轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在篩選免疫相關(guān)基因中的應(yīng)用

廖 青 周群麗 唐艷華 黃 鋒 許道軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128)

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在篩選免疫相關(guān)基因中的應(yīng)用

廖 青 周群麗 唐艷華 黃 鋒 許道軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙 410128)

轉(zhuǎn)錄組是細(xì)胞或組織內(nèi)全部的RNA轉(zhuǎn)錄本，可以從整體水平上反映細(xì)胞中所有基因的表達(dá)情況及其調(diào)控規(guī)律，揭示細(xì)胞和組織中的分子構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)是對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測序的技術(shù)。利用RNA-Seq技術(shù)對機體免疫相關(guān)基因進(jìn)行篩選，可為進(jìn)一步研究宿主對抗病原提供新的思路。本文主要對RNA-Seq技術(shù)、RNA-Seq測序平臺的原理及特點以及RNA-Seq技術(shù)在篩選免疫相關(guān)基因中的應(yīng)用做一概述。

RNA-Seq技術(shù) 轉(zhuǎn)錄組 免疫基因

RNA-Seq是隨著高通量測序發(fā)展起來的對整個轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析的方法，即從總RNA中富集出單鏈mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，而后對其進(jìn)行深度測序分析[1]。RNA-Seq可對任意物種的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測，通過與基因組進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，還能發(fā)現(xiàn)未知及稀有轉(zhuǎn)錄本、可變剪切、cSNP（codingregion single nucleotide polymorphism）、UTR（untranslated region）、內(nèi)含子邊界鑒定等[2]。本文主要對RNA-Seq技術(shù)、RNA-Seq測序平臺的原理及特點以及RNA-Seq技術(shù)在篩選免疫相關(guān)基因中的應(yīng)用做一概述，并對目前RNA-Seq技術(shù)目前存在的問題進(jìn)行了展望。

1 RNA-Seq測序平臺

1977年，生化學(xué)家Fred Sanger及其同事創(chuàng)建了用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止檢測DNA核苷酸序列的技術(shù)，即Sanger末端終止法[3]。另外還有傳統(tǒng)的鏈終止法，化學(xué)降解法[4]，以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展的各種DNA測序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代測序。第一代測序技術(shù)的誕生，為人類在動植物及微生物基因組的研究提供了科學(xué)的工具。但是，第一代測序檢測通量低且費時費力。因此，隨著科技的進(jìn)步，高通量測序技術(shù)即第二代測序技術(shù)問世。自2005年以來，主要有三種轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)平臺可用于RNA-Seq測序：ROCH/454 FLX測序技術(shù)、 Illumina/Solexa測序技術(shù)以及ABI/SOLiD測序技術(shù)。由于各測序技術(shù)平臺的原理及特點有差別，因此我們應(yīng)了解各高通量測序技術(shù)的優(yōu)缺點根據(jù)實驗的需要對測序平臺進(jìn)行選擇。

1.1 ROCH454 GS FLX測序

2003年，454公司首創(chuàng)了邊合成邊測序技術(shù)，推出一種新的基于焦磷酸測序法的高通量基因組測序系統(tǒng)[5]，這為新一代測序技術(shù)奠定了堅實的基礎(chǔ)。之后，ROCH收購了454公司，在此基礎(chǔ)上對測序性能進(jìn)行改造和優(yōu)化，于2008年研制出一種更加先進(jìn)的基因組焦磷酸測序系統(tǒng)——Genome Sequncer FLX System。此測序技術(shù)的流程為：①構(gòu)建測序文庫：將樣品DNA隨機切割成300-800bp的小片段并在兩端加錨定接頭。② 乳液PCR：1個DNA片段與1個磁珠結(jié)合，在一個油包水的微反應(yīng)器中進(jìn)行獨立擴增。③ GS FLX測序：將帶有擴增產(chǎn)物的磁珠放入PTP載板后上機測序，每發(fā)生1個堿基配對即產(chǎn)生1個焦磷酸，焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下產(chǎn)生熒光信號并被配套的儀器實時收集。總的來說，GS FLX的測序流程為：1個片段+1個磁珠=1個讀長。

由于454GS FLX測序平臺的測序讀長長、速度快、通量高、準(zhǔn)確率高，可以不需分離細(xì)菌直接對不能分離培養(yǎng)的微生物進(jìn)行研究。解決了復(fù)雜微生物群研究過程中的難題。因此，454測序平臺在微生物生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛。

1.2 Illumina Solexa測序

Genome Analyzer IIx是Solexa公司研發(fā)的具有“DNA簇”“可逆性末端終結(jié)”專利技術(shù)的第二代測序儀[6]。2007年被Illumina公司收購，2010年升級優(yōu)化到Hiseq2000。是目前為止，在各個領(lǐng)域中使用最多的測序平臺。此測序技術(shù)的流程為：①構(gòu)建測序文庫：將DNA隨機打斷成200～500bp的片段并在每條打斷了的DNA片段兩端加上接頭。②錨定接頭：帶接頭的DNA片段與測序通道中的單鏈接頭連接。③產(chǎn)生DNA簇：橋式PCR擴增后，測序通道表面生成DNA簇。④單堿基邊延伸邊測序：在測序通道內(nèi)加入接頭引物、DNA聚合酶以及被熒光標(biāo)記的dNTP，當(dāng)堿基延伸時釋放熒光信號并收集記錄，記錄完成后，淬滅熒光信號并進(jìn)行下一輪測序。

1.3 ABI SOLiD測序

2007年ABI公司推出了SOLiD測序系統(tǒng)。該系統(tǒng)的特點是通過DNA連接酶在連接時對待測樣品DNA進(jìn)行測序，即邊連接邊測序[7]。此測序技術(shù)的流程為：① 構(gòu)建測序文庫：與454測序類似。②乳液PCR：與454測序類似。③邊連接邊測序：在測序小孔內(nèi)加入DNA連接酶、引物以及八聚核苷酸探針。此探針的第6--8位堿基帶有熒光標(biāo)記，由于連接法測序是2堿基編碼的測序，因此，探針的第1和第2位堿基被DNA聚合酶連接上即發(fā)出熒光信號，在熒光信號記錄完成后，在探針的第5位后切斷熒光信號。之后進(jìn)行第6和第7位置的測序，每次測序位置相差5位，以此類推至DNA片段末尾。由于通用引物在第二輪測序比第一輪測序前移1位，因此要完成全部位置的測序需要5輪反應(yīng)。

這種雙堿基編碼技術(shù)以2個堿基對應(yīng)1個熒光信號，使得每個位點能被檢測兩次，大大降低了測序的錯誤率。

1.4 三種測序平臺的比較

測序情況分析詳見表1。

表1 測序情況分析表

2 RNA-Seq技術(shù)簡介

轉(zhuǎn)錄組是一個細(xì)胞或組織內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA和非編碼RNA。我們對轉(zhuǎn)錄組的研究通常是以mRNA為主。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的一項高通量測序技術(shù)[1]。與基于雜交的基因芯片技術(shù)（DNA microarray或DNA macroarray）、基于標(biāo)簽的基因表達(dá)系列分析技術(shù)（Serial analysis of gene expression，SAGE）及大規(guī)模平行信號測序技術(shù)（Massively parallel signature sequencing，MPSS）相比，RNA-Seq技術(shù)可以獲得任意物種的全基因組序列，能檢測到未知基因發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。這對未知基因組序列物種的研究尤為重要。葛怡靜等人用RNA-Seq技術(shù)對黃蜻頭部進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)黃蜻的遷飛與線粒體和代謝活動基因有關(guān)。為后續(xù)的研究提供了依據(jù)[8]。RNA-Seq技術(shù)具有高度的靈敏性，可以檢測表達(dá)量極低的轉(zhuǎn)錄本。另外，RNA-Seq技術(shù)檢測通量高，重復(fù)性好[9]。近年來，此技術(shù)廣泛應(yīng)用于動植物學(xué)研究中，為生命科學(xué)研究提供全新的角度。

RNA-Seq技術(shù)的流程為：首先提取樣品中的總RNA，將RNA富集純化后片段化處理，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（或先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA再將cDNA打碎成小片段），然后在cDNA片段兩段加上接頭，PCR擴增文庫。最后利用測序平臺獲得序列數(shù)據(jù)。具體流程如圖1：

圖1 RNA-Seq實驗流程圖

3 RNA-Seq技術(shù)在篩選免疫相關(guān)基因中的應(yīng)用

將測序獲得的原始序列信息進(jìn)行過濾后得到干凈序列再生物信息學(xué)分析，若待測物種有參考基因組則將RNA-Seq所得到的結(jié)果直接與基因組進(jìn)行比對，若無參考基因組則通過對序列進(jìn)行拼接、從頭組裝再進(jìn)行比對。從而發(fā)現(xiàn)新基因、可變剪切、重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)、獲得基因表達(dá)等結(jié)果。對基因表達(dá)的差異分析，是獲得感興趣基因的重要手段。

當(dāng)機體被細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原體感染后，機體啟動體液免疫和細(xì)胞免疫的抗感染作用，激活參與機體免疫應(yīng)答相關(guān)信號通路的細(xì)胞因子，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。有學(xué)者對雛鵝和成年鵝的脾臟進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過序列比對、GO分析及KEGG分析，發(fā)現(xiàn)大量與免疫相關(guān)的基因，其中TNFRSF13B、CCL4、CXCR4、TAP2基因表達(dá)差異及其顯著，為研究鵝免疫系統(tǒng)的分子機制奠定了基礎(chǔ)[10]。Gaur等用感染沙門氏菌的豬的脾臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的部分基因顯著上調(diào)[11]。王慧珂等用RNA-Seq技術(shù)對被APEC損傷的雛雞小腸進(jìn)行了測序分析，篩選出CCL9、DDX3X、CALB1等與免疫相關(guān)的差異基因[12]。為分析宿主抗菌感染的分子機制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。也有學(xué)者用RNA-Seq技術(shù)對被DHAV-1感染的雛鴨肝臟做了轉(zhuǎn)錄組測序分析，研究發(fā)現(xiàn)有部分免疫基因表達(dá)上調(diào)，推測上調(diào)的免疫基因可能在抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制發(fā)揮重要作用，為深入探究DHAV-1的致病機制及雛鴨機體清除病毒的機制奠定了基礎(chǔ)[13]。Mu等用RNA-Seq技術(shù)對被嗜水氣單胞菌感染大黃魚前后的脾臟做了轉(zhuǎn)錄組測序，KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異顯著表達(dá)的基因主要集中在Toll- like、JAK-STAT和MAPK等免疫信號通路[14]。Pereiro等采用RNA-Seq技術(shù)對免疫刺激后的大菱蝦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，KEGG分析在Toll- like受體、補體凝血級聯(lián)、T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體等重要的免疫信號通路中得到了很多參與免疫防御的基因[15]。這些基因的發(fā)現(xiàn)對研究魚類的免疫系統(tǒng)及抗病作用有了很大的幫助。因此，利用RNA-Seq技術(shù)對機體免疫相關(guān)基因進(jìn)行篩選，可為進(jìn)一步研究宿主對抗病原提供新的思路。

4 展望

RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展為動植物及微生物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段，但RNA-Seq能產(chǎn)生非常龐大的數(shù)據(jù)，如何借助生物信息學(xué)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘使其為后續(xù)的研究提供最大的價值，是目前來說最大的挑戰(zhàn)。相信隨著相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，RNASeq技術(shù)面臨的困難也會被解決。

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