直鏈淀粉含量及淀粉平均聚合度對抗性淀粉含量影響的研究

朱哲+劉良忠+黃婷+王幻+王松樹

摘要：直鏈淀粉含量與淀粉平均聚合度對抗性淀粉的形成有著重要的影響，以玉米淀粉、紅薯淀粉、豌豆淀粉、綠豆淀粉為原料，采用普魯蘭酶和α-淀粉酶協(xié)同制備抗性淀粉，改變淀粉的直鏈淀粉含量和聚合度，分析淀粉直鏈淀粉含量及其聚合度與抗性淀粉含量的關(guān)系。結(jié)果表明，直鏈淀粉含量與抗性淀粉含量呈明顯正相關(guān)，平均聚合度在一定范圍內(nèi)有利于提高抗性淀粉的含量。

關(guān)鍵詞：直鏈淀粉含量；聚合度；抗性淀粉

中圖分類號：TS236 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）02-0320-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.028

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）又稱抗酶解淀粉、難消化淀粉，在健康人體小腸內(nèi)不能被消化吸收[1]?？剐缘矸劬哂信c膳食纖維類似作用，可延緩餐后血糖上升[2]，將有效控制糖尿病病情，RS在體內(nèi)所產(chǎn)生的熱量不及普通淀粉的十分之一，所以可認(rèn)為RS在體內(nèi)為低能甚至不產(chǎn)生能量[3]，RS在大腸內(nèi)的發(fā)酵產(chǎn)物主要是一些氣體和短鏈脂肪酸，對預(yù)防結(jié)腸癌有著重要的意義[4]。抗性淀粉有5種類型[5]：RS1（物理包埋淀粉）、RS2（天然具有抗消化的抗性淀粉）、RS3（回生淀粉）、RS4（化學(xué)改性淀粉）、RS5（直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物）。其中，RS3是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。工業(yè)上主要用壓熱處理方法制備抗性淀粉，通常是將淀粉懸浮液先加熱到100 ℃以上，使淀粉充分糊化，讓直鏈淀粉分子從內(nèi)部釋放出來，冷卻到一定溫度，維持足夠長的時間，使直鏈淀粉回生，經(jīng)酶消化水解支鏈淀粉和無定型區(qū)淀粉分子，得到抗性淀粉。因此，直鏈淀粉含量的多少直接影響抗性淀粉含量，通過脫支處理可以使支鏈淀粉脫支，相應(yīng)增加直鏈淀粉含量，增加抗性淀粉含量[6，7]。Eerlingen等[8]研究了平均聚合度（DP）在40～610淀粉其抗性淀粉的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子平均聚合度越小，抗性淀粉含量越低。聚合度也是淀粉分子形成抗性淀粉的重要參數(shù)。本試驗(yàn)以玉米淀粉、紅薯淀粉、豌豆淀粉、綠豆淀粉為原料，采用普魯蘭酶與α-淀粉酶協(xié)同制備抗性淀粉，研究直鏈淀粉含量和淀粉平均聚合度對抗性淀粉含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉，湖北任森農(nóng)業(yè)科技發(fā)展股份有限公司；紅薯淀粉，山東宏河圣齊生物工程有限公司；豌豆淀粉，成都達(dá)恒毛實(shí)業(yè)有限公司；綠豆淀粉，衡水富橋淀粉有限公司；馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，上海源葉生物科技有限公司；玉米支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，上海源葉生物科技有限公司；普魯蘭酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；液體葡萄糖淀粉酶，安琪酵母股份有限公司；液體耐高溫α-淀粉酶，無錫賽德生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

AL204分析天平，上海右一儀器有限公司；掃描型紫外可見分光光度計，Thermo Fisher Evolution 220；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LD-5低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；雷磁PHS-3C PH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品直鏈淀粉含量測定方法 按照GB 15683-2008的方法進(jìn)行測定和計算。

1.3.2 淀粉平均聚合度的測定 聚合度的測定為還原末端法[6，9]。樣品經(jīng)過85%的乙醇數(shù)次洗滌以除去可溶性糖，烘至恒重。稱取0.200 g不同制備方法的淀粉樣品，在2.00 mol/L的KOH溶液中溶解4 h直到全部溶解，加入少量蒸餾水，用1.00 mol/L的HCl中和至pH 6.0～7.0，后用蒸餾水定容至50 mL。取0.5 mL已配置好的溶液，DNS測定還原性末端的量（以葡萄糖的量表示）。按以下公式計算淀粉分子平均聚合度：

DP=■

式中，W為淀粉樣品的質(zhì)量（mg）；1.1為淀粉換算成葡萄糖的系數(shù)，Gr為用DNS法則1 mL樣品溶液的還原末端數(shù)量。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用3，5-二硝基水楊酸比色法[10]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 抗性淀粉含量的測定 根據(jù)Goni法[11，12]測定抗性淀粉。稱取1 g淀粉試樣溶于20 mL、pH 6.5的磷酸緩沖液中。加入1 mL耐熱α-淀粉酶溶液（20 U/mL），置于95 ℃水浴中振蕩30 min，通過耐熱α-淀粉酶溶液分解其中的可消化淀粉。用檸檬酸（1 mol/L）調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5，再加入1 mL糖化酶（1 000 U/mL）。將樣品進(jìn)行水浴振蕩，溫度為60 ℃，時間為60 min，至可消化淀粉全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖。將得到的溶液置于3 000 r/min的離心機(jī)中進(jìn)行離心，棄掉上清液。用水洗離心后的沉淀部分（重復(fù)兩次），洗去其中的葡萄糖，抗性淀粉則全部沉淀。向沉淀中加入4 mol/L的KOH溶液5 mL，置于沸水浴中5 min，使得抗性淀粉全部溶解。再加入2 moL/L鹽酸10 mL中和樣品中的KOH溶液，用緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH至4.0～4.5。向樣品中加入1 mL糖化酶，并在60 ℃水浴振蕩60 min，這樣就可以將抗性淀粉全部轉(zhuǎn)化成葡萄糖。將所得樣品定容至100 mL，然后采用DNS法[10]測定其中的還原糖含量，最后將數(shù)據(jù)乘以0.9就得到了抗性淀粉含量，并以此計算抗性淀粉得率：

Y=■×0.9×100%

式中，Y為抗性淀粉得率，M為樣品質(zhì)量；M0為還原糖質(zhì)量。

1.3.5 抗性淀粉的制備工藝 稱取一定量淀粉，加入蒸餾水調(diào)制成一定濃度的淀粉乳，密封于耐高溫高壓的燒杯中。將淀粉乳置于高壓滅菌鍋中，在一定溫度下加熱一段時間，使淀粉糊化。糊化結(jié)束后，在室溫中放置，使其冷卻至室溫，再將樣品放入4 ℃冰箱中冷藏24 h。取出回生的淀粉，80 ℃烘干12 h，用萬能粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，得到抗性淀粉。

1.3.6 壓熱法條件的優(yōu)化 參考文獻(xiàn)[13]，選取淀粉乳濃度、壓熱時間、壓熱溫度對RS得率有較大影響的3個因素及其3個水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

1.3.7 不同直鏈淀粉含量樣品的制備及抗性淀粉制備 分別稱取一定量的玉米淀粉、紅薯淀粉、綠豆淀粉、豌豆淀粉4種淀粉調(diào)成淀粉乳，進(jìn)行預(yù)糊化和高壓糊化處理，迅速冷卻至一定溫度后加入適量普魯蘭酶，在55 ℃、pH 5.5條件下，4種淀粉樣品分別脫支1、2、4、6、8 h，每組做3個平行試驗(yàn)。高溫滅酶后冷卻至室溫，在4 ℃條件貯藏24 h，干燥過篩。檢測樣品的直鏈淀粉含量和抗性淀粉含量。

1.3.8 不同淀粉平均聚合度樣品的制備及抗性淀粉制備 分別稱取一定量的玉米淀粉、紅薯淀粉、綠豆淀粉、豌豆淀粉4種淀粉調(diào)成淀粉乳，進(jìn)行預(yù)糊化和高壓糊化處理，每種淀粉分別添加0、2、4、6、8 mL的α-淀粉酶，在95 ℃、pH 6.0條件下，水解30 min，每組做3個平行試驗(yàn)。加酸停止水解，高溫滅酶后冷卻至室溫，在4 ℃條件下貯藏24 h，干燥過篩。檢測樣品的平均聚合度和抗性淀粉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈淀粉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

直鏈淀粉含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.004 5x+0.154 2，R2=0.999 7（圖1）。

2.2 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.203 8x，R2=0.999 4（圖2）。

2.3 壓熱法條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響壓熱條件的因素排序?yàn)锳>B>C，即淀粉乳濃度對抗性淀粉影響最大，壓熱溫度的影響次之，壓熱時間影響最小。試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B2C2，即淀粉乳濃度為20%，壓熱溫度為120 ℃，壓熱時間為30 min。在最優(yōu)工藝參數(shù)條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)（表3），其淀粉含量為（8.30±0.02）%。

2.4 普魯蘭酶作用時間對直鏈淀粉形成的影響

由圖3可知，普魯蘭酶酶解時間為6 h時，玉米淀粉、紅薯淀粉含量達(dá)到最高；當(dāng)普魯蘭酶脫支時間在0～6 h時，玉米、紅薯直鏈淀粉含量隨著酶解時間的增加而增加；當(dāng)普魯蘭酶脫支時間在6～8 h時，玉米、紅薯直鏈淀粉含量隨著酶解時間的增加而減小。當(dāng)普魯蘭酶脫支時間為4 h時，豌豆淀粉、綠豆淀粉含量達(dá)到最高；當(dāng)普魯蘭酶脫支時間在0～4 h時，豌豆、綠豆直鏈淀粉含量隨著酶解時間的增加而增加；當(dāng)普魯蘭酶脫支時間在4～8 h時，豌豆、綠豆直鏈淀粉含量隨著酶解時間的增加而減小。直鏈淀粉含量不隨酶作用時間的增加而減小，是由于普魯蘭酶雖然不能無限制水解，最多能使表觀直鏈淀粉含量達(dá)50%，但普魯蘭酶除了能水解支鏈淀粉分支中的α-1，6糖苷鍵，還能水解直鏈淀粉中的α-1，6糖苷鍵，到達(dá)最佳酶解時間后普魯蘭酶與淀粉已經(jīng)作用充分，繼續(xù)反應(yīng)會導(dǎo)致淀粉水解過度生成短鏈或小分子，造成直鏈淀粉過短進(jìn)而使直鏈淀粉的表觀含量下降[14]。

2.5 直鏈淀粉含量對抗性淀粉形成的影響

利用不同的普魯蘭酶脫支時間分別處理玉米淀粉、紅薯淀粉、豌豆淀粉、綠豆淀粉，制備不同直鏈淀粉含量的淀粉樣品并制備抗性淀粉樣品，直鏈淀粉含量與抗性淀粉含量關(guān)系如圖4所示。經(jīng)過普魯蘭酶作用后淀粉糊中直鏈分子含量極大地增加，直鏈淀粉含量對抗性淀粉的形成有顯著的影響，隨著直鏈淀粉含量的增大，抗性淀粉含量不斷上升。分析其原因是淀粉糊中被打亂的分子鏈重新聚合、卷曲、折疊等形成新的晶體，其中直鏈分子凝沉更快，而且形成晶體也更牢固。在凝沉?xí)r分子鏈都是不斷運(yùn)動的，但每種分子鏈運(yùn)動的速度不同，分子量大的支鏈分子運(yùn)動的速度相對較慢而分子量小的直鏈分子則運(yùn)動很快，直鏈分子碰撞在一起的幾率較大，故直鏈分子回生速度比支鏈分子快，直鏈淀粉含量的增加促進(jìn)了抗性淀粉的形成。

2.6 α-淀粉酶添加量對淀粉平均聚合度的影響

α-淀粉酶能夠切斷淀粉分子中的α-1，4糖苷鍵，從而切斷淀粉分子鏈進(jìn)而改變淀粉平均聚合度。由圖5可知， 經(jīng)過壓熱處理后隨著α-淀粉酶用量的增加， 玉米淀粉、紅薯淀粉、綠豆淀粉、豌豆淀粉4種淀粉的平均聚合度不斷減小。

2.7 淀粉平均聚合度對抗性淀粉含量影響的研究

利用α-淀粉酶水解直鏈淀粉和支鏈淀粉中α-1，4糖苷鍵可以降低淀粉糊的黏度，進(jìn)一步提高抗性淀粉含量。淀粉樣品的平均聚合度主要受α-淀粉酶的影響，利用不同α-淀粉酶添加量分別酶解玉米淀粉、紅薯淀粉、豌豆淀粉、綠豆淀粉4種不同淀粉，制備不同淀粉平均聚合度的淀粉樣品和抗性淀粉，淀粉平均聚合度和抗性淀粉含量關(guān)系如圖6所示。

由圖6可知，隨著加入α-淀粉酶水解，玉米淀粉平均聚合度從180降至92，抗性淀粉含量從14.21%升至17.12%；紅薯淀粉平均聚合度從152降至95，抗性淀粉含量從15.11%升至20.35%；豌豆淀粉平均聚合度從170降至98，抗性淀粉含量從17.05%升至24.59%；綠豆淀粉平均聚合度從204降至114，抗性淀粉含量從15.98%升至22.61%。隨著α-淀粉酶進(jìn)一步增加，玉米淀粉平均聚合度從92降至32，抗性淀粉含量從17.12%降至12.87%；紅薯淀粉平均聚合度從95降至34，抗性淀粉含量從20.35%降至13.91%；豌豆淀粉平均聚合度從98降至43，抗性淀粉含量從24.59%降至15.48%；綠豆淀粉平均聚合度從114降至41，抗性淀粉含量從22.61%降至14.21%。淀粉的平均聚合度對抗性淀粉含量影響較大?？剐缘矸鄣男纬尚枰辨湹矸?，因?yàn)橹辨湹矸劭商峁┮欢ǖ娜S結(jié)構(gòu)空間。聚合度過小、直鏈淀粉分子太短、運(yùn)動比較強(qiáng)烈、擴(kuò)散速度較大較難聚集形成三維結(jié)構(gòu)；而聚合度太大、直鏈淀粉過長、分子間的斥力較大也難聚集，所以只有中等長度才最有利于聚集。4種淀粉聚合度均在一定范圍內(nèi)抗性淀粉含量較高，所以控制淀粉平均聚合度在一定范圍內(nèi)，可有效地提高抗性淀粉含量。

3 小結(jié)與討論

壓熱條件正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響壓熱條件的因素中淀粉乳濃度對抗性淀粉影響最大，壓熱溫度的影響次之，壓熱時間影響最小。試驗(yàn)最優(yōu)條件為淀粉乳濃度20%，壓熱溫度120 ℃，壓熱時間30 min。

玉米淀粉、紅薯淀粉、豌豆淀粉、綠豆淀粉4種淀粉為原料的試驗(yàn)呈現(xiàn)相同的規(guī)律。直鏈淀粉含量和淀粉平均聚合度對抗性淀粉的形成有顯著影響，直鏈淀粉含量與抗性淀粉產(chǎn)率明顯呈正相關(guān)，采用普魯蘭酶脫支處理增加淀粉直鏈淀粉含量有利于抗性淀粉的形成；采用α-淀粉酶處理淀粉，控制淀粉平均聚合度在一定范圍內(nèi)能大幅提高抗性淀粉的產(chǎn)率。

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