泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)研究及優(yōu)勢真菌菌群變化分析

孟霞，裴樂樂，張安，張亞豪，張文學(xué)

（四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都 610065）

泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)研究及優(yōu)勢真菌菌群變化分析

孟霞，裴樂樂，張安，張亞豪，張文學(xué)＊

（四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都 610065）

采用構(gòu)建18SrDNA克隆文庫及ARDRA分型分析對(duì)發(fā)酵過程中青菜泡菜樣品進(jìn)行研究，了解其真菌的多樣性。結(jié)果表明：所得到的744個(gè)陽性克隆子分布于11個(gè)類群，其絕對(duì)優(yōu)勢真菌Debaryomyces貫徹整個(gè)發(fā)酵中期，Pichia在發(fā)酵第15天為絕對(duì)優(yōu)勢菌，Kodamaeaohmeri在發(fā)酵第81天為絕對(duì)優(yōu)勢菌，檢測到的主要優(yōu)勢真菌有Candida等。熒光定量qPCR的結(jié)果與克隆文庫基本吻合，進(jìn)一步說明了克隆文庫的準(zhǔn)確性。此結(jié)果不僅能夠較全面、真實(shí)地反映同種原料泡菜發(fā)酵過程中真菌的群落結(jié)構(gòu)及差異，而且能發(fā)揮免培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢，可為泡菜等發(fā)酵食品的研究應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

泡菜；真菌；ARDRA；18SrDNA克隆文庫；qPCR

泡菜是我國傳統(tǒng)特色發(fā)酵制品，距今已有3000多年的歷史［1］。在中國的泡菜發(fā)展史中，四川泡菜原料蔬菜的種植氣候、水土，制作工藝技術(shù)，發(fā)酵容器，產(chǎn)業(yè)的地位等，都應(yīng)值得歷史記載，中國泡菜首推四川泡菜，四川泡菜堪稱“國粹”［2］，被譽(yù)為“川菜之骨”。

泡菜古稱葅，是指為了便于長時(shí)間存放而經(jīng)過發(fā)酵的蔬菜。它是一種利用蔬菜本身攜帶的微生物或人為添加發(fā)酵劑，并加入少量食鹽進(jìn)行發(fā)酵而制成的產(chǎn)品。泡菜中含有多種維生素、礦質(zhì)元素和豐富的膳食纖維。泡菜不僅是佐餐佳品，而且還具有刺激食欲，健胃消食，改善腸道環(huán)境，促進(jìn)胃腸健康，通便緩瀉等功能［3］。

泡菜中微生物多樣性研究一般采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，由于生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物僅占總數(shù)的0.1%～10%［4］，所以，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法不能客觀、全面地反映微生物多樣性。近年來，由于免培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，可直接從分子水平上來研究環(huán)境樣品中的微生物區(qū)系［5］。燕平梅等［6］通過對(duì)泡白菜鹵水中優(yōu)勢微生物的分離鑒定進(jìn)行了抗菌特性研究；張偉［7］對(duì)自然發(fā)酵泡菜過程中主要化學(xué)成分的變化以及微生物菌落長勢變化進(jìn)行了研究；梁新樂等［8，9］應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)對(duì)泡菜中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究，揭示了傳統(tǒng)泡菜中微生物的多樣性。

本文采用先進(jìn)的分子生物學(xué)手段，結(jié)合四川泡菜的發(fā)酵特點(diǎn)，運(yùn)用構(gòu)建18SrDNA克隆文庫、酶切分析技術(shù)及qPCR技術(shù)，研究分析同種原料泡菜中的真菌群落結(jié)構(gòu)，這有助于改善現(xiàn)有四川泡菜發(fā)酵工藝，從而為改良泡菜生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率提供理論依據(jù)，對(duì)于泡菜發(fā)酵機(jī)理的研究、實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)泡菜企業(yè)綜合效益的提高具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

收集了四川省李記醬菜調(diào)味品有限公司的青菜泡菜液（發(fā)酵初、中期窖池原液），把樣品取回后立即密封保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

E.Z.N.A Water DNA Kit基因DNA組提取試劑盒（Sangon），2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN），PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Sangon），DH5α-感受態(tài)細(xì)胞（TIANGEN），T-載體PCR克隆試劑盒（Sangon），HaceⅢ酶和Hinf酶（TAKARA，日本）以及SYBR GREEN I（Amresco）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific，美國）；TCR-312PCR儀（TECHNE，英國）；DYY-5電泳儀（北京六一，中國）；凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）；氣浴搖床（HZQ-X100，中國）；LightCycler實(shí)時(shí)熒光PCR儀，Light Cycler Nano（瑞士Roche公司）；Thermo核酸測定儀（NANODROP 2000，美國）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品總DNA的提取

采用E.Z.N.A Water DNA Kit基因DNA組提取試劑盒（Sangon）提取真菌樣品總DNA，具體步驟詳見說明書。純化后用于PCR擴(kuò)增。

1.4.2 真菌18SrDNA全序列擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物為18SrDNA通用引物EF3（5＇-TCCTAAATGACCAAGTTTG-3＇）和EF4（5＇-GGAAGGARTGTATTTATTAG-3＇），均由上海生工生物有限公司合成。擴(kuò)增目的片斷大小為1500bp［10］。

擴(kuò)增程序如下：先94℃預(yù)變性5min；再94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30次循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增體系（50μL）：DNA模板4μL，上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μM）各2μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，無菌超純水17μL。

1.4.3 PCR產(chǎn)物切膠回收

用2.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒（Sangon）純化PCR產(chǎn)物，具體步驟詳見說明書。

1.4.4 克隆文庫的構(gòu)建

將純化后的PCR產(chǎn)物與pMDTM-19-T vector載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α-感受態(tài)細(xì)胞（TIANGEN）中，采用Amp-X-gal-IPTG抗性篩選平板選擇具有氨芐青霉素抗性的白色轉(zhuǎn)化子構(gòu)建16SrDNA與18SrDNA克隆文庫。

對(duì)選擇的陽性克隆子PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，用限制性內(nèi)切酶HaceⅢ和Hinf對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分型，酶切圖譜相同的為同一個(gè)分類操作單元（OUT，operational taxonomic unit）［11］?？寺∽訑?shù)量占總克隆子數(shù)大于30%的OTUs為絕對(duì)優(yōu)勢菌，大于10%的為主要優(yōu)勢菌，5%～10%之間的為次要優(yōu)勢菌。從每個(gè)OTU類型中挑取1個(gè)代表克隆子送至上海生工進(jìn)行測序。

1.4.5 18Sr DNA系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序所得序列通過去除嵌合體后，在Ribosomal RNA Database數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，選擇相似最大的序列為分類結(jié)果。利用Mega 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）建構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)為1000，Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)樹。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用覆蓋率Coverage C［12］評(píng)價(jià)同種原料泡菜真菌克隆文庫的庫容情況：Coverage C＝［1－（n1× N－1）］×100%，N代表文庫中克隆子總數(shù)，n1代表文庫中僅出現(xiàn)1次克隆子的數(shù)量。依據(jù)上述OUT分類結(jié)果，用軟件Sigma Plot Porable計(jì)算稀釋度，以克隆字?jǐn)?shù)量為橫坐標(biāo)，OUT數(shù)量為縱坐標(biāo)，并采用Shannon-wiener index，Pielou index和Sorensen similarity index評(píng)價(jià)泡菜樣品真菌的多樣性、均勻度和相似程度，并通過生態(tài)學(xué)軟件Biodap進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［13］。

1.4.7 熒光定量qPCR分析

用熒光定量qPCR方法來定量檢測青菜發(fā)酵過程中的絕對(duì)優(yōu)勢真菌的變化趨勢。qPCR用的儀器是Light Cycler Nano，瑞士Roche公司。絕對(duì)優(yōu)勢真菌Debaryomyces的qPCR擴(kuò)增引物為Derba F1（5＇-CTTTCGCCCTGTGGTGTTTG-3＇）和Derba R1（5＇-GCGTCAAAAAAAGAACAACACC-3＇），將Debaryomyces（登錄號(hào)KM586972.1）18SrDNA序列與其他屬的酵母菌18SrDNA序列（從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取）用CLUSTAL X多序列比對(duì)軟件進(jìn)行比對(duì)，然后通過Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)的引物特異性先用BLAST在線驗(yàn)證（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），最后采用普通PCR和熒光定量PCR相結(jié)合的方法驗(yàn)證qPCR引物的特異性［14，15］。擴(kuò)增程序如下：第一步，95℃10min；第二步，40個(gè)循環(huán)，包括95℃15s，66℃30s，72℃20s；第三步，延伸76℃10s。擴(kuò)增體系（10μL）：DNA模板1μL，上游引物（10μmol/L）和下游引物（10μmol/L）各0.2μL，SYBR GREEN Real-time PCR Master Mix 10μL，無菌超純水8.6μL。梯度稀釋質(zhì)粒，制作質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線（用熔解曲線來檢測產(chǎn)物特異性和引物二聚體）。qPCR的擴(kuò)增效率計(jì)算公式E＝10（－1/slope）－1［16］。

2 結(jié)果

2.1 青菜發(fā)酵過程中真菌18SrDNA基因克隆文庫評(píng)價(jià)

為了研究同種原料泡菜中真菌生物多樣性，本文構(gòu)建了發(fā)酵過程中（1，3，15，21，31，64，81天）青菜泡菜的真菌18SrDNA克隆文庫，最終獲得744個(gè)陽性克隆子。通過菌液PCR驗(yàn)證，挑選的陽性克隆子，經(jīng)ARDRA分析，共有36個(gè)OTUs，同源性≥97%的序列選取1個(gè)代表序列，作為同一個(gè)類群。最終選11個(gè)不同基因型的序列，與Genbank數(shù)據(jù)庫中相似序列的同源性為98%～100%。樣品的真菌克隆文庫的Coverage C（覆蓋率）分別為99.16%，99.37%，100%，99.11%，99.24%，100%，98.06%，所有樣品的克隆文庫容量值都達(dá)到98%以上，這表明其庫容值較大，文庫的覆蓋程度較高，文庫具有較好的代表性。隨著樣品真菌陽性克隆子數(shù)的增加，真菌酶切類型OTU逐漸增加，Rarefaction曲線趨于平緩，并最終均達(dá)到了平臺(tái)期，見圖1，這說明文庫中的克隆數(shù)已經(jīng)反映了泡菜中絕大部分的真菌多樣性。

圖1 青菜發(fā)酵過程真菌18SrDNA克隆文庫稀釋度曲線圖Fig.1Dilution degrees curve of fungi 18SrDNA clone library of brassica chinensis during fermentation process

表1 青菜泡菜發(fā)酵過程中真菌18SrDNA克隆文庫的多樣性指數(shù)和相似性Table 1The diversity index and similarity of fungi 18SrDNA clone library of brassica chinensis during fermentation process

式中：H為Shannon-Wiener多樣性指標(biāo)；S為樣品中含有多少種不同的物種的數(shù)量；p為第i個(gè)物種所占的百分比；多樣性指數(shù)能夠反映出環(huán)境樣品中的群落種類。

李記青菜泡菜樣品的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在0.04～1.21之間，其中發(fā)酵第1天真菌多樣性最高，隨發(fā)酵時(shí)間增長，多樣性指數(shù)逐漸減小，在發(fā)酵31天時(shí)降到最小0.04，而此時(shí)樣品均勻度也降到最低0.06，隨后慢慢增加。

2.2 青菜發(fā)酵過程中真菌18SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

36個(gè)OTUs在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚成11個(gè)類群（見圖2和圖3），它們分別屬于德巴利酵母屬（Debaryomyces），假絲酵母屬（Candida），畢赤酵母屬（Pichia），奧默柯達(dá)酵母屬（Kodamaeaohmeri），UnculturedPichia，絲孢酵母屬（Trichosporon），白冬酵母屬（Leucosporidium），Holtermanniella，Mastiqobasidium，Pasathyrella，UnculturedKazachstania。

圖2 青菜泡菜發(fā)酵過程中真菌18SrDNA克隆文庫的克隆子分布圖Fig.2Distribution diagram of fungi 18SrDNA clone library of brassica chinensis during fermentation process

圖3 基于每類真菌OTUs克隆子的18SrDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖Fig.3Phylogenetic tree based on the complete 18SrDNA gene sequences of representative clones from fungi OTUs

青菜泡菜發(fā)酵中期，Debaryomyces類群中，3d-11，21d-4，21d-29，21d-35，31d-13，31d-84，31d-101，31d-167，64d-3和64d-83克隆序列與Debaryomyces hansenii菌株相似，形成一個(gè)族群，且同源性為99%；3d-5，3d-22，81d-90，81d-98和81d-127克隆序列與Debaryomycessp.菌株相似，形成一個(gè)族群，且同源性為99%。德巴利氏酵母在發(fā)酵過程中（發(fā)酵前3個(gè)月，除去最開始剛放入原料的時(shí)間）均為絕對(duì)優(yōu)勢菌，所占克隆文庫比例分別為80.38%（3天），52.46%（15天），98.21%（21天），99.24%（31天），93.48%（64天）和60.19%（81天）。Debaryomyceshansenii在高鹽度的泡菜環(huán)境中具有較高的食鹽耐受能力，因此青菜環(huán)境中的德巴利氏酵母能成為絕對(duì)優(yōu)勢菌，可能與其較高的食鹽耐受力有關(guān)。因此Debaryomyces可以作為功能菌。Cano-Garcia等［17］從自然發(fā)酵香腸中分離出了具有促進(jìn)生香的功能的Debaryomyceshansenii菌株。

Candida類群中，克隆序列3d-38和15d-13分別與Candidaatmosphaerica和Candidasp.菌株相似，形成同一個(gè)族群，且同源性為99%，占發(fā)酵過程中克隆文庫比例分別為19.62%（3天）和3.28%（15天），Candida在發(fā)酵第3天為青菜樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢菌，發(fā)酵15天時(shí)的量較少，其他發(fā)酵時(shí)期沒有檢測到。張奶英等［18］利用PCR-DGGE技術(shù)檢測出鹽漬過程中的芥菜存在Candida。

Pichia類群中，克隆序列15d-23，21d-22，31d-33與Pichiakluyveri菌株相似，形成同一個(gè)族群，且同源性為99%，占發(fā)酵過程中克隆文庫比例分別為41.80%（15天），1.79%（21天）和0.76%（31天），Pichia在發(fā)酵第15天為青菜樣品中的絕對(duì)優(yōu)勢菌。劉春燕等［19］采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法分離出畢赤酵母，并認(rèn)為其為傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中的主要酵母菌。與劉春燕報(bào)道的差異可能是由于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法與免培養(yǎng)方法之間有一定的差距，而且生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物占微生物總數(shù)的比例較小。

而克隆序列64d-24，81d-43和81d-110與Kodamaea ohmeri相似菌株形成同一個(gè)族群，同源性為99%，占發(fā)酵過程中克隆文庫比例分別為2.90%（64天）和38.83%（81天），Kodamaeaohmeri在發(fā)酵第81天（即發(fā)酵后期）為青菜樣品中的優(yōu)勢菌，發(fā)酵64天時(shí)的量較少，其他發(fā)酵時(shí)期沒有檢測到。奧默柯達(dá)酵母菌常在自然發(fā)酵的腌肉、泡菜、奶酪等中分離到，耐鹽，是這些發(fā)酵食品的正常菌群［20－22］。

另外，青菜發(fā)酵過程中還檢測出了Trichosporon（8.40%），Leucosporidium（52.94%），Holtermanniella（2.52%），Mastiqobasidium（14.29%），Pasathyrella（14.29%）等，但它們只有在發(fā)酵的第1天存在，所以它們可能是原料（青菜）本身攜帶的真菌，發(fā)酵開始后，它們就消失了。

2.3 青菜發(fā)酵過程中絕對(duì)優(yōu)勢真菌Debaryomyces的qPCR分析

泡菜樣品中德巴利酵母屬的qPCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖（見圖4）顯示，擴(kuò)增曲線基本趨于平緩，表明qPCR擴(kuò)增達(dá)到平臺(tái)期；熔解曲線只出現(xiàn)單峰，熔解溫度為84℃，且無80℃以下峰出現(xiàn)，表明沒有引物二聚體和非特異產(chǎn)物生成。同時(shí)，樣品中德巴利酵母屬的最大Cq值均小于相應(yīng)菌檢測方法的檢測Cq值說明定量結(jié)果可靠。得到線性回歸方程Cq＝－3.38log10（q）＋53.61，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9933，擴(kuò)增效率為0.978，當(dāng)相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，擴(kuò)增效率90%≤E≤110%時(shí)，說明線性關(guān)系良好。

圖4 德巴利酵母屬的qPCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖Fig.4Amplification and melting curves ofDebaryomycesqPCR

青菜泡菜中德巴利酵母屬qPCR的Cq值及德巴利酵母屬Copies值（copies/mL）見表2。

表2 發(fā)酵泡菜中德巴利酵母屬熒光定量Cq值及樣品中DNATable 2Fluorescence quantitative values of Cq and DNA in the samples ofDebaryomycesin fermented pickles

根據(jù)克隆文庫結(jié)果，德巴利酵母屬為絕對(duì)優(yōu)勢菌，且在發(fā)酵過程中（81天），其趨勢是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，先增加后減少，第31天達(dá)到最高。一般情況下，樣品中目標(biāo)DNA Copies值越高其對(duì)應(yīng)的熒光定量Cq值越小，由表2可知，德巴利酵母屬Cq值均小于30，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，先增加后減少，且第31天的Cq值最小（即樣品中目標(biāo)DNA含量最高），Copies值最大，數(shù)量級(jí)為1011，這表明熒光定量結(jié)果與克隆文庫基本相吻合。

3 結(jié)論

通過18SrDNA克隆及ARDRA分型分析技術(shù)對(duì)真菌菌群結(jié)構(gòu)分析，表明青菜發(fā)酵過程中的真菌基因多樣性比較豐富，同時(shí)也存在一定差異。結(jié)果表明：青菜泡菜在發(fā)酵中期，其絕對(duì)優(yōu)勢真菌Debaryomyces貫徹整個(gè)發(fā)酵中期，Pichia在發(fā)酵第15天為絕對(duì)優(yōu)勢菌，Kodamaeaohmeri在發(fā)酵第15天為絕對(duì)優(yōu)勢菌，主要優(yōu)勢真菌有Candida等。通過查找文獻(xiàn)資料，了解到Debaryomyces具有耐鹽特性，在泡菜發(fā)酵的過程中可作為功能菌；而Candida絕大部分為致病微生物，是有害菌。且熒光定量qPCR的結(jié)果與克隆文庫基本吻合，進(jìn)一步說明了克隆文庫的準(zhǔn)確性。利用免培養(yǎng)方法的克隆技術(shù)對(duì)泡菜菌群結(jié)構(gòu)的解析不依賴培養(yǎng)過程，更能全面地分析泡菜發(fā)酵環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)。此結(jié)果不僅能夠較全面、真實(shí)地反映同種原料泡菜的真菌的群落結(jié)構(gòu)及差異，而且能發(fā)揮免培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢，可為泡菜等發(fā)酵食品的研究應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Study on Fungi Community Structure in Pickle during Natural Fermentation and Analysis on Changes of Predominant Fungi

MENG Xia，PEI Le-le，ZHANG An，ZHANG Ya-hao，ZHANG Wen-xue＊
（College of Light Industry，Textile and Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

18SrRNA clone library is constructed and ARDRA technology is applied for the green vegetable pickle sample，in order to investigate fungal diversity.The results show that 744obtained positive clones distributed in 11taxa.The predominant fungus isDebaryomycesin the whole fermentation process.Pichiais the predominant fungus in the fermentation of the 15th day andKodamaeaohmeriis the predominant fungus in the fermentation of the 81th day.The main predominant fungi areCandidaand so on.The results of qPCR are consistent with the clone library，which further illustrate the accuracy of the clone library.The results can not only reflect the difference of fungal structure in the same green vegetable pickle sample，but also can make use of the advantages of free culture techniques.It could provide certain theoretical basis for research and application of pickle and other fermented food.

pickle；fungi；ARDRA；18SrDNA clone library；qPCR

TS255.54

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.012

1000-9973（2017）03-0049-06

2016－09－15 ＊通訊作者

國家科技支撐計(jì)劃（2012BDA31B00）；四川省科技支撐計(jì)劃（2013VZ0055）

孟霞（1989－），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)；張文學(xué)（1963－），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：發(fā)酵工程。