金耳發(fā)酵液多糖的制備、分析及生物活性研究

鄧 超， 付海田， 尚京迎， 喬祉琦， 趙 楚， 陳敬華*

金耳發(fā)酵液多糖的制備、分析及生物活性研究

鄧 超1， 付海田2， 尚京迎2， 喬祉琦1， 趙 楚1， 陳敬華*2

（1.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫214122）

探討了金耳發(fā)酵液多糖的化學(xué)成分和生物活性。通過液體發(fā)酵法獲得了金耳發(fā)酵液多糖，分別采用苯酚硫酸法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）、凝膠滲透色譜（GPC）、紅外光譜對(duì)其總糖含量、單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量、糖苷鍵類型進(jìn)行測(cè)定。此外，對(duì)金耳發(fā)酵液多糖的體外抗氧化和體內(nèi)降血糖活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，金耳發(fā)酵液多糖總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.85%，主要的單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，相對(duì)分子質(zhì)量為14 000，主鏈以β糖苷鍵相連。具有一定的還原能力以及較強(qiáng)的清除DPPH和羥基自由基活性，可顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖含量。

金耳；發(fā)酵；多糖；制備；化學(xué)分析；生物活性

金耳，俗稱腦耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門，銀耳目、銀耳科、銀耳屬，主要分布于中國(guó)云貴高原，是一種稀有的珍貴藥食用真菌。近年來，對(duì)金耳多糖的研究主要集中于子實(shí)體多糖的生物活性方面。如Kiho等發(fā)現(xiàn)腹腔注射金耳子實(shí)體水溶性多糖和醇溶多糖對(duì)正常小鼠，鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠以及基因缺陷型糖尿病小鼠均具降血糖作用[1-2]。杜秀菊等研究結(jié)果表明，金耳子實(shí)體氯仿提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞株L1210和SW 620的抑制作用效果最好并且是其抗氧化活性的主要有效成分，而乙醇提取物是保護(hù)PC12細(xì)胞氧化損傷的主要有效成分[3-4]。陳龍等報(bào)道，金耳提取液具有較強(qiáng)的自由基清除能力和 Fe3+還原能力，其中對(duì) DPPH與O2－的清除能力較強(qiáng)，對(duì)羥基自由基的清除能力較弱[5]。苑小林等研究發(fā)現(xiàn)，金耳子實(shí)體多糖對(duì)移植性人肺腺癌（AX-83）有顯著抑制作用[6]。然而，由于金耳子實(shí)體的栽培周期長(zhǎng)，產(chǎn)量較小，易受季節(jié)影響以及病蟲害的侵襲，質(zhì)量不可控，使得從子實(shí)體中提取多糖缺少商業(yè)可行性。而液體發(fā)酵技術(shù)可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、規(guī)模大、周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、不受環(huán)境和季節(jié)的影響。因此，金耳的研究逐漸轉(zhuǎn)向于發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性方面。如張?chǎng)┑妊芯堪l(fā)現(xiàn)，金耳菌絲體多糖腹腔注射正常小鼠12 d，或用金耳菌絲體多糖灌胃四氧嘧啶致高血糖大鼠7 d和23 d，都可降低其血糖水平[7]。劉春卉等報(bào)道，金耳菌絲發(fā)酵物能夠顯著對(duì)抗小鼠體內(nèi)血栓形成，抑制腦組織缺血時(shí)過氧化脂質(zhì)分解產(chǎn)物丙二醛含量增加，明顯抑制二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板凝集，延長(zhǎng)動(dòng)物凝血酶原的作用時(shí)間，給藥5 min后能明顯增加動(dòng)物腦膜的血流量[8]。

此外，多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，不同來源的金耳多糖，同一來源通過不同提取方法得到的金耳多糖，具有各種不同的單糖組成、不同的糖苷鍵類型，不同的相對(duì)分子質(zhì)量、能形成不同的構(gòu)象，從而影響其生物活性。因此，作者通過液體培養(yǎng)獲得了金耳發(fā)酵液多糖，對(duì)其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，并比較了發(fā)酵液粗多糖和純化后多糖的體外抗氧化活性和體內(nèi)降血糖活性，為金耳資源的可持續(xù)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種和動(dòng)物 金耳 （Tremella aurantialba）斜面菌種：中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（編號(hào)：50347）；健康昆明小鼠（清潔級(jí)，雄性，4-5周齡，體重 （20±2）g）：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司（SCXK（滬）2007-0005）。

1.1.2 試劑 乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、鹽酸、鹽酸羥胺、肌醇、乙酸酐、考馬斯亮藍(lán)、葡萄糖、KH2PO4、牛血清蛋白、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氟乙酸、乙二胺四乙酸、H2O2、水楊酸鈉、冰醋酸、甲酰胺、四氧嘧啶、分子篩（4A）：國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；1-二甲基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗壞血酸（VC）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，自然pH值；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，VB1 1~2 mg/dL，自然pH值。

1.1.4 儀器與設(shè)備 精密電子天平：美國(guó)Mettler Toledo公司產(chǎn)品；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品：立式壓力蒸汽滅菌鍋、生物潔凈工作臺(tái)、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀QP2010s、紫外可見分光光度計(jì)：島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司產(chǎn)品；紅外光譜儀： 美國(guó) Thermo Electron公司產(chǎn)品；FreeZone2.5L冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司產(chǎn)品；HEA-230血糖儀：歐姆龍中國(guó)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 金耳發(fā)酵液多糖的制備

1）金耳發(fā)酵 將保存于冰箱中的斜面菌種接種至平板PDA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7~10 d，使菌種恢復(fù)到正常生理狀況。將平板菌種分割成黃豆大的小塊，取3~4塊接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)10~14 d[9]。

2）金耳發(fā)酵液多糖的提取 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抽濾分離發(fā)酵液和菌絲體，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將金耳發(fā)酵液濃縮至原有體積的1/5，加入無水乙醇（V（發(fā)酵濃縮液）∶V（乙醇）=1∶4），4℃靜止過夜，離心收集沉淀，加去離子水復(fù)溶后采用Sevage法脫蛋白，分離得到上清液后再次用無水乙醇沉淀，收集沉淀物后經(jīng)冷凍干燥得金耳粗多糖（CLQP）。

3）金耳粗多糖的純化 金耳粗多糖用去離子水溶解至質(zhì)量濃度為5 mg/mL，選取1 cm×30 cm玻璃柱為層析柱，以Sephadex G-100葡聚糖凝膠為固定相，0.1 mol/L的NaCl溶液為流動(dòng)相，上樣量1 mL，全自動(dòng)部分收集器控制流動(dòng)相速度為1.5 min/管，0.75 mL/管，收集流出液。以苯酚-硫酸法監(jiān)測(cè)收集液吸光值，結(jié)束后以洗脫體積為橫坐標(biāo)，收集液吸光值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。合并單峰位置收集液，透析除鹽后冷凍干燥，得到純化后的金耳發(fā)酵液多糖（LQP）。

1.2.2 金耳發(fā)酵液多糖的化學(xué)分析

1）粗多糖產(chǎn)量測(cè)定 發(fā)酵液粗多糖產(chǎn)量（mg/ L）＝發(fā)酵液粗多糖質(zhì)量（mg）/發(fā)酵液體積（L）×100%

2）蛋白質(zhì)含量的檢測(cè) 多糖中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

3）全波長(zhǎng)掃描檢測(cè) 用去離子水溶解各種真菌多糖配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的多糖溶液，在200~800 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

4）總糖含量測(cè)量 多糖中總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。

5）多糖的單糖組成分析 稱取20 mg多糖置于水解管中，加入2 mL濃度為1 mol/L的H2SO4溶液并封管，置于100℃恒溫水浴鍋水解4 h，水解液用過量BaCO3中和，8 000 r/min離心15 min，收集上清液冷凍干燥或置真空烘箱45℃下真空干燥，得到的干燥物即為游離單糖。

衍生化：稱取上述干燥單糖樣加入10 mg鹽酸羥胺，如要定量加入2 mg肌醇作為內(nèi)標(biāo)，0.5 mL吡啶，于90℃水浴中保持30 min；取出冷卻后加入0.5 mL乙酸 酐于90℃水浴中保持30 min，待樣品冷卻后進(jìn)行GC分析。

色譜分析條件：采用OV1701石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；檢測(cè)器為FID（氫火焰離子鑒定器）；氣化室溫度：260℃，檢測(cè)器溫度：250℃；柱溫升溫程序：起始溫度120℃，保持3 min，以10℃/ min升溫至195℃，保持0.1 min后，再以3℃/min升溫至240℃，保留10 min；載氣壓力（N2）：0.60 kg/ cm2；燃?xì)鈮毫Γ℉2）：0.65 kg/cm2；助燃?xì)鈮毫Γ諝猓?.50 kg/cm2，分流比：30∶1，進(jìn)樣量：2.0 μL。

6）多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 稱取適量干燥多糖樣品溶于去離子水得到樣品質(zhì)量濃度為 1 mg/ mL的多糖水溶液，過 0.45 μL微孔水系濾膜后用凝膠滲透色譜法（GPC）測(cè)定多糖樣品重均相對(duì)分子質(zhì)量。

GPC分析條件：流動(dòng)相為 0.1 mol/L NaNO3溶液，流量為0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

7）多糖的紅外分析 室溫條件下，將2 mg左右的干燥多糖樣品與200 mg干燥溴化鉀混合研磨壓片后，在4 000~500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行FTIR分析。

1.2.3 金耳發(fā)酵多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1）還原力測(cè)定 在試管中分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的金耳發(fā)酵液多糖樣品（50、100、200、400、1 000 μg/mL）、0.2 mL濃度為2.0 mol/L的PBS（pH 6.6）和0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液。置50℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，迅速冷卻，再加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，3 000 g離心10 min，取上清液1.5 mL，加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯化鐵溶液和3 mL去離子水，振蕩均勻，靜置5 min，在700 nm處以蒸餾水代替多糖溶液為空白測(cè)定其吸光值[10]。

2）清除DPPH活性的測(cè)定 試管中加入1 mL不同濃度的多糖溶液 （50、100、200、400、1 000 μg/ mL）與3.0 mL溶于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇的0.004% DPPH溶液，室溫靜置30 min后，517 nm處測(cè)定吸光值。清除DPPH的公式為：清除率（%）=（1-（A1-A2）/A0）×100；式中A1為多糖樣品溶液吸光值；A2為95%乙醇代替DPPH時(shí)的吸光值；A0為蒸餾水代替多糖溶液是的吸光值[11]。

3）清除羥基自由基活性的測(cè)定 在試管中依次加入1mL不同濃度的金耳發(fā)酵液多糖樣品（50、100、200、400、1 000 μg/mL）、0.9 mL的FeSO4（0.15 mmol/L），0.5 mL水楊酸 （9 mmol/L）、0.5 mL H2O2（8.8 mmol/L），37℃反應(yīng)60 min，于510 nm處測(cè)吸光值。清除·OH的公式為：清除率（%）=（1-（A1-A2）/A0）×100；式中A1為多糖樣品溶液吸光值；A2為水楊酸代替H2O2時(shí)的吸光值，A0為水楊酸替代多糖測(cè)得的空白對(duì)照吸光值[12]。

1.2.4 金耳發(fā)酵液多糖的降血糖作用

1）糖尿病小鼠動(dòng)物模型的建立 小鼠飼養(yǎng)溫度25℃，相對(duì)濕度55%，自由進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng) 。禁食（16 h）不禁水后，小鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%四氧嘧啶生理鹽水溶液（200 mg/kg），72 h后，斷尾取血，測(cè)空腹血糖，其值≥11.1mmol/L者為造模成功小鼠[13]。

2）分組和給藥 選取糖尿病模型小鼠 50只，隨機(jī)分為5組，分別作為模型對(duì)照組、CLQP高劑量組（200 mg/（kg·d））和低劑量組（50 mg/（kg·d））、LQP高劑量組和低劑量組，另取10只正常未做誘導(dǎo)處理的小鼠作為空白對(duì)照組。其中實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃上述劑量的多糖溶液14 d，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h，尾部取血測(cè)定空腹血糖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 金耳發(fā)酵液多糖的制備

2.1.1 金耳發(fā)酵 圖1（a）為平板固體培養(yǎng)基中金耳菌絲生長(zhǎng)形態(tài)，可知金耳菌絲在平板中的生長(zhǎng)特征為：白色、不透明、表面無光澤的絲狀圓形菌落。圖1（b）顯示金耳菌絲體在液體培養(yǎng)基中為金黃色球狀顆粒，分散性良好，發(fā)酵液澄清透明，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)顏色逐漸加深。

圖1 平板中的金耳菌和搖瓶培養(yǎng)基中的菌絲體Fig.1 T.aurantialba in the plate culture and the mycelium in the shake-flask liquid culture

平板中金耳菌的生長(zhǎng)曲線和搖瓶液體培養(yǎng)基中菌絲體的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。平板中的金耳菌落半徑會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在14 d時(shí)長(zhǎng)滿整個(gè)平板。在液體培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體生物量增加，至第10 d時(shí)生物量達(dá)到0.68 g/ dL，之后趨于平穩(wěn)并有下降的趨勢(shì)。

2.1.2 金耳發(fā)酵多糖的提取和純化 CLQP的產(chǎn)量約為66 mg/L，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.43%，殘留蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 22.5%。經(jīng) Sevage法脫蛋白處理和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱純化后，LQP總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.85%。圖3為金耳發(fā)酵液多糖的洗脫曲線，從圖中看出，洗脫曲線洗脫峰單一，對(duì)稱形較好，說明樣品純度比較高。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得LQP中殘留蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%，可能是樣品中蛋白質(zhì)與多糖緊密結(jié)合的糖蛋白。圖4為L(zhǎng)QP在200~800 nm范圍內(nèi)的全波長(zhǎng)掃描圖，可知在260 nm處和280 nm處均無明顯吸收，即LQP中核酸和蛋白質(zhì)含量極低。

圖2 平板中金耳菌的生長(zhǎng)曲線和搖瓶培養(yǎng)基中菌絲體的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of T.aurantialba in the plate culture and its mycelium in the shake-flask liquid culture

圖3 發(fā)酵液多糖的洗脫曲線Fig.3 Elution curve of polysaccharides

圖4 LQP全波長(zhǎng)掃描圖Fig.4 Full wave scanning of LQP

2.2 多糖的組成和結(jié)構(gòu)初步分析

2.2.1 單糖組成分析 選取常見的6種標(biāo)準(zhǔn)單糖作為對(duì)照品來進(jìn)行分析，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間見表1。圖5為L(zhǎng)QP乙?；幚砗驡C色譜圖，LQP的單糖組成及含量結(jié)果見表2，其主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。圖譜中在15.604 min出現(xiàn)的峰可能是一種不常見的單糖。

圖5 LQP的GC圖譜Fig.5 GC spectrum of LQP

表1 標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰時(shí)間Table 1 Migration time of monosaccharide standards

表2 LQP的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of LQP

2.2.2 多糖相對(duì)分子質(zhì)量 多糖的相對(duì)分子質(zhì)量很大程度上決定了多糖的生物活性，因?yàn)橄鄬?duì)分子質(zhì)量直接影響物質(zhì)的水溶性和高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。經(jīng)GPC檢測(cè)，LQP的相對(duì)分子質(zhì)量為14 000。

2.2.3 紅外分析 圖6為L(zhǎng)QP的紅外光譜。在3 600~3 200 cm-1之間出現(xiàn)的寬峰，主要是O-H的伸縮振動(dòng)引起的，表明多糖樣品中均存在分子內(nèi)和分子間氫鍵；在2 930 cm-1處的吸收峰是由C-H伸縮振動(dòng)引起的，該峰為糖類物質(zhì)的特征吸收峰；在1 640 cm-1處的吸收峰是羰基上C=O的伸縮振動(dòng)峰，說明多糖樣品中含有羰基；在3 000~2 500 cm-1之間除C-H伸縮振動(dòng)峰以外，無明顯的羧基振動(dòng)峰，說明多糖樣品中糖醛酸含量較少，主要成分為中性多糖，在1 100~1 010 cm-1區(qū)域之間，多糖有兩個(gè)明顯的吸收峰，這兩個(gè)吸收峰為D-吡喃糖苷的特征吸收峰。此外，多糖在890 cm-1處的吸收峰說明多糖是以β糖苷鍵相連的。

圖6 LQP的紅外光譜Fig.6 FTIR spectrum of LQP

2.3 金耳發(fā)酵多糖體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 還原力測(cè)定 鐵氰化鉀K3Fe（CN）6可被還原試劑還原成亞鐵氰化鉀K4Fe（CN）6，K4Fe（CN）6可與Fe3+作用生成普魯士藍(lán)，普魯士藍(lán)在700 nm處有最大吸收值，可間接的反映樣品的還原力，吸光值越大，還原力越高[14]。

由圖7（a）可知，CLQP和LQP的還原能力隨多糖質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為50~400 μg/mL時(shí)，兩者的還原能力無明顯差異；多糖質(zhì)量濃度大于400 μg/mL后，LQP還原能力的增長(zhǎng)幅度大于CLQP；當(dāng)質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，CLQP和LQP的還原力均達(dá)到最高，其中LQP的還原力（A700為0.260）略高于CLQP（A700為0.216）。

2.3.2 清除DPPH活性的測(cè)定 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在可見光區(qū)517 nm有最大吸收峰，抗氧化劑與DPPH反應(yīng)，DPPH溶液變色程度反應(yīng)了提取物的清除能力。這一反應(yīng)已被廣泛用于測(cè)試化合物自由基清除能力和評(píng)價(jià)食品、植物提取物的抗氧化活性。

由圖7（b）可看出，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，CLQP和LQP對(duì)DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)較為明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中LQP清除DPPH自由基活性在50~1 000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均明顯高于CLQP。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL時(shí)，兩者的DPPH自由基清除能力均達(dá)到最大，其中CLQP為41.62%，LQP為74.74%。

2.3.3 清除羥基自由基活性的測(cè)定 利用H2O2和Fe2+混合反應(yīng)Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的·OH，在該體系內(nèi)加入水楊酸鈉可捕捉·OH并產(chǎn)生深色物資，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收。多糖對(duì)羥基自由基清除率隨樣品濃度的變化趨勢(shì)見圖7C。由圖可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，CLQP和LQP對(duì)羥基自由基清除能力呈明顯的增長(zhǎng)，其變化趨勢(shì)類似多糖對(duì)DPPH自由基清除能力。LQP的清除能力明顯強(qiáng)于CLQP。從以上3組抗氧化試驗(yàn)結(jié)果可看出，純化后金耳發(fā)酵液多糖的抗氧化活性強(qiáng)于金耳發(fā)酵液粗多糖，由于上述兩種多糖在總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)上有巨大差異，推測(cè)金耳多糖抗氧化活性的強(qiáng)弱與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)。

圖7 金耳發(fā)酵液多糖抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of polysaccharides from fermented T.aurantialba

2.4 金耳發(fā)酵液多糖的降血糖作用

四氧嘧啶對(duì)胰島β細(xì)胞具有特殊的破壞作用，使胰島分泌功能受到損傷[15]，從而引起動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性糖尿病，血糖含量不能正常降低。造模后，小鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食等明顯的糖尿病癥狀且血糖明顯升高。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，模型組小鼠的血糖水平無明顯變化（在12 mmol/L左右）。給藥14 d后，金耳發(fā)酵多糖對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠空腹血糖的作用見圖8。從圖中可看出，與模型組相比，CLQP和LQP均可顯著降低小鼠血糖含量（P<0.05），高劑量組的效果強(qiáng)于低劑量組，但未達(dá)到空白對(duì)照組血糖水平（P<0.05）。當(dāng)劑量相同時(shí)，LQP的降血糖作用大于CLQP（P<0.05）。

圖8 金耳發(fā)酵液多糖的降血糖作用Fig.8 Hypoglycemic function of polysaccharides from fermented T.aurantialba

3 結(jié)語

通過液體發(fā)酵法收集金耳發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)濃縮后醇沉得到CLQP，再經(jīng)Sevage法脫蛋白、蒸餾水透析，葡聚糖凝膠層析、冷凍干燥一系列處理過程最終獲得LQP。同時(shí)，對(duì)CLQP和LQP的體外抗氧化和體內(nèi)降血糖活性進(jìn)行了研究。CLQP產(chǎn)率為66 mg/L，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)14.43%，殘留蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.5%；LQP總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.85%，殘留蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%，相對(duì)分子質(zhì)量為14 000，主鏈以β糖苷鍵相連，主要的單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示，CLQP和LQP均具有一定的還原能力以及較強(qiáng)的清除DPPH和羥基自由基活性，但在還原力方面兩者只有在多糖質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)有略微差異，而在清除DPPH和羥基自由基活性方面，LQP明顯強(qiáng)于CLQP。此外，CLQP和LQP均可顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖含量。金耳發(fā)酵液多糖具有的抗氧化和降血糖活性，為金耳的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Preparation，Chemical Analysis and Biological Activity of Polysaccharides from Fermented Tremella aurantialba

DENG Chao1， FU Haitian2， SHANG Jingying2， QIAO Zhiqi1， ZHAO Chu1， CHEN Jinghua*2
（1.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The study aimed to investigate chemical constituents and biological activities of the polysaccharides from Tremella aurantialba.The polysaccharides were first produced by liquid fermentation.Then the content of total sugar，monosaccharide composition，molecular weight and the type of glycosidic bonds were analyzed by the phenol-sulfuric acid method，GC-MS，GPC and FTIR，respectively.In addition，antioxidant and hypoglycemic activities were investigated.Results showed that the content of total sugar and the molecular weight of the polysaccharides were 85.85% and 1.4×104g/mol.The monosaccharides primarily included mannose，glucose and galactose and the backbone of the polysaccharides was connected with β-glucosidic bonds.In vitro antioxidant activities such as the reduction capacity，DPPH and hydroxyl scavenging activities were observed and the polysaccharides also significantly reduced the blood glucose of diabetic mice induced by alloxan.

Tremella aurantialba，fermentation，polysaccharide，preparation，chemicalanalysis，biological activity

R 285.5

A

1673—1689（2017）01—0067—07

2015-03-05

教育部博士點(diǎn)基金（博導(dǎo)類）資助項(xiàng)目（20110093110008）。

鄧 超（1972—），男，江蘇無錫人，副教授，主要從事天然產(chǎn)物的提取及活性評(píng)價(jià)研究。E-mail：jscdcdjl@163.com

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，主要從事生物大分子和生物功能材料研究。E-mail：jhchenwhut@126.com

鄧 超，付海田，尚京迎，等.金耳發(fā)酵液多糖的制備、分析及生物活性研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（01）：67-73.