• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單增李斯特菌srtA基因敲除菌株的構建及其生物學特性

    2017-03-27 06:50:36熱依漢古麗麥麥提力
    食品科學 2017年4期
    關鍵詞:菌膜單增李斯特

    李 森,熱依漢古麗·麥麥提力

    (上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院,上海 200093)

    單增李斯特菌srtA基因敲除菌株的構建及其生物學特性

    李 森,熱依漢古麗·麥麥提力

    (上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院,上海 200093)

    單核細胞增生性李斯特菌是常見的食源性致病菌,其細胞壁上存在的表面蛋白與其致病性和細菌菌膜的形成密切相關,而srtA基因是介導表面蛋白膜表面定位的關鍵因子,通過識別特定的蛋白序列將表面蛋白共價結合在細胞壁上,也是單增李斯特菌的重要毒力基因。為深入研究srtA的功能及其對細菌毒力的調控,本研究通過同源重組技術敲除了單增李斯特菌中的srtA基因,并對基因敲除菌株的生物學特性進行了初步研究。通過生長曲線的測定,發(fā)現(xiàn)srtA基因敲除株的生長活性低于野生型菌株。進一步利用該菌株對星形膠質細胞系U251的侵襲實驗發(fā)現(xiàn),srtA基因敲除菌株的侵襲效率低于野生菌株,提示srtA基因在調控單增李斯特菌的侵襲能力方面發(fā)揮重要作用。本研究可為單增李斯特菌毒力基因調控和細菌菌膜的研究提供理論依據(jù)。

    單增李斯特菌;srtA基因;同源重組;生長曲線;侵襲

    單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)簡稱單增李斯特菌,是一種常見的人畜共患菌,由于其在環(huán)境中廣泛存在,也是食品行業(yè)中的常見污染菌[1]。單增李斯特菌易生成菌膜造成該菌難被清除。同時該菌具有較強的致病性,可以穿透人體的三大屏障——腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障,造成人體感染,嚴重可導致敗血癥、腦膜炎、流產、死胎等,對人體健康的危害極大[2-3]。根據(jù)臨床統(tǒng)計,由該菌感染造成的死亡率高達30%~50%,因此被世界衛(wèi)生組織定義為四大食源性致病菌之一[4-5]。對該菌致病機理的研究將有助于預防和治療該菌引起的食源性疾病。目前已有許多研究表明細菌自身表達的一些表面蛋白在菌膜形成、細菌毒力的調控和對宿主細胞的侵襲方面發(fā)揮重要作用。例如表面蛋白InlA和InlB是參與細菌黏附和侵襲宿主細胞的重要因子[6-7],而介導這些表面蛋白膜定位的是sortase家族的蛋白。

    Sortase A(SrtA)是分選酶sortase家族的成員之一,最早由Mazmanian等[8]于1999年在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)。sortase是一組介導表面蛋白革蘭氏陽性細菌細胞壁共價結合的蛋白酶。根據(jù)識別序列的不同,sortase分為SrtA、SrtB、Srt C和SrtD 4 種[9]。SrtA識別含有LPXTG序列的表面蛋白,通過將蛋白C-末端的LPXTG進行水解后,利用轉肽作用將表面蛋白錨定在細胞壁的表面[10]。研究發(fā)現(xiàn),SrtA參與內化素InlA蛋白的膜定位過程[11]。InlA是參與細菌侵襲過程的重要因子,在單增李斯特菌侵襲內皮細胞、肝細胞等過程中起到關鍵性作用[12]。由此可以推測,srtA基因可能對細菌的侵襲起到一定的調控作用。為了更好的研究srtA基因的功能,本研究利用同源重組的方法構建了srtA基因敲除菌株,并對敲除株的生物學特性進行了初步研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株、質粒和細胞

    單增李斯特菌株EGDe為上海理工大學系統(tǒng)生物醫(yī)學實驗室保存,大腸桿菌感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。pKSV7質粒由上海交通大學史賢明教授惠贈。pMD-19T載體購自大連寶生物公司。U251細胞系購自上海細胞庫。

    腦心浸出液(brain heat infusion,BHI)肉湯 北京陸橋技術股份有限公司;杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modif i ed Eagle’s medium,DMEM) 美國Gibco公司;胎牛血清 上海博升生物科技有限公司;rTaq DNA聚合酶和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑、限制性內切酶(BamHⅠ、KpnⅠ和SalⅠ)、DNA Marker、T4連接酶 大連寶生物公司;質粒抽提試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;氨芐青霉素、氯霉素及其他常規(guī)試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

    1.1.2 引物

    本實驗中用到的引物均參照GenBank中公布的序列(ID:986837)設計,具體引物序列如表1所示。

    表1 引物序列信息Table1 Primer sequences

    1.2 儀器與設備

    離心機 德國Eppendorf公司;電穿孔儀 美國Bio-Rad公司;細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司。

    1.3 方法

    1.3.1 目的基因片段的制備

    將EGDe接種于BHI培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜后收集菌體抽提細菌基因組。分別利用srtA 5’和srtA 3’引物擴增srtA的上下游同源臂。將PCR片段回收后利用BamHⅠ對片段進行單酶切。將單酶切產物分別回收后用T4 DNA連接酶連接,并進一步連接pMD-19T載體轉入大腸桿菌感受態(tài)進行菌落PCR鑒定。將陽性克隆送華大基因公司測序。

    1.3.2 穿梭載體pKSV7-Δ srtA的構建

    將1.3.1節(jié)中測序正確的陽性菌株中的質粒進行抽提作為PCR模板,利用srtA 5’F和srtA 3’R引物進行擴增。將DNA片段回收后進行KpnⅠ和SalⅠ的雙酶切,同時將穿梭載體pKSV7進行相同的雙酶切反應。分別回收酶切產物后,利用T4連接酶將srtA片段連入pKSV7載體并轉化到大腸桿菌中進行菌落PCR的鑒定及質粒的酶切鑒定,將陽性克隆送華大基因公司測序。

    1.3.3 目的基因片段與野生型菌株基因組的同源重組

    將1.3.2節(jié)中測序正確的質粒抽提后通過電穿孔的方法轉入單增李斯特菌感受態(tài)細胞,并涂布氯霉素抗性(10 μg/mL)BHI板進行克隆的篩選。將含有穿梭載體的單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基,在溫度(41 ℃)和氯霉素抗性(10 μg/mL)的雙重壓力下進行同源重組。每12 h傳代一次,共傳8 代后將末代培養(yǎng)產物進行氯霉素抗性(10 μg/mL)板劃線培養(yǎng)。挑取單克隆接種于新鮮BHI培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)以丟失抗性質粒,每12 h傳代一次,6 代后將末次培養(yǎng)物進行劃線培養(yǎng)。

    1.3.4 srtA敲除菌株的鑒定

    挑取1.3.3中平板上的單菌落進行雙引物PCR鑒定,將srtA 5’F和srtA 3’R單一擴增片段為1 400 bp,同時srtA koF和srtA koR無擴增片段的菌落視為陽性克隆。將鑒定出的陽性克隆進一步利用無抗性板和氯霉素抗性(10 μg/mL)板劃線培養(yǎng),最終得到無抗性板上生長、抗性板上不生長且PCR鑒定正確的為srtA敲除菌株。

    1.3.5 細菌生長曲線的測定

    將野生型和ΔsrtA菌株平板劃線培養(yǎng),分別挑取單克隆接種于BHI培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~14 h后,取部分菌液用新鮮培養(yǎng)基按100 倍稀釋,至OD600nm為0.14左右。置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng),每2 h測定OD600nm,記錄細菌生長情況。

    1.3.6 細胞侵襲實驗

    將U251細胞按2×105個/孔接種到12 孔培養(yǎng)板中,過夜培養(yǎng),并于侵襲實驗開始前1 h換不含血清的DMEM培養(yǎng)。將EGDe和ΔsrtA菌株于BHI培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜,測定OD600nm,并利用新鮮BHI培養(yǎng)基將細菌的OD600nm調至0.3。將細菌按感染復數(shù)值100∶1的比例加入到培養(yǎng)的細胞中,置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)1.5 h。小心移除細胞培養(yǎng)液后加入D-Hanks稀釋的慶大霉素(500 μg/mL)培養(yǎng)1 h,殺死細胞外的細菌。D-Hanks洗滌細胞3 次后加入1% TritonX-100裂解細胞。收集細胞裂解液稀釋10 000倍后涂BHI平板培養(yǎng)。統(tǒng)計平板上生長的克隆數(shù),計算細菌菌體濃度(以lg(CFU/mL)表示),比較不同細菌的侵襲效率。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    文中折線圖和柱形圖利用GraphPad軟件繪制。srtA敲除菌株和野生型菌株的生長曲線數(shù)據(jù)分析采用雙因素方差分析(two-way analysis of variance,two-way ANOVA),srtA敲除菌株和野生型菌株的侵襲效率數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用two-way ANOVA。

    2 結果與分析

    2.1 目的基因片段的克隆

    圖1 srtA基因敲除菌株構建策略Fig.1 Construction strategy of srtA knockout strains

    根據(jù)GenBank上公布的序列,設計srtA的敲除策略(圖1),設計引物分別擴增上游同源臂srtA 5’和下游同源臂srtA 3’的PCR產物分別為844 bp和600 bp(圖2A),BamHⅠ單酶切并連接到pMD-19T載體后轉化入大腸桿菌涂平板培養(yǎng),挑取平板上長出的4 個克隆,經(jīng)菌落PCR鑒定,在1 400 bp處擴增出陽性片段(圖2B),符合預期。

    圖2 srtA上(A)、下(B)游片段的克隆Fig.2 Cloning of srtA up-stream and down-stream sequences

    2.2 敲除載體的構建

    圖3 pKSV7-ΔsrtA載體的酶切鑒定Fig.3 Verif i cation of pKSV7-Δ srtA by double enzyme digestion

    將pMD-19T-Δ srtA載體送公司測序后將測序正確的克隆作為模板,利用5’F和3’R引物進行PCR,將得到的陽性片段進行雙酶切后與穿梭載體pKSV7進行連接得到pKSV7-ΔsrtA。利用PCR及雙酶切對平板上的克隆進行鑒定。經(jīng)過雙酶切鑒定可以發(fā)現(xiàn),挑取的6 個克隆均為陽性克隆,即酶切可以得到約1 400 bp左右的片段(圖3)。

    2.3 重組同源菌的篩選

    圖4 srtA基因敲除菌株的菌落PCR鑒定結果Fig.4 Identif i cation of srtA knockout strains by colony PCR

    將得到的pKSV7-ΔsrtA載體通過電穿孔的方式轉入單增李斯特菌后,利用氯霉素抗性和溫度進行篩選,將經(jīng)過多次傳代后得到的克隆進行PCR雙引物鑒定。根據(jù)構建的策略,如果用5’F和3’R引物進行擴增,野生型菌株得到2 200 bp左右的片段,而敲除菌株得到約1 400 bp大小的片段,雜合子菌株的同時具有1 400 bp和2 200 bp兩種片段,同時利用srtA ko引物進行擴增,野生型和雜合子菌株得到400 bp片段,敲除菌株則應無片段擴增。挑取的16 個克隆當中只有9號和12號克隆符合上述條件,為疑似陽性克?。▓D4),利用氯霉素抗性對這兩個克隆進行進一步鑒定,得到抗性板上無菌落生長的為陽性克隆,經(jīng)鑒定9號和12號克隆均為陽性克隆。

    2.4 敲除菌株生長曲線

    圖 5srtA敲除菌株與野生型菌株的生長曲線Fig.5 Growth curves of srtA knockout strain and wild-type strain

    將野生型EGDe菌株和ΔsrtA菌株培養(yǎng)后,分別檢測兩者的生長曲線,結果顯示從培養(yǎng)4 h開始,敲除菌株的生長速率低于野生型菌株,過夜培養(yǎng)后OD600nm的差別更加明顯。兩種菌株均在12 h左右OD600nm達到最高,然后進入衰亡期,增殖減慢,菌體大量死亡,OD600nm逐漸下降。當培養(yǎng)液中大部分菌體死亡后,細菌增殖能力開始提高,此時OD600nm又開始回升。因此培養(yǎng)24 h OD600nm降至最低點后又有所升高(圖5),此時srtA敲除菌株的OD600nm還是低于野生型菌株。本結果顯示srtA的敲除對細菌本身的生長活力造成一定影響。

    2.5 srtA敲除對單增李斯特菌侵襲的影響

    作為分選酶家族成員,SrtA被證實與單增李斯特菌的內化素的膜定位相關,而內化素是細菌侵襲的關鍵因子。為了驗證srtA敲除對細菌毒力的影響,本研究利用人膠質細胞瘤細胞系U251進行了細菌的侵襲實驗。利用慶大霉素將未侵襲的細菌殺死后,通過計算細胞內侵襲細菌的菌體濃度檢測細菌的侵襲效率。如圖6所示,EGDe和ΔsrtA的lg(CFU/mL)分別為5.4和4.7左右,即敲除菌株的菌體濃度明顯低于野生型菌株(圖6),說明ΔsrtA的侵襲效率低于EGDe,因此證明srtA的敲除影響了細菌的侵襲能力。

    圖6 srtA敲除菌株與野生型菌株EGDe的侵襲效率Fig.6 Invasion eff i ciencies of srtA knockout strain and wild-type strain

    3 結 論

    基因敲除是研究基因功能的重要生物學手段,而細菌自身結構簡單易于操作、染色體復雜程度較低等特點也為基因敲除菌株的構建提供了便利,因此被國內外學者廣泛用于基因功能的研究、減毒疫苗的研發(fā)等領域。本研究利用同源重組成功構建了srtA基因的基因敲除菌株并對其生物學特性做了初步分析。生長曲線的測定發(fā)現(xiàn)srtA基因的缺失使得細菌自身的生長增殖能力降低,說明srtA基因對細菌自身的生長能力有一定的調控作用。SrtA特異識別含有LPXTG序列的膜表面蛋白并將這類蛋白通過蛋白修飾定位到細胞壁上,srtA的缺失影響了這類蛋白的定位,導致細菌細胞壁成分的改變,從而會對細胞的生長增殖造成一定影響。但兩種菌種之間OD600nm的差異并不是非常大,也提示srtA基因并不是細菌生長增殖活動最關鍵的調控因素或者有其他sortase家族的成員部分代償了srtA的功能。

    單增李斯特菌是一種典型的胞內寄生菌,通過黏附、內化進入宿主細胞,并且在宿主細胞內存活、增殖,進而在細胞與細胞之間傳播擴散,造成感染。黏附是細菌侵襲宿主細胞的第一步,也是細菌定植致病的關鍵環(huán)節(jié)[13]。細菌表面的內化素是介導細菌黏附和內化的重要毒力因子,而內化素蛋白的膜表面定位則離不開分選酶的作用。經(jīng)研究證實內化素InlA、InlJ的膜定位過程均由SrtA所介導[14],與細菌侵襲哺乳動物細胞相關的另一個膜表面蛋白Vip的膜定位也受到SrtA調控。另外,細菌菌毛是細菌黏附宿主細胞的重要結構基礎。有研究證實一些革蘭氏陽性菌菌毛的形成需要SrtA的參與[15-16],含有LPXTG序列的菌毛亞基蛋白前體分子由SrtA定位到菌毛上。由此可見,SrtA在調控細菌致病性方面起著重要的調控作用。Chen Fuguang等[17]在金黃色葡萄球菌中敲除srtA基因后發(fā)現(xiàn),細菌對宿主細胞的黏附率降低,并且宿主細胞內炎癥因子的表達水平下降。本研究利用星形膠質細胞瘤細胞作為宿主細胞進行的侵襲實驗,發(fā)現(xiàn)ΔsrtA菌株侵襲U251細胞的侵襲效率明顯低于野生型菌株,證實srtA在調控單增李斯特菌侵襲神經(jīng)細胞中起到重要的調控作用。

    細菌菌膜是細菌對抗逆境的一種自我保護機制,一旦形成極難去除,極易造成食品生產線的污染,并且菌膜也是細菌耐藥性產生的重要因素,易造成病灶部位反復感染并發(fā)展為慢性炎癥[18]。菌膜是由一些細菌表面蛋白、胞外多糖等構成的生物膜結構,因此SrtA在調控細菌菌膜形成中也發(fā)揮重要作用。許多研究表明SrtA可以調控鏈球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的菌膜形成[19-21]。基于SrtA在調控細菌膜表面蛋白定位、細菌致病性、菌膜形成等過程中所起的重要作用,近年來SrtA被作為抑制細菌感染的重要靶標,許多學者期望通過研發(fā)針對SrtA的抑制劑藥物達到抑制和消除細菌感染的目的[22]。作為胞內寄生菌,單增李斯特菌能夠良好的誘發(fā)細胞免疫,是潛在的優(yōu)良疫苗載體[23]。本研究成功構建了srtA敲除突變菌株,并發(fā)現(xiàn)其毒力降低,能夠為重組活疫苗載體的研發(fā)提供一定理論與技術支持。

    [1] DREVETS D A, BRONZE M S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2008, 53(2): 151-165. DOI:10.1111/j.1574-695X.2008.00404.x.

    [2] DISSON O, LECUIT M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes[J]. Virulence, 2012, 3(2): 213-221. DOI:10.4161/viru.19586.

    [3] HERNANDEZ-MILIAN A, PAYERAS-CIFRE A. What is new in listeriosis?[J]. BioMed Research International, 2014, 2014: 358051. DOI:10.1155/2014/358051.

    [4] Centers for Disease Control and Prevention. Vital signs: Listeria illnesses, deaths, and outbreaks-United States, 2009-2011[J]. Annals of Emergency Medicine, 2013, 62(5): 536-537.

    [5] DURAND M L, CALDERWOOD S B, WEBER D J, et al. Acute bacterial meningitis in adults. a review of 493 episodes[J]. The New England Journal of Medicine, 1993, 328(1): 21-28. DOI:10.1056/ NEJM199301073280104.

    [6] COSSART P. Molecular and cellular basis of the infection by Listeria monocytogenes: an overview[J]. International Journal of Medical Microbiology, 2002, 291(6/7): 401-409. DOI:10.1078/1438-4221-00146.

    [7] GRüNDLER T, QUEDNAU N, STUMP C, et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the bloodcerebrospinal fluid barrier[J]. Microbes and Infection, 2013, 15(4): 291-301. DOI:10.1016/j.micinf.2012.12.005.

    [8] MAZMANIAN S K, LIU G, TON-THAT H, et al. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall[J]. Science, 1999, 285: 760-763. DOI:10.1126/science.285.5428.760.

    [9] 趙朋朋, 肖麗英, 李繼遙. 蛋白酶sortase的研究進展[J]. 國外醫(yī)學(口腔醫(yī)學分冊), 2006, 33(1): 18-25. DOI:10.3969/j.issn.1673-5749.2006.01.006.

    [10] SPIRIG T, WEINER E M, CLUBB R T. Sortase enzymes in grampositive bacteria[J]. Molecular Microbiology, 2011, 82(5): 1044-1059. DOI:10.1111/j.1365-2958.2011.07887.x.

    [11] GARANDEAU C, RéGLIER-POUPET H, DUBAIL I, et al. The sortase SrtA of Listeria monocytogenes is involved in processing of internalin and in virulence[J]. Infection and Immunity, 2002, 70(3): 1382-1390. DOI:10.1128/IAI.70.3.1382-1390.2002.

    [12] LINGNAU A, DOMANN E, HUDEL M, et al. Expression of the Listeria monocytogenes EGD inlA and inlB genes, whose products mediate bacterial entry into tissue culture cell lines, by PrfA-dependent and -independent mechanisms[J]. Infection and Immunity, 1995, 63(10): 3896-3903.

    [13] CARVALHO F, SOUSA S, CABANES D. How Listeria monocytogenes organizes its surface for virulence[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2014, 4: 48. DOI:10.3389/ fcimb.2014.00048.

    [14] SABET C, LECUIT M, CABANES D, et al. LPXTG protein InlJ, a newly identified internalin involved in Listeria monocytogenes virulence[J]. Infection and Immunity, 2005, 73(10): 6912-6922. DOI:10.1128/IAI.73.10.6912-6922.2005.

    [15] NECCHI F, NARDI-DEI V, BIAGINI M, et al. Sortase A substrate specif i city in GBS pilus 2a cell wall anchoring[J]. PLoS ONE, 2011, 6(10): e25300. DOI:10.1371/journal.pone.0025300.

    [16] KRISHNAN V. Pilins in gram-positive bacteria: a structural perspective[J]. IUBMB Life, 2015, 67(7): 533-543. DOI:10.1002/iub.1400.

    [17] CHEN Fuguang, LIU Bingrun, WANG Dacheng, et al. Role of sortase A in the pathogenesis of Staphylococcus aureus-induced mastitis in mice[J]. FEMS Microbiology Letters, 2014, 351(1): 95-103. DOI:10.1111/1574-6968.12354.

    [18] HOIBY N, BJARNSHOLT T, GIVSKOV M, et al. Antibiotic resistance of bacterial biofilms[J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2010, 35(4): 322-332. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011.

    [19] NOBBS A H, VAJNA R M, JOHNSON J R, et al. Consequences of a sortase A mutation in Streptococcus gordonii[J]. Microbiology, 2007, 153: 4088-4097. DOI:10.1099/mic.0.2007/007252-0.

    [20] SELVARAJ C, SIVAKAMAVALLI J, VASEEHARAN B, et al. Examine the characterization of biofilm formation and inhibition by targeting SrtA mechanism in Bacillus subtilis: a combined experimental and theoretical study[J]. Journal of Molecular Modeling, 2014, 20: 2364. DOI:10.1007/s00894-014-2364-8.

    [21] XIONG N, HU C, ZHANG Y, et al. Interaction of sortase A and lipase 2 in the inhibition of Staphylococcus aureus biofilm formation[J]. Archives of Microbiology, 2009, 191(12): 879-884. DOI:10.1007/ s00203-009-0520-9.

    [22] CASCIOFERRO S, RAFFA D, MAGGIO B, et al. Sortase A inhibitors: recent advances and future perspectives[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 58(23): 9108-9123. DOI:10.1021/acs.jmedchem.5b00779.

    [23] 周云, 潘蕾, 郝春秋, 等. 單增李斯特菌作為疫苗載體的研究進展[J].中國免疫學雜志, 2011, 27(12): 1132-1134. DOI:10.3969/j.issn.1000-484X.2011.12.19.

    Construction and Biological Properties of srtA Gene Knockout Mutant Strains of Listeria monocytogenes

    LI Sen, Zejhanguri·MAMATIRI
    (School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

    Listeria monocytogenes is a common foodborne pathogen. Cell wall-anchored surface proteins are closely related to the pathogenicity and biofilm formation of the bacterium. The srtA gene is a key factor that mediates the membrane anchoring of surface proteins, and as an important virulence gene of L. monocytogenes it can covalently bind surface proteins to the cell wall by recognizing specif i c peptide sequences. For a better understanding of the function of srtA and its role in bacterial virulence regulation, we knocked out the srtA gene in L. monocytogenes by homologous recombination in this study, and evaluated the biological properties of the mutant strain. Based on its growth curve examination, we found that the growth rate of the mutant strain was slower than that of the wild-type one. Furthermore, the invasion eff i ciency of the mutant strain in glioma U251 cells was lower than that of the wild-type one. These results indicate that srtA may play an important role in regulating the invasiveness of L. monocytogenes, which will provide a theoretical basis for further understanding of the regulatory mechanisms of virulence genes in L. monocytogenes and biof i lm formation.

    Listeria monocytogenes; srtA gene; homologous recombination; growth curve; invasion

    10.7506/spkx1002-6630-201704019

    TS201.3

    A

    1002-6630(2017)04-0113-05

    李森, 熱依漢古麗·麥麥提力. 單增李斯特菌srtA基因敲除菌株的構建及其生物學特性[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 113-117. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704019. http://www.spkx.net.cn

    LI Sen, Zejhanguri·MAMATIRI. Construction and biological properties of srtA gene knockout mutant strains of Listeria monocytogenes[J]. Food Science, 2017, 38(4): 113-117. (in Chinese with English abstract)

    10.7506/spkx1002-6630-201704019. http://www.spkx.net.cn

    2016-04-07

    上海理工大學博士啟動基金資助項目(1000308001);上海市高校青年教師資助計劃項目(10-15-308-802)

    李森(1982—),女,講師,博士,研究方向為食品安全與營養(yǎng)。E-mail:lisen_1027@126.com

    猜你喜歡
    菌膜單增李斯特
    冰箱囤貨要警惕這個“搗蛋分子”
    生命與災害(2022年8期)2022-11-10 05:14:26
    活性氧與蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的相關性
    冰箱里的“殺手”
    黨員文摘(2022年1期)2022-04-03 21:37:19
    食品環(huán)境中單核細胞增生李斯特菌菌膜形成、轉移及防控措施研究進展
    食品科學(2021年13期)2021-07-29 03:27:12
    我請鴿子來吃飯
    幼兒園(2019年7期)2019-09-05 17:49:18
    四種不同接觸表面蠟樣芽孢桿菌菌膜形成的影響
    基于PasteurMLST網(wǎng)站分析中國單增李斯特菌克隆復合體的多樣性
    保持肅靜
    小小說月刊(2013年6期)2013-05-14 14:55:19
    三重LAMP法檢測食品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌
    食品科學(2013年24期)2013-03-11 18:30:42
    活性氧調節(jié)單核細胞增生李斯特菌菌膜形成
    食品科學(2013年23期)2013-03-11 18:30:05
    久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲人成77777在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一边摸一边做爽爽视频免费| 嫁个100分男人电影在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 黄片大片在线免费观看| 午夜视频精品福利| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 国产一级毛片七仙女欲春2 | 精品欧美一区二区三区在线| 欧美在线一区亚洲| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产野战对白在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 两人在一起打扑克的视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产成人免费无遮挡视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 黄片大片在线免费观看| а√天堂www在线а√下载| 亚洲久久久国产精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| ponron亚洲| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| av片东京热男人的天堂| 久久久久国内视频| av有码第一页| 无限看片的www在线观看| 老司机福利观看| 可以在线观看的亚洲视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 天天添夜夜摸| 欧美日韩黄片免| 精品久久久久久久久久免费视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产在线观看jvid| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 香蕉国产在线看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 91九色精品人成在线观看| 欧美乱妇无乱码| 丰满的人妻完整版| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产成人啪精品午夜网站| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 最好的美女福利视频网| 一级毛片精品| 国产麻豆成人av免费视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 成年人黄色毛片网站| 一级,二级,三级黄色视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 成人欧美大片| 91国产中文字幕| 久久精品国产亚洲av高清一级| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91成人精品电影| 日韩免费av在线播放| 国产视频一区二区在线看| 国产免费男女视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产av一区在线观看免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| av网站免费在线观看视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲,欧美精品.| 丁香欧美五月| 一a级毛片在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 最好的美女福利视频网| 免费av毛片视频| 欧美午夜高清在线| 久久天堂一区二区三区四区| videosex国产| 88av欧美| 国产私拍福利视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本欧美视频一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 18禁观看日本| 一区二区三区激情视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 波多野结衣巨乳人妻| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲 国产 在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 69av精品久久久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 精品久久蜜臀av无| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久热在线av| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久精品国产清高在天天线| 一二三四社区在线视频社区8| 91精品三级在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品日韩av在线免费观看 | 久久热在线av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩高清综合在线| 90打野战视频偷拍视频| 男女之事视频高清在线观看| 在线永久观看黄色视频| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 国产一区二区在线av高清观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 韩国av一区二区三区四区| 多毛熟女@视频| 91老司机精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 一区二区三区精品91| 桃红色精品国产亚洲av| or卡值多少钱| 日韩高清综合在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产xxxxx性猛交| 色在线成人网| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品免费久久久久久久清纯| 夜夜爽天天搞| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产麻豆69| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产激情欧美一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日本欧美视频一区| 91精品三级在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产精品久久男人天堂| 手机成人av网站| 男人舔女人的私密视频| 国产免费av片在线观看野外av| 成人免费观看视频高清| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 三级毛片av免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲一码二码三码区别大吗| 制服丝袜大香蕉在线| videosex国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女大奶头视频| www.自偷自拍.com| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | √禁漫天堂资源中文www| 亚洲五月婷婷丁香| 大陆偷拍与自拍| 成人手机av| 中文字幕色久视频| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 不卡一级毛片| 午夜福利高清视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲av电影在线进入| a在线观看视频网站| 99久久精品国产亚洲精品| 热re99久久国产66热| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 男人操女人黄网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 乱人伦中国视频| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲五月天丁香| 久99久视频精品免费| 中文字幕最新亚洲高清| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲片人在线观看| av在线天堂中文字幕| 日本 欧美在线| 日本vs欧美在线观看视频| 日本在线视频免费播放| 久久青草综合色| 在线观看66精品国产| 丝袜在线中文字幕| 人人妻人人澡欧美一区二区 | e午夜精品久久久久久久| 多毛熟女@视频| 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩黄片免| avwww免费| 亚洲精品美女久久av网站| 人成视频在线观看免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲成a人片在线一区二区| 伦理电影免费视频| 看片在线看免费视频| 不卡一级毛片| 国产成人系列免费观看| 岛国视频午夜一区免费看| 国产高清有码在线观看视频 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 女人被狂操c到高潮| 99精品在免费线老司机午夜| 女人被狂操c到高潮| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产亚洲av高清不卡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲久久久国产精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久伊人香网站| 天天一区二区日本电影三级 | 国产成人欧美在线观看| 91大片在线观看| 黑人操中国人逼视频| 韩国精品一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91国产中文字幕| 国产精品 欧美亚洲| 免费观看精品视频网站| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产午夜精品久久久久久| 日韩高清综合在线| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲av五月六月丁香网| 久久久久久人人人人人| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲免费av在线视频| 黑人操中国人逼视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜两性在线视频| 十八禁网站免费在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲av成人一区二区三| 午夜两性在线视频| 啦啦啦免费观看视频1| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产三级在线视频| 国产成人精品在线电影| 男人的好看免费观看在线视频 | 精品国产一区二区三区四区第35| 69av精品久久久久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产一区在线观看成人免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 免费观看人在逋| 极品教师在线免费播放| 欧美乱妇无乱码| 欧美成人免费av一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 高清在线国产一区| 91大片在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄色片一级片一级黄色片| netflix在线观看网站| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 岛国在线观看网站| 丰满的人妻完整版| 日本 欧美在线| 午夜久久久在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 香蕉丝袜av| av天堂久久9| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久狼人影院| 日韩高清综合在线| 最新美女视频免费是黄的| 一级a爱视频在线免费观看| 国产不卡一卡二| 一夜夜www| 人妻久久中文字幕网| 欧美不卡视频在线免费观看 | 黄色片一级片一级黄色片| 一本大道久久a久久精品| 91字幕亚洲| 国产精品 国内视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲午夜理论影院| 午夜影院日韩av| 黑丝袜美女国产一区| 大香蕉久久成人网| 正在播放国产对白刺激| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级片免费观看大全| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产在线观看jvid| 中亚洲国语对白在线视频| 婷婷丁香在线五月| 999精品在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 国产区一区二久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲片人在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 热re99久久国产66热| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品日韩av在线免费观看 | 757午夜福利合集在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲熟女毛片儿| 黄色视频不卡| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产激情欧美一区二区| 国产精品影院久久| 亚洲熟妇熟女久久| 热99re8久久精品国产| 怎么达到女性高潮| 一区二区三区高清视频在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本 av在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲天堂国产精品一区在线| 99国产精品一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 国产高清有码在线观看视频 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av中文乱码字幕在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 在线观看舔阴道视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久草成人影院| 国产精品99久久99久久久不卡| 长腿黑丝高跟| 欧美中文日本在线观看视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 三级毛片av免费| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 美女免费视频网站| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久久国产欧美日韩av| 人成视频在线观看免费观看| 9色porny在线观看| 免费看a级黄色片| 国产成人精品无人区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲自拍偷在线| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲精品国产区一区二| 黑丝袜美女国产一区| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美日韩黄片免| 嫩草影院精品99| 最近最新中文字幕大全电影3 | 黄色毛片三级朝国网站| 搡老岳熟女国产| 亚洲精品久久国产高清桃花| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品九九99| 大码成人一级视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久午夜综合久久蜜桃| 韩国精品一区二区三区| 免费人成视频x8x8入口观看| 一级毛片女人18水好多| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产av精品麻豆| 人妻久久中文字幕网| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产一区二区激情短视频| 91麻豆av在线| 国产99白浆流出| 黄频高清免费视频| 久久久久久久久免费视频了| 午夜影院日韩av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久 成人 亚洲| 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看 | 免费在线观看完整版高清| 亚洲人成伊人成综合网2020| 岛国在线观看网站| 99热只有精品国产| svipshipincom国产片| 成人精品一区二区免费| 男女下面进入的视频免费午夜 | 日韩欧美三级三区| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av电影在线进入| 久久伊人香网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 制服诱惑二区| 一本大道久久a久久精品| 久久中文看片网| e午夜精品久久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品av久久久久免费| 91老司机精品| 99re在线观看精品视频| 麻豆国产av国片精品| 日韩国内少妇激情av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩欧美在线二视频| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产亚洲欧美精品永久| 18禁观看日本| 久久午夜亚洲精品久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美中文综合在线视频| 国产野战对白在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲最大成人中文| 美女高潮到喷水免费观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产又爽黄色视频| 国产麻豆69| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 色精品久久人妻99蜜桃| 色播在线永久视频| 国产91精品成人一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 午夜久久久久精精品| 国产xxxxx性猛交| 午夜老司机福利片| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久 成人 亚洲| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 中文亚洲av片在线观看爽| 18禁美女被吸乳视频| 91精品国产国语对白视频| 悠悠久久av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美乱码精品一区二区三区| 极品教师在线免费播放| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | xxx96com| 99热只有精品国产| 九色国产91popny在线| 久久精品国产清高在天天线| 午夜久久久久精精品| 亚洲激情在线av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品人妻在线不人妻| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一级a爱片免费观看的视频| 在线av久久热| 村上凉子中文字幕在线| 免费不卡黄色视频| 色在线成人网| 老司机午夜福利在线观看视频| 一级a爱片免费观看的视频| 久久草成人影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 99精品在免费线老司机午夜| 两个人视频免费观看高清| 激情视频va一区二区三区| 女人精品久久久久毛片| 99热只有精品国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 真人一进一出gif抽搐免费| 美女大奶头视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本免费a在线| 亚洲熟女毛片儿| 女人精品久久久久毛片| 99热只有精品国产| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲成av人片免费观看| 搡老岳熟女国产| 日韩大尺度精品在线看网址 | 成人特级黄色片久久久久久久| 免费不卡黄色视频| 免费在线观看完整版高清| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲成av人片免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 久久青草综合色| 99国产精品一区二区蜜桃av| 999久久久国产精品视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲无线在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜成年电影在线免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 久久这里只有精品19| 国产一卡二卡三卡精品| 成人永久免费在线观看视频| tocl精华| 自线自在国产av| 亚洲成国产人片在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| av天堂久久9| 天堂√8在线中文| 男男h啪啪无遮挡| 国产av精品麻豆| 不卡av一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品欧美国产一区二区三| 好男人电影高清在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 在线观看一区二区三区| 国产精品 欧美亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久国产亚洲av麻豆专区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品免费久久久久久久清纯| 岛国在线观看网站| 国产成人影院久久av| 欧美一区二区精品小视频在线| 热99re8久久精品国产| 亚洲国产精品999在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久中文看片网| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲激情在线av| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看日韩欧美| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲专区字幕在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品国产综合久久久| 一本久久中文字幕| 日本欧美视频一区| 一区二区三区国产精品乱码| 午夜免费激情av| 99re在线观看精品视频| 久久久久久久久中文| 青草久久国产| av欧美777| 国产熟女xx| 制服诱惑二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 亚洲人成电影观看| 国产xxxxx性猛交| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩欧美一区视频在线观看| netflix在线观看网站| 波多野结衣一区麻豆| 少妇被粗大的猛进出69影院| 搞女人的毛片| bbb黄色大片| 深夜精品福利| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 首页视频小说图片口味搜索|