氣血并治方有效組分對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷心肌保護(hù)作用的機(jī)制研究＊

于永慧，張 佩，劉劍剛，李 澎，張大武，王承龍

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病中心 北京 100091）

越來越多的研究表明，心肌能量代謝障礙是急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）后心力衰竭形成的重要原因之一[1]，優(yōu)化心肌能量代謝已成為治療缺血性心臟病的一個(gè)新靶點(diǎn)[2,3]。高能磷酸化合物尤其三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是心肌能量的直接提供者，可直接進(jìn)入細(xì)胞通過磷酸化反應(yīng)參與能量傳遞。正常心肌每天大約需要消耗30 kg的ATP[4]，從而維持膜電位水平和心肌細(xì)胞的舒縮功能。ATP儲(chǔ)備水平的高低不僅直接關(guān)系著細(xì)胞正常生理功能的維持，還與細(xì)胞生長及凋亡密切相關(guān)[5]。因此，增加高能磷酸化合物含量可以促進(jìn)心肌膜電位和舒縮功能的維持，防止細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

氣血并治方是由傳統(tǒng)活血化瘀名方--血府逐瘀湯化裁而來，是中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院治療治療心血管疾病的一種有效制劑。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明，氣血并治方全方提取物具有降低血脂、改善血液流變、保護(hù)內(nèi)皮功能以及減輕炎癥反應(yīng)等心血管保護(hù)作用[6-7]。但對(duì)于心肌能量代謝，尤其是缺氧/復(fù)氧（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）后心肌細(xì)胞高能磷酸化合物代謝的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜分 析 法（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）觀察氣血并治方對(duì)H/R心肌細(xì)胞高能磷酸化合物代謝的影響，酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay，Elisa）檢測(cè)心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞早期凋亡率，探索性觀察氣血并治方改善H/R心肌細(xì)胞能量代謝，從而防止細(xì)胞損傷和凋亡的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生1-2天的SD乳鼠，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量16-18 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK-（京）2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境為環(huán)境溫度0-25℃，濕度40-70%，動(dòng)物自由飲水和飲食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

氣血并治方（CWQB）由川芎、赤芍、桃仁、紅花、柴胡、枳殼按照3∶3∶3∶2∶2組成，全方水提取物組分由浙江大學(xué)藥學(xué)院提供，主要成分為芍藥苷、總黃酮、總酸類物質(zhì)，每克CWQB相當(dāng)于含生藥33.16 g[8]；鹽酸曲美他嗪，中國食品藥品檢定研究所提供，批號(hào)100889-201302。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號(hào)：25200056），脫氧核糖核酸酶（德國Roche，批號(hào)：104159），II型膠原酶（美國Sigma，批號(hào)：17101015），青霉素－鏈霉素雙抗（美國Gibco公司，批號(hào)15140-122），胎牛血清（美國Gibco公司，批號(hào)10099-144），高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)C11995500BT），無糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)11966025）。5′-ATP鈉鹽（美國Sigma公司，批號(hào)A2383）、5′-ADP鈉鹽（美國Sigma公司，批號(hào)01897）、5′-AMP鈉鹽（美國Sigma公司，批號(hào) A1752），5′-IMP鈉鹽（美國 Sigma公司，批號(hào)I4625）；cTnT試劑盒（批號(hào)10053），CK-MB試劑盒（批號(hào)50057），由北京華英生物技術(shù)研究所提供；AnnexinV-FITC/PI Kit凋亡試劑盒（美國Becton Dickinson公司，批號(hào)556547）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

AC2-4S1型超凈臺(tái)（新加坡Esco公司），KDC-140HR型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），Ultimate3000-API 3200Q TRAP型HPLCMS/MS（美國Thermo Fisher公司），STAT FAX 2100型全自動(dòng)酶免儀（美國AWARENESS公司），EPICSELITE型流式細(xì)胞儀（美國Bekman-Coulter公司）。

2 方法

2.1 原代心肌細(xì)胞的提取、培養(yǎng)

出生1-2天的SD大鼠乳鼠12只，雄性，脫臼處死，75%酒精浸泡，消毒皮膚，在無菌條件下剪開皮膚，開胸，切取心臟，放入含有普通肝素的冷（4℃）磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）中，擠除血液，去掉心房及主動(dòng)脈組織，用眼科剪將心臟組織剪碎成約1 mm3大小的組織粒，移入15 mL離心管中。PBS清洗數(shù)遍后棄去上清液，分別加入0.125%胰蛋白酶及0.5%（II型膠原酶＋DNA酶）的混合液在37℃條件下分次消化（每次25 min），收集除首次消化的細(xì)胞懸液，經(jīng)離心、洗滌后加入等體積含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，置于37℃的5%CO2孵箱中差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，每次30 min，共2次。

將去除成纖維細(xì)胞、未貼壁的原代心肌細(xì)胞再次接種于含10%胎牛血清、10%馬血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，以5×105/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿，置于37℃的5%CO2孵箱培養(yǎng)，24 h后換液，此后每隔2天及實(shí)驗(yàn)干預(yù)前換液，取培養(yǎng)第3-4天的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 原代心肌細(xì)胞H/R損傷模型的建立方法

用無糖DMEM培養(yǎng)液洗凈舊培養(yǎng)液，同時(shí)向盛有無糖DMEM培養(yǎng)液的離心管充入缺氧混合氣體（95%N2+5%CO2）15 min，關(guān)閉缺氧混合氣罐，棄去第3遍清洗的無糖DMEM培養(yǎng)液，將無氧無糖DMEM培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中，混勻，置于自制密閉盒中持續(xù)充入95%N2+5%CO2混合氣15 min，充分排盡自制密閉盒中的殘余氧氣，置于37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 h后，取出換為復(fù)氧培養(yǎng)液（1∶4（完全DMEM培養(yǎng)液∶高糖無血清DMEM培養(yǎng)液））繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

取培養(yǎng)第3-4天的原代心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞所用缺氧培養(yǎng)液為無糖無血清DMEM培養(yǎng)液，復(fù)氧培養(yǎng)液為1份完全DMEM培養(yǎng)液：4份高糖無血清DMEM培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組如下：①正常氧組（Control）：原代心肌細(xì)胞于37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 h后取出，換成復(fù)氧培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，不加藥物干預(yù)；②模型組（H/R）：原代心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧3 h復(fù)氧2 h處理，不加藥物干預(yù)；③曲美他嗪+H/R組（TMZ）：原代心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧3 h和復(fù)氧2 h處理，缺氧培養(yǎng)液及復(fù)氧培養(yǎng)液中均加入濃度為100 μmol/L的TMZ；④氣血并治方有效組分+H/R組（CWQB）：原代心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧3 h和復(fù)氧2 h處理，缺氧培養(yǎng)液及復(fù)氧培養(yǎng)液中均加入1 mmol/L的CWQB。

2.4 各組心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法將ATP、二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate，ADP） 、一 磷 酸 腺 苷 （Adenosine monophosphate， AMP） 、 肌 苷 酸 （Inosine 5′-monophosphate，IMP）的標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽各稱取10 mg，加入1 mL反應(yīng)液中（含1 mmol/L的乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid，EDTA）和 0.5 mmol/的 HClO4），3 500 rpm 離心 10 min。吸取 0.5 mL上清液放入另一試管中，加入0.175 mL濃度為2.1 mmol/L的KHCO3。充分反應(yīng)后，3 500 rpm離心10分鐘，從樣本中吸取20μL進(jìn)行色譜分析。HPLC參數(shù)如下，反相色譜柱：5 μm，15 mm×4.6 mm，柱溫：30℃，流動(dòng)相：30 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=5.85，K2HPO4-KH2PO4，含5%甲醇）。根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)鈉鹽前后的色譜峰高變化，從而計(jì)算樣品中ATP、ADP和AMP含量，并計(jì)算出總腺苷酸量（Total Adenylic Ncid，TAN=（ATP+ADP+AMP））和心肌細(xì)胞的能量狀態(tài)用能荷（Energy Charge，EC=（ATP+1/2ADP）/TAN）。

2.5 各組心肌細(xì)胞損傷與早期凋亡情況測(cè)定

取各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定心肌損傷標(biāo)志物肌酸激酶同工酶B（Creatinine kinase MB，CK-MB）和心肌肌鈣蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT）含量。另外，將各組心肌細(xì)胞洗滌、消化后，加入AnnexinV-FITC/PI Kit凋亡試劑，4℃避光孵育30 min，同時(shí)用等量PBS做陰性對(duì)照，離心后加入100 μL PBS重懸，上Bekman流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)ITC(+)/PI(-)的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

4 結(jié)果

4.1 各組心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量

HPLC檢測(cè)細(xì)胞裂解液中高能磷酸化合物含量，結(jié)果顯示，與Control組比較，H/R組、TMZ組、CWQB組AMP的含量顯著上升（p＜0.05），H/R組、CWQB組ADP含量顯著下降（p＜0.05），H/R組、TMZ組、CWQB組ATP的含量和TAN、EC水平顯著下降（p＜0.05）。與H/R組比較，TMZ組、CWQB組的AMP含量下降，ATP、ADP的含量和TAN、EC水平均有所升高（p＜0.05），其中TMZ組ADP、ATP、TAN升高程度和CWQB組比較，具有顯著性差異（p＜0.05）。見表1。

4.2 各組心肌細(xì)胞損傷與凋亡情況的測(cè)定

采用ELISA法檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnT的結(jié)果顯示，與Control組比較，H/R組CK-MB、cTnT的含量明顯上升（p＜0.05），說明H/R使心肌細(xì)胞受到損傷；與H/R組比較，TMZ組、CWQB組CK-MB、cTnT含量顯著下降，其中CWQB組cTnT含量下降更為顯著（p＜0.05），說明TMZ、CWQB能夠減少H/R條件下心肌細(xì)胞的損傷，起到一定的保護(hù)作用。見表2。

表1 CWQB對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量的影響（±s）

表1 CWQB對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量的影響（±s）

注：與Control組比較，*p＜0.05；與H/R組比較，#p＜0.05；與TMZ組比較，▲P＜0.05。

表2 CWQB對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物和早期凋亡的影響（±s）

表2 CWQB對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物和早期凋亡的影響（±s）

注：與Control組比較，*p＜0.05；與 H/R 組比較，#p＜0.05；與 TMZ組比較，▲p＜0.05。

采用流式細(xì)胞法測(cè)定各組細(xì)胞早期凋亡率的結(jié)果顯示，與Control組比較，各組心肌細(xì)胞早期凋亡率顯著上升（p＜0.01），說明H/R損傷條件下心肌細(xì)胞早期凋亡增多；與H/R組比較，TMZ組、CWQB組早期凋亡率有所下降，TMZ組下降更為顯著（p＜0.05），說明TMZ和CWQB均能降低H/R心肌細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。見表2。各組代表性早期凋亡率檢測(cè)結(jié)果見圖1。

4.3高能磷酸化合物含量與心肌損傷標(biāo)志物、早期凋亡率的相關(guān)性分析

各組心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量與心肌損傷標(biāo)志物進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析顯示，AMP、ADP、ATP濃度與CK-MB存在直線相關(guān)關(guān)系（r1=0.613,P=0.034＜0.05；r2=-0.738,P=0.006＜0.05;r3=-0.620,P=0.038＜0.05），ADP濃度與cTnT存在直線相關(guān)關(guān)系（r4=-0.613,P=0.034＜0.05)。其中CK-MB（y）ADP（x）與的直線關(guān)系的回歸系數(shù)R2=0.544,P＜0.01,回歸方程y=2.058-0.146x。見圖2。說明CK-MB水平與ADP濃度呈良好的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即ADP水平降低時(shí)，心肌損傷標(biāo)志物CK-MB增多。

各組心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量與心肌早期凋亡率進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析顯示，AMP、ADP、ATP濃度與心肌細(xì)胞早期凋亡率存在直線相關(guān)關(guān)系(r1=0.938,P＜0.01;r2=-0.769,P=0.003＜0.01;r3=-0.976,P＜0.01)與直線回歸關(guān)系（見圖2）。說明早期凋亡率與AMP濃度呈顯著正相關(guān)，與ADP、ATP濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，即AMP濃度升高、ADP與ATP濃度下降時(shí)，心肌細(xì)胞早期凋亡率增加。

5 討論

氣血并治方是由傳統(tǒng)化瘀名方--血府逐瘀湯化裁而來，由川芎、赤芍、桃仁、紅花、柴胡、枳殼組成，具有活血理氣、化瘀通脈的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，血府逐瘀湯組方可以從抗氧化應(yīng)激[9]、保護(hù)血管內(nèi)皮[10]等方面減輕H/R對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，氣血并治方有效組分配伍可以通過拮抗蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）途徑、絲裂素活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）途徑[11]，抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖[12]和內(nèi)皮素的釋放[13]，通過多途徑、多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。但氣血并治方對(duì)缺氧/復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上觀察其對(duì)H/R損傷心肌細(xì)胞能量代謝的影響，為通過改善心肌能量代謝來保護(hù)H/R損傷心肌提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 流式細(xì)胞法測(cè)定各組心肌細(xì)胞早期凋亡率的免疫熒光二維點(diǎn)圖

圖2 心肌細(xì)胞高能磷酸化合物含量與心肌損傷標(biāo)志物、早期凋亡率的回歸分析

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下AMP含量明顯升高，而ATP、ADP含量及TAN、EC水平顯著下降（P＜0.05），說明H/R造成了細(xì)胞利用ATP等直接供能物質(zhì)的能力下降，能量代謝發(fā)生障礙。加入TMZ或CWQB進(jìn)行干預(yù)后，ATP、ADP含量及TAN、EC水平有一定程度的升高，表明直接供給心肌細(xì)胞的能量相對(duì)增多，能量代謝障礙得到改善。心肌損傷標(biāo)志物及早期凋亡率檢測(cè)結(jié)果支持TMZ或CWQB對(duì)缺氧/復(fù)氧后的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高能磷酸化合物水平與心肌細(xì)胞早期凋亡率存在良好的相關(guān)性，AMP濃度與早期凋亡率呈顯著正相關(guān)，ADP、ATP濃度與早期凋亡率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。提示氣血并治方可以通過提高ATP、ADP等高能磷酸化合物的含量改善H/R心肌細(xì)胞能量代謝障礙，從而防止細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。

缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞損傷與多種病理環(huán)節(jié)密切相關(guān)[14]，如大量炎性反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基釋放等，同時(shí)也伴隨著心肌高能磷酸化合物儲(chǔ)備能力下降[15]、ATP的生成和利用障礙[16]，這些病理因素的持續(xù)存在將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5]。細(xì)胞自身存在一些保護(hù)性的內(nèi)在機(jī)制，如降低的ATP濃度可以激活一磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AdenosineMono Phosphate activated Protein Kinase，AMPK）信號(hào)通路[17]，增加底物的攝取和利用以促進(jìn)ATP的生成[18]。課題組下一步將從AMPK相關(guān)葡萄糖、脂肪酸代謝通路研究氣血并治方改善H/R心肌細(xì)胞能量代謝的機(jī)制。

氣血并治方作為由經(jīng)典方劑化裁而來的中藥小復(fù)方，可以通過抑制平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝、防止細(xì)胞損傷和凋亡的發(fā)生干預(yù)心血管疾病的多個(gè)治療靶點(diǎn)，在防治缺血性心臟病中具有顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著現(xiàn)代中藥制劑分析和藥理學(xué)研究的不斷深入，以氣血并治方為代表的中藥小復(fù)方多組分在心血管疾病防治中的作用將被更加凸顯。

致謝：心肌細(xì)胞培養(yǎng)由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室李澎副研究員指導(dǎo)完成，謹(jǐn)致謝忱。

1 Ussher J R,Elmariah S,Gerszten R E,et al.The Emerging Role of Metabolomics in the Diagnosis and Prognosis of Cardiovascular Disease. Journalofthe American College of Cardiology,2016,68(25):2850.

2 Jaswal J S,Cadete V J J,Lopaschuk G D.Optimizing cardiac energy substrate metabolism:A noveltherapeuticintervention for ischemic heart disease.Heart&Metabolism,2008,38(1):5-14.

3 SergienkoIV,BugriyM E,BalahonovaT V,et al.The possibility ofusage ofmetabolic correction therapyin patients with ischemic heart disease and heart failure. Rational Pharmacotherapy in Cardiology,2015,3(4):25-31.

4 Azevedo PS, Minicucci MF, Santos PP, etal. Energy metabolism in cardiac remodeling and heart failure.Cardiology in Review,2013,21(3):135-40.

5 Kolwicz SC Jr1,Purohit S,Tian R.Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth,and survival of cardiomyocytes.Circulation Research,2013,113(5):603-616.

6 董國菊,劉劍剛,史大卓,等.氣血并治方膠囊治療頸動(dòng)脈粥樣硬化的臨床研究.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,3(1):29-31.

7 劉劍剛,徐浩,董國菊,等.血府逐瘀口服液對(duì)冠心病心絞痛血瘀證病人血管內(nèi)皮功能及血液流變學(xué)的影響.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2006,4(8):659-661.

8 劉劍剛,馬魯波,張大武,等.均勻設(shè)計(jì)篩選理氣活血中藥提取物優(yōu)化配伍的實(shí)驗(yàn)研究.世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013(9):1882-1889.

9 侯澤,康文英,沃興德,等.血府逐瘀湯對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響.中國藥物與臨床,2006,6(8):590-593.

10 唐漢慶,趙善民,黃俊杰,等.血府逐瘀湯對(duì)冠心病血瘀模型家兔心功能、心肌及血管的影響.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(2):165-169.

11 嵇波,史大卓,劉劍剛,等.ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷條件培養(yǎng)基及氣血并治方有效組分配伍對(duì)平滑肌細(xì)胞MAPK、PKC活性和胞內(nèi)Ca～(2+)熒光強(qiáng)度的影響.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(2):29-32.

12 嵇波,劉劍剛,史大卓,等.氣血并治方有效組分不同配伍對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005,28(1):30-33.

13 劉劍剛,馬遷,史大卓,等.氣血并治方有效組分配伍對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)基因調(diào)控表達(dá)的影響.世界中西醫(yī)結(jié)合大會(huì),2007:56.

14 Jennings RB. Historical perspective on the pathology of myocardial ischemia/reperfusion injury.Circulation Research,2013,113(4):428-438.

15 Lygate C A,Schneider J E,Neubauer S.Investigating cardiac energetics in heart failure.Experimental Physiology,2013,98(3):601-605.

16 Dashty M. A quick look at biochemistry: Carbohydrate metabolism.Clinical Biochemistry,2013,46(15):1339-1352.

17 SaltIP, Hardie DG.AMP-Activated Protein Kinase:An Ubiquitous Signaling Pathway.With Key Roles in the Cardiovascular System..Circulation Research,2017,120(11):1825-1841.

18 BaskinK K,TaegtmeyerH.AnExpandedRoleforAMP-activated Protein Kinase Regulator of Myocardial Protein Degradation.Trends in Cardio-vascular Medicine,2011,21(4):124-127.