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    全自動氨基酸分析儀法測定4 種貝類肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量

    2017-03-27 06:50:45張?zhí)K平邱偉強陳舜勝
    食品科學 2017年4期
    關(guān)鍵詞:縊蟶文蛤貝類

    張?zhí)K平,邱偉強,盧 祺,陳舜勝

    (上海海洋大學食品學院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

    全自動氨基酸分析儀法測定4 種貝類肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量

    張?zhí)K平,邱偉強,盧 祺,陳舜勝*

    (上海海洋大學食品學院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

    建立一種測定貝類肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸的全自動氨基酸分析儀法,以4 種常見貝類為研究對象,采用0.02 mol/L鹽酸溶液作為提取劑,體積分數(shù)5%磺基水楊酸溶液為蛋白沉淀劑,同時優(yōu)化了緩沖溶液的組成及洗脫程序,并對該方法的線性范圍、檢出限、精密度以及回收率進行測定。結(jié)果表明:貝類肌肉中的谷胱甘肽和游離氨基酸有著較好的分離效果,線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 1~0.999 9,檢出限(RSN=3)為0.07~0.27 μmol/L,加標平均回收率為86.40%~102.42%,日內(nèi)和日間相對標準偏差分別為0.31%~0.73%和1.14%~2.60%。4 種貝類肌肉組織中的游離氨基酸含量比較豐富,總游離氨基酸含量分別為1 396.39、1 016.04、911.15、287.01 mg/100 g,文蛤>青蛤>縊蟶>牡蠣,主要的游離氨基酸為牛磺酸(Tau)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg);谷胱甘肽含量分別為103.20、82.53、61.77、33.37 mg/100 g,青蛤>文蛤>縊蟶>牡蠣。該方法適用于貝類肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量的測定與分析。

    貝類肌肉;谷胱甘肽;游離氨基酸;全自動氨基酸分析儀法

    貝類屬軟體動物門中的瓣鰓綱(或雙殼綱),常見的螺類、蛤類、扇貝、牡蠣等都屬于該類,貝類具有非常高的食用價值和藥用價值。由于其生存環(huán)境的復雜性,使得貝類含有很多陸地生物沒有的具有特殊生理活性的物質(zhì),含有非常豐富的活性肽和氨基酸等非揮發(fā)性的含氮物質(zhì)[1]。

    谷胱甘肽(glutathione,GSH)一直因為其獨特和重要的生理功能為國內(nèi)外學者所研究,如參與氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運、維持細胞正常生長、抗氧化作用[2-3]等,目前對于植物和血漿中的GSH含量的測定已經(jīng)作出過很多研究[4-5],但是關(guān)于貝類肌肉中GSH含量的測定方法研究較少。

    游離氨基酸(free amino acids,F(xiàn)AA)是非蛋白氮的重要組成部分,它們對水產(chǎn)食品新鮮度的評價和風味的貢獻有非常重要作用,如丙氨酸、谷氨酸以及甘氨酸都會影響其風味以及口感。丙氨酸和谷氨酸具有甜味,谷氨酸尤其在甲殼類動物肌肉中起重要的鮮味作用[6]。此外,F(xiàn)AA還可作為許多魚類以及甲殼類動物品質(zhì)評價的重要鮮度潛在指標[7-8]。章超樺等[9]在研究翡翠貽貝肉的食品化學特性時認為呈味FAA對甜味、甘味有重要貢獻;楊文鴿等[10]通過對縊蟶冰藏?;钇陂g呈味物質(zhì)的變化研究發(fā)現(xiàn)FAA對縊蟶鮮味風味起到重要作用,精氨酸能夠賦予海鮮一個適宜的整體風味[11]。關(guān)于植物中游離氨基酸含量的測定方法為大多國內(nèi)外學者所青睞[12-16],但是關(guān)于貝類肌肉中的游離氨基酸卻沒有一種簡便快捷的測定方法。

    目前國內(nèi)外相關(guān)測定GSH和FAA的方法有很多,主要有高效液相色譜法[17-21]、比色法[22-26]、毛細管電泳法[27]、氨基酸自動分析(amino acid analyzer,AAA)法[28-31]等。AAA法是最常用的一種分析方法,它是以陽離子交換樹脂為固定相,酸性緩沖液為流動相,在柱后采用茚三酮溶液與氨基酸衍生生成具有可見光吸收的衍生物進行檢測,具有重復性好、儀器穩(wěn)定、結(jié)果可靠等優(yōu)點?,F(xiàn)有的方法主要表現(xiàn)在對GSH或FAA含量的單獨測定,并且貝類中GSH或FAA的測定方法相關(guān)的研究較少,針對貝類肌肉中GSH和FAA的測定鮮見一種快速、有效的方法。

    本實驗將通過調(diào)節(jié)緩沖液pH值以及優(yōu)化洗脫程序,建立一種測定貝類肌肉中GSH和FAA的AAA法,同時對該方法進行方法學驗證,確定該方法的準確性和穩(wěn)定性,為建立貝類資源的開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    文蛤、青蛤、縊蟶、牡蠣 上海臨港蘆潮港水產(chǎn)市場;運回實驗室立即處理,并于4 ℃條件下保存。

    GSH標準品、多種氨基酸混合標準溶液 美國Sigma公司;二水合5-磺基水楊酸(分析純),檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉(均為色譜純),檸檬酸、乙醇、鹽酸(均為優(yōu)級純) 國藥集團化學試劑有限公司。

    1.2 儀器與設備

    L-8800氨基酸全自動分析儀 日本日立公司;FJ-200高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠;501XL全自動研磨機 普瑞科學儀器公司;BSA124S電子天平 大連格萊瑞機械有限責任公司;TopPette手動固定移液器、PH-240A干燥培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表有限公司;FRQ-1010HT超聲波清洗器 杭州法蘭特超聲波科技有限公司;GL-26M/MI立式高速冷凍離心機 上海趙迪生物科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 混合標液的配制

    準確稱量76.83 mg GSH標準品,用超純水定容至100 mL容量瓶中,即得2.5 μmol/mL標準溶液,從中準確取出2 mL混合溶液,加入2 mL含有多種標準氨基酸組分(2.5 μmol/mL)的混合液,用超純水定容至50 mL,即為0.10 μmol/mL混合標準溶液,保存至4 ℃冰箱。

    1.3.2 樣品前處理

    樣品處理方法采用Tanimoto等[32]測定牡蠣在冷藏過程中FAA的變化為基礎(chǔ),稍加修改。

    準確稱量1 g貝類肉組織,加入15 mL 0.02 mol/L稀鹽酸,充分均質(zhì)后用超聲波清洗5 min,然后用冷凍離心機(5 000 r/min,4 ℃)離心10 min,收取上清液。將剩余殘渣加入10 mL 0.02 mol/L稀鹽酸后攪拌,再次離心(5 000 r/min,4 ℃)5 min,合并上清液,定容至50 mL。定容后移取2 mL,加入2 mL體積分數(shù)5%磺基水楊酸溶液,再次離心(10 000 r/min,4 ℃)10 min,然后經(jīng)0.22 μm水相過濾膜過濾,上機測定。3 組平行實驗,測定結(jié)果取平均值。

    1.3.3 緩沖溶液的配制

    緩沖溶液的配制及茚三酮反應液的組成如表1、2所示。

    表1 緩沖液的配制Table1 Preparation of buffer solution

    表2 茚三酮反應液的組成Table2 Composition of reaction systems containing ninhydrin

    1.3.4 洗脫程序及升溫過程優(yōu)化

    采用氨基酸全自動分析儀的梯度洗脫程序在原有基礎(chǔ)上修改,如表3所示。

    表3 氨基酸分析儀的梯度洗脫以及升溫程序優(yōu)化Table3 Gradient elution of amino acid analyzer and optimization of heating process

    1.3.5 氨基酸自動分析儀參數(shù)條件

    分離柱(4.6 mm×60 mm),樹脂為陽離子交換樹脂;分離柱溫度57 ℃;檢測波長570 nm(脯氨酸為440 nm);進樣量20 μL;緩沖液流速0.35 mL/min;反應液:茚三酮試劑,流速0.35 mL/min;單元溫度135 ℃;使用自帶軟件進行數(shù)據(jù)分析。

    1.3.6 回收率和精密度測定

    各取1 g文蛤肌肉組織,樣品中添加高、中、低3 種不同濃度的混合標準溶液,按1.3.2節(jié)方法進行樣品處理,按照1.3.5節(jié)方法進行參數(shù)設定并上機檢測,每種濃度進樣5 次,用外標法計算其實際含量與加標平均回收率。

    對同一樣本溶液在1 d內(nèi)進行5 次重復實驗分析日內(nèi)變化,對同一樣本連續(xù)測定5 d(每天測定1 次)的變化,分別確定日內(nèi)與日間精密度?;厥章拾聪率接嬎悖?/p>

    2 結(jié)果與分析

    2.1 混合標準溶液與樣品圖譜

    L-8800全自動氨基酸分析儀的基本原理是以不同pH值梯度的緩沖溶液來洗脫出(酸性、中性、堿性)FAA,與茚三酮反應液會發(fā)生顯色反應,從而對FAA進行定性與定量分析[33]。由于GSH中的氨基在弱酸性溶液中與茚三酮反應生成藍紫色化合物,于波長570 nm處有最大吸收峰,因此也可以對此進行定性和定量分析。

    圖1 標準混合溶液和4 種貝類肌肉樣品圖譜Fig.1 Amino acid profiles of mixed standard solution and muscle samples from four shellfish species

    由圖1可以看出,標準混合溶液和4 種貝類肌肉的樣品圖譜在經(jīng)過優(yōu)化后,GSH與FAA達到了較好的分離效果,其中圖1C、D、E中GSH處有其他物質(zhì)干擾,可能為青蛤、縊蟶、牡蠣肌肉中的其他FAA或者活性肽,有待進一步的分析與研究。

    2.2 方法性能評價

    通過線性范圍、檢出限、精密度以及回收率等指標來評價該方法性能[34-35]。

    2.2.1 線性范圍、檢出限測定結(jié)果

    將標準混合溶液用0.02 mol/L鹽酸溶液進行適當稀釋,使其質(zhì)量濃度分別為1、10、50、100、250 μg/mL,按1.3.5節(jié)方法進行測定,每個質(zhì)量濃度的標準混合溶液分別進樣3 次,通過保留時間作為定性的依據(jù),以所測色譜的峰面積和其相對應的質(zhì)量濃度作出標準曲線,用線性相關(guān)系數(shù)(R2)評價[18];根據(jù)信噪比,當所測物質(zhì)色譜峰的峰高為噪音3 倍時(RSN=3),確定其混合標準組分的檢出限,當色譜峰的峰高為噪音10 倍時(RSN=10),確定其混合標準組分定量限[36]。

    如表4所示,在1~250 μg/mL范圍內(nèi),GSH和FAA的線性相關(guān)系數(shù)R2在0.999 1~0.999 9之間,表明優(yōu)化過后的全自動氨基酸分析儀法中色譜峰的面積與質(zhì)量濃度之間有著比較好的線性關(guān)系,混合標準溶液中的各組分的定量限在0.21~0.94 μmol/L之間,檢出限在0.07~0.27 μmol/L之間。表明優(yōu)化過后的全自動氨基酸分析儀法對于測定貝類肌肉中的GSH與FAA有著較好的靈敏度。

    表4 GSH與多種氨基酸標準混合溶液線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table4 Linear correlation coeff i cients, detection limits and quantitation limits of mixed standard solution of glutathione and amino acids

    2.2.2 回收率和精密度測定結(jié)果

    表5 GSH與氨基酸混合標準溶液加標回收率和精確度(n=5)Table5 Recovery and precision of mixed standard solution of glutathione and amino acids (n= 5)

    通過加標實驗以及加標回收率的計算,由表5可知,混合標準溶液各組分加標平均回收率在86.40%~102.42%之間,日內(nèi)相對標準偏差在0.31%~0.73%之間,日間相對標準偏差在1.14%~2.60%之間,符合實驗室質(zhì)量控制規(guī)范中食品理化檢測[37]的相關(guān)要求。

    2.2.3 GSH、氨基酸含量測定與分析

    貝類之所以食用起來口感獨特,味道鮮美以及營養(yǎng)豐富,這其中與GSH以及FAA的含量有著很大的關(guān)系。GSH由于其具有獨特的生理活性具有抗氧化、抗菌、降血壓等生理功能[3],F(xiàn)AA則是水產(chǎn)品新鮮度和風味的重要評價指標,也是非蛋白氮的重要組成部分;不同的FAA具有不同的滋味,呈現(xiàn)鮮、甜、酸、苦等多種滋味,會直接反應出水產(chǎn)品食物的味道以及鮮美程度。如甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)主要呈味特性為甜味,為食物本身提供清香的甜味,Glu主要呈味特性為鮮味,是FAA中最重要的鮮味劑,具有保護肝臟的功能,有著非常高的營養(yǎng)價值以及生理功能[38]。

    表6 4 種貝類肌肉中GSH與FAA的組成及含量(n=3)Table6 Contents of glutathione and free amino acids in four species of shellfish (n=3)

    取每種貝類肌肉組織各1 g平行做3 個樣品,按照1.3.2節(jié)進行樣品的處理,并按照參數(shù)條件進行檢測,對檢測數(shù)據(jù)進行SPSS分析,并得出顯著性,如表6所示。4 種貝類肌肉組織中FAA和GSH非常豐富,總FAA含量方面,文蛤含量最高,為1 396.39 mg/100 g,牡蠣為287.01 mg/100 g??侳AA含量為文蛤>青蛤>縊蟶>牡蠣,這與劉云等[39]對煙臺近海3 種貝類中FAA的測定結(jié)果略有不同,可能是由于貝類在不同地域以及不同生長環(huán)境的原因?qū)е麦w內(nèi)FAA的含量以及比例存在差異;呈味氨基酸占總FAA的比重較大,其中牡蠣肌肉中呈味氨基酸的含量為143.55 mg/100 g,占總FAA的50.02%,達到一半的比例;青蛤中呈味氨基酸比例最低,為32.91%;呈味氨基酸含量為文蛤>縊蟶>青蛤>牡蠣;貝類肌肉中含有人體必需的大部分氨基酸,縊蟶肌肉中必需氨基酸含量為103.49 mg/100 g,占總FAA的11.36%,牡蠣雖然含量稍低,為54.19 mg/100 g,但比例為18.88%;必需氨基酸含量為縊蟶>青蛤>牡蠣>文蛤,文蛤最低,只有48.15 mg/100 g,占比3.45%。

    FAA組成方面,文蛤肌肉組織中主要的FAA為Tau、Glu、Ala、Arg,占FAA含量的比例分別為37.26%、10.55%、32.54%、7.12%,這4 種氨基酸的比例達到了87.47%,這與Konosu等[40]對蛤中FAA的組成成分分析結(jié)果相同;青蛤肌肉中主要的FAA為Tau(42.58%)、Glu(11.00%)、Ala(15.12%)、Arg(9.48%);縊蟶肌肉中主要的FAA為Tau(22.70%)、Glu(5.99%)、Ala(30.47%)、Arg(16.74%),這與楊文鴿等[10]冰藏期間對縊蟶中FAA含量及比例差別不大;牡蠣肌肉中主要的FAA為Tau(18.89%)、Glu(10.95%)、Gly(19.00%)、Ala(16.94%)、Arg(4.08%),這與Je等[41]測定牡蠣中主要的FAA結(jié)果相同;通過對比可以發(fā)現(xiàn),貝類肌肉中主要的FAA為Tau、Glu、Ala、Arg,占FAA總量中很大的比例,這與Chen Dewei等[42]對北部灣雙殼類軟體動物中FAA的組成測定的結(jié)果相同。

    貝類肌肉組織中含有豐富的GSH,和其他水產(chǎn)生物相比含量較高,和陸地生物血液中的含量相當,遠高于植物中的GSH[43]。文蛤、青蛤、縊蟶、牡蠣的含量分別為82.53、103.20、61.77、33.37 mg/100 g;通過比較得知,青蛤中GSH的含量最高,含量從高到底依次為青蛤>文蛤>縊蟶>牡蠣,這與張靜等[25]利用熒光分光光度法測定海洋生物中的GSH中含量略有差異,可能由于部分FAA沒有檢測出,與GSH的特征峰重疊。由于GSH的獨特的生理活性和功能,通過GSH含量的分析也反應了貝類具有非常高的營養(yǎng)價值。

    2.2.4 氨基酸呈味效果及味道強度值分析

    味道強度值(taste activity value,TAV)通常是指各種呈味物質(zhì)在樣品中的含量與其相對應的呈味閾值的比值。一般情況下,當TAV大于1時,認為該呈味物質(zhì)對樣品的呈味效果有比較重要的貢獻[44]。相反的,如果TAV小于1,可以判定該呈味物質(zhì)呈味效果不顯著,貢獻不大。

    表7 常見貝類主要FAA呈味特征、呈味閾值及TAV分析[42]Table7 Taste characteristics, taste threshold and TAV analysis of the main free amino acids in the common shellf i shes

    如表7所示,對文蛤肌肉呈味貢獻最大的是Ala,TAV為7.57,其次是Glu、Arg,TAV分別為4.91、1.99,呈味效果顯著;對青蛤、縊蟶呈味貢獻較大的為Glu、Ala、Arg,其中青蛤TAV分別為3.73、2.56、1.93,縊蟶TAV分別為1.82、4.63、3.05;對牡蠣肌肉呈味貢獻比較大的只有Glu,其TAV為1.05,這與楊文鴿等[10]測定結(jié)果相似;通過比較可以發(fā)現(xiàn),對貝類呈味貢獻較大的為鮮味和甜味氨基酸,這也是貝類具有非常強烈的鮮味以及口感甘甜的重要原因。

    3 討 論

    本實驗以4 種常見貝類為研究對象,采用0.02 mol/L鹽酸溶液作為提取劑,以體積分數(shù)5%磺基水楊酸溶液為蛋白沉淀劑,同時優(yōu)化了緩沖溶液的組成及洗脫程序,采用L-8800全自動氨基酸分析儀測定,可以實現(xiàn)較好的分離效果,并對貝類肌肉組織中的GSH與FAA進行了準確定量。經(jīng)過方法學的驗證,該方法具有良好的線性關(guān)系、檢出限、精密度以及回收率,此方法適用于貝類肌肉組織中GSH與多種FAA的測定。

    4 種常見貝類肌肉中FAA含量比較豐富,文蛤含量最高,為1 396.39 mg/100 g,牡蠣為287.01 mg/100 g??侳AA含量為文蛤>青蛤>縊蟶>牡蠣,呈味氨基酸含量為文蛤>縊蟶>青蛤>牡蠣,必需氨基酸含量為縊蟶>青蛤>牡蠣>文蛤;貝類肌肉中主要的FAA為Tau、Glu、Ala、Arg;此外,GSH的含量從高到底依次為青蛤>文蛤>縊蟶>牡蠣,對4 種貝類呈味貢獻較大的鮮味和甜味氨基酸,主要包括Glu、Ala、Arg,這也是貝類具有非常強烈的鮮味以及口感甘甜的重要原因。

    由于GSH水溶液在常溫條件下容易氧化[45],在樣品處理過程中如何防止GSH被氧化,使用何種濃度以及種類的抗氧化劑來保證GSH水溶液不被氧化且不會影響FAA的含量,有待進一步深入研究。此外,本研究只測定出18 種FAA與GSH的含量,還有部分FAA和活性肽沒有檢測出或者特征峰沒有分離出來,還有待進一步的研究、分離以及優(yōu)化。

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    Determination of Glutathione and Free Amino Acids in Muscles of Four Shellf i sh Species by Automatic Amino Acid Analyzer

    ZHANG Suping, QIU Weiqiang, LU Qi, CHEN Shunsheng*
    (Shanghai Aquatic and Storage Engineering Technology Research, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

    An analytical method was established for the simultaneous determination of glutathione and free amino acids in shellf i sh using a fully automatic amino acid analyzer. The extraction of the analytes was carried out using 0.02 mol/L hydrochloric acid solution as the extraction solvent followed by protein precipitation with 5% sulfonic acid solution. The buffer composition and the elution procedure were optimized at the same time. The linear range, limit of detection (LOD), precision and recovery rate of the method were determined. The results showed that good separation of glutathione and free amino acids in shellf i sh was achieved by this method with a good linear relationship. The correlation coeff i cients of the calibration curves were between 0.999 1 and 0.999 9. The minimum LODs at a signal to noise ratio (RSN) of 3 ranged from 0.07 to 0.27 μmol/L. The average recovery rates of spiked samples were between 86.40% and 102.42%. The relative standard deviations (RSDs) of intra-day and inter-day assays were 0.31%–0.73% and 1.14%–2.60%, respectively. Free amino acids were abundant in muscle tissue of four shellf i sh species, and their total free amino acid contents in decreasing order were clam (1 396.39 mg/100 g) > Cyclina sinensis (1 016.04 mg/100 g) > razor clam (911.15 mg/100 g) > oyster (287.01 mg/100 g). The main free amino acids were taurine, glutamic acid, alanine, and arginine. The glutathione contents of Cyclina sinensis, clam, razor clam and oyster were 103.20, 82.53, 61.77, and 33.37 mg/100 g, respectively. This method is suitable for the determination of glutathione and free amino acids in shellf i sh.

    shellf i sh muscle; glutathione; free amino acids; automatic amino acid analyzer

    10.7506/spkx1002-6630-201704027

    TS254

    A

    1002-6630(2017)04-0170-07

    2016-06-29

    國家自然科學基金面上項目(31471685);上海海洋大學??萍及l(fā)展專項(A2-0203-00-100208);上海海洋大學校博士啟動基金項目(A2-0203-00-100340)

    張?zhí)K平(1989—),男,碩士研究生,研究方向為水產(chǎn)品加工和貯藏。E-mail:626038339@qq.com

    *通信作者:陳舜勝(1956—),男,教授,本科,研究方向為水產(chǎn)品加工、食品理化分析和食品感官評定。E-mail:sschen@shou.edu.cn

    張?zhí)K平, 邱偉強, 盧祺, 等. 全自動氨基酸分析儀法測定4 種貝類肌肉中谷胱甘肽和游離氨基酸含量[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 170-176. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704027. http://www.spkx.net.cn

    ZHANG Suping, QIU Weiqiang, LU Qi, et al. Determination of glutathione and free amino acids in muscles of four shellf i sh species by automatic amino acid analyzer[J]. Food Science, 2017, 38(4): 170-176. (in Chinese with English abstract)

    DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704027. http://www.spkx.net.cn

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