免疫組化技術、原位雜交技術用于結核病診斷中的價值評價

喻永洋

免疫組化技術、原位雜交技術用于結核病診斷中的價值評價

喻永洋

目的 探究免疫組化技術、原位雜交技術用于結核病診斷中的應用價值,評價其效果。方法 結核病患者142例作為結核病組,另選取100例進行健康體檢的志愿者作為健康組。結核病組患者隨機分為A、B組,各71例,A組進行免疫組化技術診斷,B組進行原位雜交技術診斷,觀察兩種方法在顯微鏡下的病變形態(tài),比較兩種診斷方法的檢測陽性率。結果 A組和健康組的陽性率分別為87.32%、6.00%,B組和健康組的陽性率分別為97.18%、2.00%。B組診斷結核病的陽性率高于A組,差異具有統計學意義 (χ2=4.829,P＜0.05)。結論 免疫組化技術、原位雜交技術都是結核病診斷較好的手段,但原位雜交技術診斷結核病的陽性率高于免疫組化技術,具有臨床推廣價值。

免疫組化技術 ； 原位雜交技術 ；結核?。?診斷

結核病主要是由于結核桿菌侵襲患者機體臟器引起的慢性傳染病,其中以肺部感染最為常見。結核桿菌感染患者后,使患者機體抵抗力降低,出現發(fā)熱、乏力、消瘦、呼吸困難等各種疾病,嚴重者會引發(fā)患者發(fā)生肺癌等疾病,影響患者的生命安全和身體健康。有研究表明,早期對患者進行治療,能有效降低患者的感染率,縮短傳染期,降低復發(fā)率,因此尋找一種準確可靠的診斷方法具有至關重要的意義。本次研究對比了免疫組化技術和原位雜交技術在診斷結核病中的效果,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年12月～2016年3月本院收治的明確診斷為結核病的患者142例作為結核病組,另選取100例在本院進行健康體檢的志愿者作為健康組。本次研究經過患者及志愿者本人同意并經過本院倫理委員會批準進行。健康組,男56例,女44例,年齡21～73歲,平均年齡(41.29±10.58)歲。142例結核病組患者隨機分為A、B組,各71例,其中A組：男41例,女30例,年齡23～72歲,平均年齡(48.73±8.76)歲,病程1～6個月,平均病程(3.91±0.72)個月,結核感染部位：肺結核37例、淋巴結核21例、其他13例；B組：男39例,女32例,年齡24～71歲,平均年齡(47.88± 7.93)歲,病程1～5個月,平均病程(3.77±0.48)個月,結核感染部位：肺結核39例、淋巴結核18例、其他14例；A、B兩組患者的性別、年齡及結核感染部位比較,差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 檢驗方法

1.2.1 A組 行免疫組織化法：①石蠟標本制作：將結核病組和健康組標本取樣后立即放入10%福爾馬林中浸泡24 h,之后分別用70%(4 h)、80%(4 h)、90%(3 h)乙醇及無水乙醇(2 h)脫水處理,處理后的標本用二甲苯(PX)進行透明處理2 h；最后除雜質后,放入純石蠟中,4℃保存待用。②制片：將①中的石蠟切成厚度為4 μm切片,放置于載玻片上滴1 ml蒸餾水,在恒溫水浴鍋上烘干。③組織切片在PX中浸泡10 min,梯度乙醇浸泡5 min脫水后；PX透明處理3 min。④PBS沖洗5 min×3次,將過氧化氫的甲醇溶液滴在標本上靜置。12 min,消除內源性過氧化物酶的影響；PBS液洗5 min×3次后封閉處理,室溫30 min后傾出多余液體。⑤加入適量一抗,在4℃下過夜,次日PBS洗3次各5 min。⑥加入相應的二抗后靜置15 min,PBS洗3次。⑦DAB顯色：在組織標本上滴加DBA顯色劑并在顯微鏡下觀察染色程度,PBS沖洗10 min。⑧蘇木精復燃4 min后用不同濃度酒精脫水后沖洗10 min。⑨PX處理后,XSP-4C光學顯微鏡下觀察；⑩PBS取代一抗制備的陰性對照。

1.2.2 B組 行原位雜交診斷法：①根據結核桿菌設計特異結核探針,由上海納昂達生物科技有限公司合成。②制作石蠟切片標本,并浸泡在0.8%鹽酸胃蛋白酶液中,37℃消化10～15 min［1］。③TBS洗3次,5 min/次,依次用100%～70%梯度乙醇浸泡5 min脫水后,室溫晾干。④滴加步驟：設計的探針,98℃變性10 min,在冰水混合物中退火,在37℃孵育1 h,TBS洗3次,滴加堿性磷酸酶標記的地高辛抗體,室溫放置0.5 h,專用染液洗3次。⑤滴加NBT/BCIP的堿性磷酸酶的底物緩沖液避光顯色,核快紅襯染5 min,中性樹膠封片鏡檢［2］。

1.3 觀察指標 觀察兩種診斷方法的標本鏡檢下的形態(tài),并計算陽性率。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

免疫組化技術和原位雜交技術制片后在顯微鏡下觀察到標本的病變部位的胞質內出現黃色或棕色顆粒。A組和健康組的陽性率分別為87.32%、6.00%,B組和健康組的陽性率分別為97.18%、2.00%。B組診斷結核病的陽性率高于A組,差異具有統計學意義 (χ2=4.829,P＜0.05)。見表1。

表1 兩種診斷方法陽性率結果(n,%)

3 討論

結核病是WHO和我國重點防治的重大傳染病,目前我國結核病年發(fā)病人數約為130萬,占全球發(fā)病的14.3%,位居世界第二［3］。該病傳播途徑廣泛,可通過空氣、食物、垂直傳播等途徑進行傳播,危害較大且持續(xù)時間長,給患者造成巨大的心理和生理負擔。隨著科學技術的發(fā)展,抗結核藥物—利福平、異煙肼相繼合成,全球結核病患者大幅減少。但自20世紀80年代以來,人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者不斷增多及抗藥性結核病菌株的產生,結核病已被WHO列為人類的主要殺手［4］。結核分枝桿菌細長略彎曲,聚集呈分枝狀排列繁殖,細胞壁含有大量脂質(占菌體干重的40%～60%),在細胞壁中最多,大量的脂質使一般的消毒劑難以滲入胞內,表現為對外界環(huán)境有超常的抵抗力,對酸、堿、自然環(huán)境和干燥環(huán)境有抵抗力,對濕熱、酒精、紫外線敏感；此外,結核分枝桿菌的形態(tài)、菌落、毒力及耐藥性均可發(fā)生變異,導致耐藥性增強出現耐藥菌株及耐多藥菌株,給治療帶來困難。目前對于結核病的治療,臨床上主張早期診斷,及時確診并制定治療措施,以防結核桿菌造成機體其他臟器的破壞［5-8］。臨床上診斷結核病使用X線、病理切片、抗酸染色等方法。但X線影像儀器復雜,成本高,且準確率不高,常會出現誤診或漏診?？顾崛旧?具有病理特征檢測準確等優(yōu)勢,但檢測時間長,特異性低,會出現假陰性等狀況,限制了其在臨床上的應用［9,10］。隨機分子生物學技術的發(fā)展,基因工程和蛋白工程在疾病診斷方面的影響日益擴大,本次研采用的免疫組化技術利用特異性抗體與結核桿菌中的相關蛋白結合進行檢測,而原位雜交技術通過設計特異性探針,通過堿基互補原理與結核桿菌特異性結合進行檢測,兩種方法較傳統的診斷方法特性性更高。

本次研究結果顯示：免疫組化技術和原位雜交技術制片后在顯微鏡下觀察到標本的病變部位的胞質內出現黃色或棕色顆粒。A組和健康組的陽性率分別為87.32%、6.00%,B組和健康組的陽性率分別為97.18%、2.00%。B組診斷結核病的陽性率高于A組,差異具有統計學意義 (χ2=4.829,P＜0.05)。

綜上所述,兩種方法都是結核病診斷較好的手段,原位雜交技術診斷結核病的陽性率高于免疫組化技術,具有臨床推廣價值。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.03.023

2016-08-23］

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