L；硫酸鋅用量：0.04～0.05 g/L；溫度：22～26℃；接種量：3%～5%；搖床轉(zhuǎn)速：120～150 r/min，通過軟件處理，得到PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

試驗(yàn)處理方差結(jié)果見表2，該P(yáng)B試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型P值為0.017，該模型顯著，由單因素顯著性可知，B菜籽餅粕用量、E溫度和F接種量的P值均小于0.05，因此，選用這3 個因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面。

表2 PB試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table2 Analysis of variance of the model established based on PB design

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以PB試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，取PB試驗(yàn)結(jié)果中影響顯著的因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)（表3）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與結(jié)果Table3 Experimental design and results for response surface methodology

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面Fig.3 Response surface plots showing the effects of various factors on prodigiosin production

圖3 a中，等高線所圍成的是圓面，溫度與接種量之間的交互影響不顯著，溫度相對于接種量所對應(yīng)的響應(yīng)面更加陡，溫度對靈菌紅素產(chǎn)量的影響更大。沿溫度方向向峰值移動的等高線密度明顯大于沿接種量方向向峰值移動的等高線密度，表明溫度對靈菌紅素影響比接種量大。

圖3b中，接種量與菜籽餅粕用量的等高線所圍成的圖形為橢圓形，表明接種量和菜籽餅粕用量對靈菌紅素產(chǎn)量影響交互作用顯著；沿菜籽餅粕用量方向向峰值移動的等高線密度大于沿接種量方向向峰值移動的等高線密度，表明菜籽餅粕用量對靈菌紅素影響比接種量大。

圖3c中，溫度與菜籽餅粕用量的等高線所圍成圖形為近似圓形，表明溫度和菜籽餅粕用量對靈菌紅素產(chǎn)量影響交互作用不是很顯著，沿溫度方向向峰值移動的等高線密度大于沿菜籽餅粕用量方向向峰值移動的等高線密度，表明溫度對靈菌紅素產(chǎn)量影響比菜籽餅粕用量大。

表4 響應(yīng)面方差分析Table4 Analysis of variance of the response surface model

如表4所示，溫度、接種量和菜籽餅粕用量對靈菌紅素的產(chǎn)量均有極大影響，菜籽餅粕用量與接種量的交互作用對靈菌紅素的產(chǎn)量有一定的影響，這與上述圖形分析中的結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

以菜籽餅粕為發(fā)酵培養(yǎng)基的組分發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素，影響最顯著的3 個單因素為溫度、接種量和菜籽餅粕用量，其主次順序?yàn)椋簻囟龋静俗扬炂捎昧浚窘臃N量，最優(yōu)發(fā)酵條件：溫度27 ℃、菜籽餅粕用量21.7 g/L、接種量5.5%、玉米粉用量10 g/L、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、pH 6、硫酸鋅用量0.05 g/L、裝液量80 mL/250 mL，在此條件下達(dá)到的靈菌紅素最優(yōu)產(chǎn)量為11.56 g/L，分離純化后的成品如圖4所示。

圖4 靈菌紅素濃縮后（A）冷凍干燥后（B）成品Fig.4 Concentrated fermented broth containing prodigiosin (A) and freeze-dried product (B)

黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素過程中存在多種衍生物，包括如十一烷基靈菌紅素等[19]，對靈菌紅素合成的相關(guān)基因簇也有相關(guān)報道[20-21]。在靈菌紅素合成的發(fā)酵條件方面，發(fā)酵液中存在的葡萄糖嚴(yán)重抑制靈菌紅素的合成[22]，而豆油、棕櫚油、葵花子油等脂肪類碳源[23]以及富含脂肪的花生籽粉、芝麻粉能誘導(dǎo)靈菌紅素合成[24]，甘氨酸[25]、脯氨酸、組氨酸及天冬氨酸能夠作為靈菌紅素合成的中間體，參與靈菌紅素的代謝與合成，此外，部分無機(jī)碳也能夠誘導(dǎo)靈菌紅素的合成，如乙醇和甘油等。國內(nèi)部分學(xué)者主要側(cè)重于靈菌紅素鑒定及菌種選育[26-28]。在本研究中，由于黏質(zhì)沙雷氏菌在油脂為底物的發(fā)酵中呈粉紅色，而在菜籽餅粕發(fā)酵中呈血紅色，盡管菜籽餅粕中存在少量殘留的脂肪酸能夠誘導(dǎo)靈菌紅素的表達(dá)，可以確定殘留的油脂并不是本研究中靈菌紅素高產(chǎn)的主因。菜籽餅粕含有較多的如芥子堿、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，對普通微生物生長抑制強(qiáng)烈，大部分細(xì)菌、霉菌和酵母都難以在含有菜籽餅粕的培養(yǎng)基中生長。本研究通過以含有抗?fàn)I養(yǎng)因子的菜籽餅粕為發(fā)酵底物，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件，為利用菜籽加工廢棄物菜籽餅粕生產(chǎn)高價值的醫(yī)藥產(chǎn)物靈菌紅素提供依據(jù)。

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Response Surface Optimization of Prodigiosin Production of Serratia marcescens Using Rapeseed Meal

CHEN Xinyan1, CAO Lili1, YANG Peizhou1,*, WANG Kanglin2, ZHANG Hua1, CAO Xinmin1, ZHENG Zhi1, JIANG Shaotong1
(1. Anhui Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products, School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Pingguang Pharmaceutical Limited by Share Ltd., Hefei 231131, China)

A culture medium containing rapeseed meal was designed for prodigiosin production by Serratia marcescens. Optimizations of culture medium composition and fermentation conditions by response surface method were performed for improved production of prodigiosin. The results indicated that the optimal medium composition was composed of corn powder 10 g/L, rapeseed meal 21.7 g/L, inoculum concentration 5.5%, and zinc sulfate 0.05 g/L at an initial pH of 5.8. When the strain was cultured for 24 h in 80 mL of the medium contained in a 250 mL fl ask with shaking at 200 r/min, the fermented broth had the highest prodigiosin content of 11.56 g/L. This study could provide a basis for the microbial production of prodigiosin from high-temperature rapeseed meal.

Serratia marcescens; prodigiosin; rapeseed meal; response surface optimization; fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201704037

TS209

A

1002-6630（2017）04-0231-06

陳新顏, 操麗麗, 楊培周, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黏質(zhì)沙雷氏菌利用菜籽餅粕產(chǎn)靈菌紅素工藝[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 231-236. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704037. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinyan, CAO Lili, YANG Peizhou, et al. Response surface optimization of prodigiosin production of Serratia marcescens using rapeseed meal[J]. Food Science, 2017, 38(4): 231-236. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201704037. http://www.spkx.net.cn

2016-04-14

合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201510359056）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1604a0702001）

陳新顏（1994—），男，本科生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：1172149534@qq.com

*通信作者：楊培周（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锖桶l(fā)酵工程。E-mail：yangpeizhou@163.com