抗生素/β-磷酸三鈣/多孔絲素蛋白支架修復(fù)兔橈骨骨缺損的實驗研究

劉欣偉，柳云恩，張玉彪，侯明曉，趙 勇，周大鵬，項良碧

·論 著·

抗生素/β-磷酸三鈣/多孔絲素蛋白支架修復(fù)兔橈骨骨缺損的實驗研究

劉欣偉，柳云恩，張玉彪，侯明曉，趙 勇，周大鵬，項良碧

目的 探討抗生素/β-磷酸三鈣/多孔絲素蛋白支架修復(fù)兔橈骨骨缺損的效果。方法 制備再生絲素蛋白膠囊型載藥人工骨修復(fù)材料，成年大白兔16只，隨機分為A組[不載藥材料：SF(多孔絲素蛋白支架)+β-TCP(β-磷酸三鈣)]、B組(載藥材料：SF+β-TCP+萬古霉素)，每組8只(16例橈骨)。橈骨構(gòu)建橈骨骨缺損模型后植入材料，于術(shù)后第28、56、84、112天觀察兔的一般情況(感染發(fā)生后退出觀察)，并在第84天和112天時隨機處死一半的兔子，觀察骨愈合的組織學(xué)表現(xiàn)。結(jié)果 A組4只兔(8例橈骨)6～7d發(fā)生感染，B組無感染發(fā)生，A組感染發(fā)生率明顯高于B組(χ2=8.167，P=0.004)；術(shù)后84d，A組2只兔(4例橈骨)及B組3只兔(6例橈骨)得到滿意骨修復(fù)效果，組織學(xué)切片觀察兩組對比無明顯差異，都可以看到新生骨質(zhì)、少量β-磷酸三鈣及絲素蛋白支架的殘余，B組1只兔(2例橈骨)出現(xiàn)雙側(cè)假關(guān)節(jié)；術(shù)后112d，A組1只兔(2例橈骨)及B組4只兔(8例橈骨)得到滿意骨修復(fù)效果，組織學(xué)切片觀察與術(shù)后84d相仿且兩組對比無明顯差異，但可見更多的新生骨質(zhì)，A組1只兔(2例橈骨)出現(xiàn)肢體屈曲痙攣，橈骨缺損修復(fù)效果不佳。結(jié)論 抗生素/β-磷酸三鈣/多孔絲素蛋白支架由于絲素蛋白的組織相容性好，多孔的結(jié)構(gòu)允許外周的干細胞，包括成骨細胞向管壁內(nèi)遷移，加之含有抗生素成分，對骨缺損修復(fù)及預(yù)防感染有較好的效果。

橈骨； 骨缺損； 抗生素； β-磷酸三鈣； 絲素蛋白； 修復(fù)； 兔

隨著我國工業(yè)、交通運輸業(yè)的發(fā)展，骨折的發(fā)生率逐年上升，在骨科醫(yī)師的臨床工作中，高能量創(chuàng)傷所致的粉碎性骨折、骨缺損治療起來較為棘手，若軟組織條件較差，加之合并開放傷口，常會合并骨感染的發(fā)生，其中一些甚至成為創(chuàng)傷骨科臨床工作中的難點[1-2]。課題組通過包裹萬古霉素及β磷酸三鈣(β-TCP)的多孔絲素蛋白制備的抗生素/β-磷酸三鈣/多孔絲素蛋白支架進行了修復(fù)兔橈骨骨缺損的研究，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 主要試劑

碳酸氫鈉(NaHCO3)，溴化鋰(LiBr)，正丁醇(C4H9OH)，無水乙醇(C2H5OH)，氫氧化鈉(NaOH)，醋酸(CH3COOH)，透析袋(再生纖維素)，聚乙二醇(PEG)，鹽酸萬古霉素，β-磷酸三鈣(β-TCP)，試劑由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部提供。

2 實驗方法

2.1 β-TCP的多孔絲素蛋白膠囊的制備 將濃度為10wt%的絲素蛋白液在室溫環(huán)境(25℃左右)進行攪拌，攪拌后按照2∶1的體積比加入正丁醇，繼續(xù)穩(wěn)定2min。將絲素蛋白/正丁醇混合液倒入預(yù)先準備好的模具中，置于控-20℃冰箱內(nèi)冷凍24h。之后給予解凍，得到粗糙的絲素蛋白多孔支架。再將其浸入去離子水中，經(jīng)過多次洗滌將其中的正丁醇去除，得到白色提純后的絲素蛋白多孔支架。再置入-70℃冰箱中進行冷凍干燥后將其切割成1.5cm備用。

利用球磨儀將β-磷酸三鈣(β-TCP)和萬古霉素以質(zhì)量比1∶4的配比進行混合攪拌。再將萬古霉素/β-磷酸三鈣混合物鋪滿多孔絲素蛋白支架，在該支架的兩端通過絲素蛋白溶液進行薄膜化封堵，干燥后得到了本研究中使用的抗生素/β-磷酸三鈣/多孔絲素蛋白支架。

2.2 材料的體內(nèi)植入實驗 (1)兔橈骨大段骨缺損建模：取成年大白兔16只，雌雄不限，10周齡，體重(2.5±0.3)kg，橈骨長(57±3.5)mm。所有動物均經(jīng)檢查證實無外傷、四肢畸形、感染、腹瀉等異常情況。給予3%戊巴比妥鈉按30mg/kg于耳緣靜脈進行麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒、鋪無菌手術(shù)單，取雙前臂內(nèi)側(cè)切口，逐層分離并顯露橈骨干，于橈骨中段以線鋸將尺橈骨磨斷，在鋼尺測量下造成長1.5cm骨缺損模型。(2)骨缺損修復(fù)：A組僅在絲素蛋白膠囊中加入β-TCP；B組植入包裹萬古霉素及β-TCP的多孔絲素蛋白膠囊(SF+β-TCP+萬古霉素)。按隨機數(shù)字表法隨機選取16只兔，其中A、B組各8只。再以解剖復(fù)位的方式將骨折端對位對線良好，將1.5cm大小的管狀材料崁入骨折端，骨折端與植入材料間貼合完好，無軟組織及凝血塊嵌入，生理鹽水反復(fù)沖洗傷口，全層縫合皮膚及皮下組織。為防止干擾B組中萬古霉素預(yù)防感染的效果，并考慮手術(shù)為無菌操作，兔子手術(shù)后傷口局部不予外敷抗生素粉末，術(shù)后全部兔均予常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后觀察護理，于術(shù)后84、112d隨機處死一半的動物并進行觀察。

2.3 觀察指標 (1)一般情況及感染情況觀察：待兔于手術(shù)麻醉蘇醒后，對兔的生存、進食、傷口愈合包括傷口紅腫、流膿等情況、精神狀態(tài)、活動等情況進行觀察并記錄。(2)通過HE染色觀察骨修復(fù)情況：對骨愈合端處的組織進行固定、脫鈣、石蠟包埋，HE染色觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用χ2檢驗。P<0.05認為統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異。

結(jié) 果

全部16只兔術(shù)后30min內(nèi)均正常蘇醒，未出現(xiàn)因麻醉原因?qū)е碌乃劳觥Ｖ列g(shù)后2d，均恢復(fù)正常精神狀態(tài)及喂食。按照傷口紅腫、持續(xù)滲液、流膿作為感染評判標準，感染發(fā)生后即退出研究。A組4只兔(8例橈骨)6～7d發(fā)生感染，B組無感染發(fā)生，A組感染發(fā)生率明顯高于B組(χ2=8.167，P=0.004)；術(shù)后84d，A組2只兔(4例橈骨)及B組3只兔(6例橈骨)得到滿意骨修復(fù)效果，組織學(xué)切片觀察兩組對比無明顯差異，都可以看到新生骨質(zhì)、少量β-磷酸三鈣及絲素蛋白支架的殘余，B組1只兔(2例橈骨)出現(xiàn)雙側(cè)假關(guān)節(jié)；術(shù)后112d，A組1只兔(2例橈骨)及B組4只兔(8例橈骨)得到滿意骨修復(fù)效果，組織學(xué)切片觀察與術(shù)后84天相仿且兩組對比無明顯差異，但可見更多的新生骨質(zhì)，A組1只兔(2例橈骨)出現(xiàn)肢體屈曲痙攣，橈骨缺損修復(fù)效果不佳;見圖1。

a b c d

圖1 a、b.A組、B組術(shù)后84d橈骨得到滿意骨修復(fù)效果，可以觀察到新生骨質(zhì)，少量三磷酸鈣及絲素蛋白支架的殘余；c、d.A組、B組術(shù)后112d可見更多的新生骨質(zhì)

討 論

隨著社會工業(yè)、交通運輸業(yè)的發(fā)展，骨折的發(fā)生率亦逐年上升，在各種骨折類型中，粉碎性骨折合并骨缺損一直以來是骨科醫(yī)師需經(jīng)常面臨的棘手問題，以往是利用自體骨、同種異體骨等方法來解決骨缺損的重建[3-4]。然而，這些傳統(tǒng)的植骨方式各有利弊，自體骨來源有限，且增加了對患者的創(chuàng)傷，供骨區(qū)常會發(fā)生疼痛、瘢痕等并發(fā)癥，增加了患者心理、生理負擔；同種異體骨涉及到排異反應(yīng)且價格不菲，一定程度上限制了其應(yīng)用。另外，高能量損傷往往合并不同程度的軟組織損傷甚至開放性損傷，這大大增加了感染的風險，而涉及到內(nèi)植物的感染若發(fā)展成骨髓炎，其結(jié)果將是災(zāi)難性的，因此，預(yù)防感染亦是內(nèi)固定手術(shù)治療骨折中不可忽視的一個重要問題[5-6]。鑒于骨缺損、骨感染均為骨科醫(yī)師在臨床中需經(jīng)常面對的棘手問題，多年來，學(xué)者們一直在進行探索，伴隨著新能源、新材料開發(fā)步伐的不斷加速，組織工程技術(shù)的出現(xiàn)及進步為解決此類難題提供了新的方向。組織工程的相關(guān)領(lǐng)域主要針對生物材料研發(fā)、組織和器官的構(gòu)建方法及技術(shù)、干細胞應(yīng)用、組織工程的臨床應(yīng)用，其中生物材料的開發(fā)隨著材料學(xué)的發(fā)展有了日新月異的進步[7-10]。

近年來，天然大分子生物材料以其生物相容性的優(yōu)勢成為組織工程研究中生物材料的熱點，學(xué)者們對蠶絲素蛋白、殼聚糖、海藻酸等進行了研究[11-12]。我國將蠶絲用作紡織材料有悠久的歷史，絲素蛋白(又名絲素蛋白)是蠶絲的重要組成成分，結(jié)構(gòu)主要包括高度有序的β-sheet結(jié)晶區(qū)和半結(jié)晶區(qū)(體現(xiàn)蠶絲的彈性)，其二級結(jié)構(gòu)具有很好的穩(wěn)定性和優(yōu)良的機械性能，由于其良好的生物學(xué)特性、環(huán)境穩(wěn)定性及友好性，便于分子操作，使得其近年來成為組織工程生物材料的研究熱點之一[13-15]。β-磷酸三鈣(β-TCP)作為生物支架材料是細胞黏附、生長和礦化的平臺，其在體內(nèi)可通過體液溶解后被機體吸收，在這個過程中完成新生骨的替代過程，且其溶解后的組織液中富含鈣質(zhì)，給成骨細胞的成骨作用很好地提供了原料，在組織工程研究中已被學(xué)者廣泛認同[16]。

課題組結(jié)合多年的創(chuàng)傷骨科臨床體會，在組織工程研究平臺的基礎(chǔ)上開發(fā)了多孔絲素蛋白并將其制備成中空結(jié)構(gòu)，其內(nèi)填充萬古霉素及β-TCP，利用其多孔性原理實現(xiàn)了萬古霉素的緩釋作用及鈣鹽的緩慢降解、釋放及吸收。β-TCP能夠在成為成骨細胞支架的同時為骨缺損修復(fù)提供原料，同時膠囊緩釋的萬古霉素也能夠起到預(yù)防感染的作用。本次實驗也表明：該材料組織相容性較好，在該中空管狀多孔支架內(nèi)填充β-TCP和萬古霉素，用來修復(fù)大段的兔骨缺損，其原理不似以往的自體骨及同種異體骨植骨，但也能取得較好的骨修復(fù)效果，同時其預(yù)防感染效果亦較為明顯。本研究中的12周和16周組織學(xué)觀察的結(jié)果中均可以看到新生的骨、殘余的磷酸三鈣，骨修復(fù)效果良好，其可能原因是因為在多孔絲素蛋白較好的組織相容性及緩釋效果的基礎(chǔ)上，為骨修復(fù)提供了原料，并且其多孔結(jié)構(gòu)允許外周的組織細胞包括成骨細胞通過管壁向內(nèi)進行爬行替代，從而完成骨缺損的修復(fù)。

綜上所述，包裹萬古霉素及β-TCP的多孔絲素蛋白膠囊由于其組織相容性、緩釋作用、多孔的結(jié)構(gòu)等特點，對骨缺損修復(fù)及預(yù)防感染有較好的效果，這為將來臨床上治療骨缺損及預(yù)防感染提供了新的思路。

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(本文編輯： 黃利萍)

Experimental study of antibiotics/three calcium phosphate/porous silk fibroin scaffold repairing rabbit radial bone defect

LIUXin-wei1,2,LIUYun-en2,ZHANGYu-biao2,HOUMing-xiao2,ZHAOYong1,ZHOUDa-peng1,XIANGLiang-bi1

(1.Department of Orthopedics,General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA, Shenyang 110016，China; 2.Laboratory of Severe Wound and Trauma of Chinese PLA, Shenyang 110016,China)

Objective To investigate the effect of antibiotics/three calcium phosphate/porous silk fibroin scaffold repairing rabbit radial bone defect. Methods Regenerated silk fibroin capsules for artificial bone repair materials were prepared. Sixteen adult white rabbits were randomly divided into group A (SF+beta TCP for repairing bone defect) and group B (SF+beta TCP+vancomycin for repairing bone defect). There were 8 rabbits (16 radius) in each group. Radial bone defect model was constructed after implanting materials. The rabbits were executed at 28,56,84 and 112 days postoperatively to observe the general situation. If infection occurred,rabbits were withdrawn from the observation. Half of the rabbits were executed after 84 and 112 days to observe the histologic findings of bone healing. Results Four rabbits in group A (8 cases of radius) occurred infection about 6 to 7 days after operation. Cases in group B were without infection,The incidence of infection in group A was significantly higher than that in group B(χ2=8.167，P=0.004). Bone repair effect in 2 rabbits in group A(4 cases of radius) and 3 rabbits in group B(6 cases of radius) was satisfactory. There was no significant difference between the two groups in the histological observation. Histological observation can see the new bone,a small amount of β-three calcium phosphate and silk fibroin scaffold residues,but 1 rabbit in group B was with bilateral false joints after 84 days. After 112 days,bone repair effect in 1 rabbit in group A(2 cases of radius) and 4 rabbits in group B(8 cases of radius) was satisfactory,Histological section observation result was similar to that after 84 days and no significant difference between the two groups,but more new bone mass was seen,only 1 rabbits in group A occurred buckling spasm. Conclusion Antibiotics/three calcium phosphate/porous silk fibroin scaffold has good histocompatibility. Porous structure allows peripheral stem cells,including osteoblasts to move within the tube wall. Also,it contains antibiotics. All these are good for bone defect repair and infection prevention.

radius; bone defect; antibiotics; β-three calcium phosphate; silk fibroin; repair; rabbits

1009-4237(2017)02-0114-04

國家自然科學(xué)基金青年基金(81401586)；全軍十二五面上項目(CSY12J002)

110016 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科(劉欣偉，趙勇，周大鵬，項良碧)，全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實驗室(劉欣偉，柳云恩，張玉彪，侯明曉)

周大鵬，E-mail：me3210@163.com

R 683.41

A 【DOI】 10.3969/j.issn.1009-4237.201.02.009

2016-02-01)