褐根病菌分子檢測與生物防治研究進展

張勁藹+黃華枝+畢可可+孫龍華

摘要：褐根病是由有害木層孔菌引起的林木和多年生果樹的重要根部病害。通過綜述了近年來有關褐根病菌的單克隆抗體檢測法等4種分子檢測技術和生防放線菌等4種生物防治的研究，指出由于分子檢測方法的敏感度和特異度高，可用于早期診斷褐根病菌；同時也表明用生物防治替代傳統(tǒng)的化學防治進行褐根病菌防治，并使生物制劑有效推廣運用，將是今后研究的熱點和控制該病害的主要手段。

關鍵詞：褐根病菌；分子檢測；生物防治

文章編號：1671-2641（2016）06-0000-00

中圖分類號：S763.7

文獻標志碼：A

Abstract： Brown root rot disease， caused by Phellinus noxius， has become an important disease of forest and perennial fruit trees. This paper summarizes 4 kinds of molecular detections such as monoclonal antibody detection and 4 kinds of biological control such as actinomyces of brown root rot disease. It points out that molecular detection will be feasibly early diagnostic tool for brown root rot disease due to its high sensitivity and specificity. And it shows that it will be focus of biological control instead of the traditional chemical methods to control brown root rot disease and major measures of application of biological control preparation effectively in the future.

Key words： Phellinus noxius； Molecular detection； Biological control

褐根病是由有害木層孔菌Phellinus noxius （Corner） Cunningham引起經濟作物、果樹、古樹名木和園林綠化植物等毀滅性破壞的土傳病害。染病樹木因根部腐朽造成生長衰弱、樹葉變黃、枯萎脫落，樹木的根部表皮呈紅褐色，受害面積逐漸增大，然后木質變白、疏松軟化，具蜂窩狀褐色紋線，粘有土壤和褐色菌絲體，使樹皮變得粗糙[1-2]。從黃化到枯死通常只需一至三個月，大些的植株或根系較深廣的植株從發(fā)病到死亡可能需要數年的時間。該病最早于1928年由澤田兼吉在臺灣的樟樹Cinnamomum camphora、龍眼Dimocarpus longan、月橘Murraya paniculata等樹木的根部發(fā)現，當時被鑒定為橡膠層孔菌Fomes lamaensis，直到1965年Cunningham才將其歸類為有害木層孔菌[2]。褐根病菌主要分布在亞洲、澳洲、美國和非洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)[3]。目前，褐根病菌是中國臺灣、中國香港和澳門、日本、澳洲和馬來西亞等地區(qū)木本植物根部的主要病原菌之一，有“林木殺手”或“樹癌”之稱[4]。

有害木層孔菌屬于擔子菌門，層菌綱，非褶菌目，銹革孔菌科，木層孔菌屬，生長最適溫度30℃，8℃以下不生長。在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落初期白色至草黃色，后變成湖泊褐色至暗褐色，產生特征性不規(guī)則暗褐色紋線或凹陷，形成節(jié)孢子和毛狀菌絲。在自然條件下極少形成擔子果[2]。該病原菌寄主范圍十分廣泛，可為害超過59科200種植物，它是中國大陸的檢疫性有害生物之一[5]，因此加強進出境檢驗檢疫措施，防止病害進一步擴散蔓延的意義重大。目前主要采取砍除病樹、掘溝阻斷病原傳播、熏蒸處理病土和種植無病苗木等防控措施，但是尚未有一種理想的防治藥劑和防治方法能有效地控制樹木褐根病的發(fā)生[4]。另外，雖根據前期的研究結果表明一些化學藥劑能有效地抑制這種病菌[6]，但化學藥劑往往容易造成環(huán)境污染，危害人的健康，因此開發(fā)環(huán)境友好型和防效高的藥劑在城市園林樹木保護中具有非常重要的現實意義。而生物防治方法因其低毒、無污染越來越受到關注和重視，并極大豐富了褐根病的防治研究。本文綜述了近年來有關褐根病菌的分子檢測技術和生物防治的研究，以期為后續(xù)開展褐根病的檢測和生物防治工作提供參考。

1 褐根病菌的分子檢測研究

目前褐根病菌的檢測以病癥識別及組織分離病原菌為主，但這類傳統(tǒng)方法往往耗時長、靈敏度低及專業(yè)性強，難以達到快速診斷和檢測的目的[7]。而利用分子生物學技術來診斷病害能在植株出現病癥前檢測到病原菌，實現快速、正確診斷，因此對病害的防治有至關重要的作用[8]。

1.1 單克隆抗體檢測法

酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）是一種酶免疫分析方法，最早在1971年由Engvall和Perlman提出，隨后經過了不斷改進和提高[9]。ELISA的原理是通過抗體和抗原的特異反應結合底物與酶的顏色反應來判斷結果，具有特異性強、符合率高、敏感性高的特點，被廣泛應用在食品微生物、毒素、動物傳染病以及植物病原細菌、真菌和病毒等的檢測中[9]。2010年，吳孟玲等[10]應用雜交瘤（Hybridoma）技術，開發(fā)出專門針對褐根病菌的單克隆抗體，并結合ELISA方法建立了褐根病快速診斷方法，僅需要0.5 g根部組織即可檢測褐根病菌感染；該雜交瘤細胞株具有對褐根病菌反應高而對健康植物組織與其他相似真菌Ganoderma sp.和P. gilvus反應低的特異性。

1.2 基因芯片檢測法

基因芯片是利用光導原位合成或者微量點樣等方法，把大量的DNA探針如基因、PCR產物和人工合成的寡核苷酸等有序地固定在載體表面，與標記的核酸樣品雜交后，能快速、準確、大規(guī)模地獲取樣品核酸序列信息。目前國內外利用寡核苷酸芯片對病毒、細菌和真菌等進行相關檢測的研究廣泛，并在對其病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測、基因組監(jiān)測等方面獲得了成功[11]。2016年，Tzean等[12]利用基因芯片方法在褐根病菌的rDNA-ITS區(qū)設計探針，可精確鑒定和診斷17種木層孔菌屬病原菌，其中包括有害木層孔菌；他們發(fā)現在PVC膜上可檢測低至1 pg的褐根病菌DNA樣品?；蛐酒z測有害木層孔菌的靈敏性、準確度高，耗時短，應用前景良好。

1.3 ITS特異擴增檢測法

相對于傳統(tǒng)的生物學檢測，PCR檢測技術具有高敏感性、高特異性等特點，故成為非常重要的病原菌檢測方法[13]。目前，利用16SrDNA序列設計特異引物檢測細菌微生物種類的應用非常廣泛[14]。在真菌中，rDNA編碼序列由轉錄區(qū)和非轉錄區(qū)構成，轉錄區(qū)包括5S、5.8S、18S、28S rDNA，非轉錄區(qū)是18S和5.8S之間以及5.8S和28S之間的內轉錄間隔區(qū)ITS。18S、5.8S、28S rDNA基因序列進化較緩慢且相對保守，ITS區(qū)的進化則相對較快，因此可根據它們的序列信息進行鑒定。2007年，蔡志濃等[7]首次在褐根病菌ITS區(qū)設計具有高度特異性及靈敏度的引物對PN-1F/PN-2R，得到一條約420 bp的特異片段，在短時間內準確、靈敏地診斷出臺灣褐根病菌。相似地，吳孟玲等[15]先以通用性引物對ITS1-F/ITS-4進行PCR擴增，產物經過測序與比對后再重新設計出針對褐根病菌的特異性引物對G1F/G1R，擴增得到一條653 bp的特異片段；并通過優(yōu)化DNA的提取方法，可針對極少量的樣本進行檢測，其靈敏度可達10 pg。2016年梁艷瓊等[7]利用引物對G1F/G1R，分析了橡膠上不同病原物的擴增特異性，發(fā)現對橡膠樹紅根病菌、紫根病菌、臭根病菌、白根病菌和清水對照均無擴增條帶，只有橡膠樹褐根病菌才能擴增成功，因此進一步驗證了該引物對的特異性。最近，Wang等[16]利用引物對G1F/G1R結合普通PCR進行分析得出，在檢測的香港38個可疑樹種中有13種感染了褐根病菌。但結合實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR， qRT-PCR）檢測時，那些原來使用普通PCR方法未檢測到的土壤中也能檢測到褐根病菌，這說明褐根病菌可能廣泛存在香港的土壤中。

1.4 等溫擴增檢測法

2000年，Notomi等[17]所開發(fā)的環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification， LAMP）是一種全新且快速靈敏的檢測方法。，LAMP利用能識別靶序列上6個位點的4個特殊設計的引物和一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下即能進行擴增反應，故對儀器的要求不高，恒溫水浴鍋即可。此外，結果可用濁度計檢測或者在反應液中添加熒光染料后直接肉眼觀察，全反應過程不到1小時，可在短時間內完成檢測。與傳統(tǒng)的PCR檢測技術相比，LAMP技術更簡單、快速，而且具有更高的特異性、敏感性和有效性[17]。目前，LAMP技術已被廣泛用于臨床診斷、食品安全性檢測和重要病原菌種類鑒定。2014年，黃裕星等[18]利用褐根病菌特異的ITS區(qū)域設計出三組LAMP引物，并對來自Phellinus屬的9種不同供試菌進行LAMP分析，最終確定了一組能特異檢測出植物褐根病菌的最佳引物。研究結果表明，在同等DNA模板條件下，其靈敏度較普通PCR檢測法提升10倍。因此該方法有望成為一種新的褐根病分子診斷法被廣泛應用。

2 褐根病菌的生物防治研究

生物防治是利用有益生物或其他生物來抑制或消滅有害生物的一種防治方法，通過植物、病原菌、拮抗菌、植物表面及周圍微生物群落和自然環(huán)境等因素之間的相互作用來實現促生防病。目前研究的生防微生物種類包括放線菌、木霉菌、芽孢桿菌等幾大類。

2.1 生防放線菌

放線菌是呈纖維狀的革蘭氏陽性細菌，與真菌相似但沒有細胞核。放線菌種類豐富，廣泛存在于土壤和植物根際等環(huán)境，代謝功能各異，是實際用途廣泛的微生物資源。用于植物生物防治的主要是鏈霉菌屬（Streptomyces spp.）及其相關的類群[19]。Kothandaraman等[20]發(fā)現土壤根際的放線菌可以抑制褐根病，但并未作進一步防治應用研究。2012年，Yanti等[21]從土壤中分離出三種能重寄生于有害木層孔菌的放線菌，分別命名為KT2F、MG01和MG02，其中KT2F能有效抑制有害木層孔菌，推測可作進一步深入研究。

2.2 生防木霉菌

木霉菌（Trichoderma）作為生防真菌的研究已有大量的報道[22]。木霉菌屬于真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科，是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分；其適應性、腐生性強，生長繁殖快，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面，作為生防微生物具有存在范圍廣和廣譜、高效等優(yōu)點。有報道稱，木霉菌能成功防治真菌性、細菌性和病毒性等病害，國外已有多種相關商品問世。目前生防木霉菌主要應用在防治土傳病害[22]。2010年，倪蕙芳等[23]利用玻璃紙對峙法，從土壤中篩選出2株對褐根病菌菌絲生長具有100%抑制效果的木霉菌菌株，分別為Tri-003和Tri-080，其生長速度快且產孢能力極佳，三天即可長滿直徑9 cm的PDA平板，具有病害防治潛力，可進一步將其開發(fā)為生防制劑。另有研究表明，有害木層孔菌的生物防治主要受木霉菌的種類、寄主植物的類型和環(huán)境條件（溫度和水分含量）等因素的影響。在實驗室條件下，木霉菌屬能有效阻止有害木層孔菌菌株的生長，降低因有害木層孔菌侵染所致木材腐爛比率，但結果仍需進一步的大田實驗驗證[24]。2015年，李和平等[25]通過平板對峙法測定9個木霉菌菌株對橡膠樹褐根病菌的拮抗作用，有3株對橡膠樹褐根病病原菌的拮抗作用顯著，其中2株在第8 d對褐根病病原菌的抑制率仍能達到100%。

2.3 生防芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌是一類好氧型、內生抗逆孢子的桿狀細菌，廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動植物的體表，自身沒有致病性，可分泌多種酶和抗生素，殺滅一些常見的病原菌，用途十分廣泛。枯草芽孢桿菌是最具開發(fā)潛力的生物殺菌劑，可產生40多種不同結構的抗菌物質[26]。2011年，趙璐璐等[27]從橡膠樹根部分離出1株枯草芽孢桿菌Czk1，對引起橡膠樹褐根病的致病真菌及其他病原真菌均具有拮抗作用；研究發(fā)現該菌株轉接20代后抑菌活性仍非常穩(wěn)定，持效期長，具有較高的潛在生防利用價值。

2.4 其他生防菌和有益微生物

土壤是一個多種微生物共生的場所，故選擇能夠共生、具拮抗褐根病作用的菌株共同防治褐根病效果更佳。2009年，Chakraborty等[28]從茶樹根際分離出人蒼白桿菌TRS-2，對包括有害木層孔菌在內的6種供試病原菌均具有抑制性。此外，人蒼白桿菌懸浮液施于根周圍還能促進茶樹的生長。2012年，佘俊弘[29]研究發(fā)現從山林采集的土壤中分離純化出的野生混合菌及篩選出的單株純種放線菌均能抑制褐根病菌，野生混合菌的抑制效果優(yōu)于單株純種放線菌。2014年，吳孟玲等[30]通過不同混合比例的多株拮抗微生物菌，進行抑菌效果測試，結果顯示混合生物制劑可應用在褐根病的預防，能有效降低褐根病大量發(fā)生的概率。2016年，畢可可等[31]從澳門松山市政公園健康樹木的根際分離得到1株對褐根病菌具有較強拮抗活性的伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.），為進一步研究其生防作用打下了基礎。

3 展 望

褐根病的致病菌為有害木層孔菌，寄主范圍非常廣，是熱帶和亞熱帶地區(qū)引起果樹、木本觀賞植物以及林木立枯的最重要病害，造成果園和森林植株大量死亡，而且病害呈蔓延趨勢。目前尚未有一種有效防治藥劑或方法控制該病害。其中重要的原因是褐根病發(fā)生早期不易被發(fā)現，待其出現癥狀時，病菌危害已十分嚴重，加大了防治難度。故當前應加強檢疫管理，樹木栽種前要做好病害檢疫，培育健康種苗，從根源阻絕發(fā)病地區(qū)的植株，銷毀病根，熏蒸消毒病土，盡可能切斷病菌傳播途徑。能提早診斷褐根病并采取相應防治措施對其病害治理意義非凡。分子檢測最主要的優(yōu)點是僅用少量病原菌DNA即可檢測出結果，尤其適合褐根病這種早期不容易察覺的病害檢測，因而應用前景廣泛。本文著重介紹了4種各有千秋的褐根病菌分子檢測技術，但仍需在生產實踐中結合傳統(tǒng)鑒定方法作進一步檢驗。最近Wang等[16]利用靈敏度高的qRT-PCR技術在未現癥狀的樹木土壤中都檢測出褐根病菌，此法或能發(fā)揮今后有效控制褐根病傳播和蔓延的重要指導作用。

褐根病的防治以物理和化學方法為主，譬如用外科手術方式把感染組織切除再用藥劑處理傷口，或通過浸水一個月殺死有害木層孔菌等[32]，但都僅限于病狀早期診斷發(fā)現的病株。到目前為止尚未出現專門的褐根病殺菌劑，但大量使用化學農藥，會導致病原菌產生抗藥性，且污染環(huán)境，因此國內外更關注高效低毒、無污染的防治方法[4， 33-34]。目前生物防治以其無公害等特點備受關注。此外，已有大量關于生物防治用于防治其他重要植物病原真菌、細菌和病毒等病害的研究報道[22]，也有多種相關商品問世，但關于樹木褐根病的生物防治研究則處于起步階段。目前針對褐根病菌的生防微生物研究工作主要集中在其分離、篩選和室內盆栽的防治試驗，但褐根病菌的生防微生物種質資源還有待進一步挖掘并豐富其多樣性；此外，大田應用的環(huán)境條件遠比室內試驗復雜，所以關于褐根病的生物防治仍需進行大量的研究工作。值得欣慰的是生物防治作為一項無污染防治法在今后防控褐根病的方法中占比會越來越大。

致謝：本文資料收集過程中得到澳門民政總署管理委員會梁冠峰委員、原園林綠化部潘永華部長、原綠化處郭志強處長、自然保護研究處陳玉芬處長、園林綠化部譚鳳圓 、李燕珍和何銳榮以及樹木護理執(zhí)行隊張羽翀和陸家盛等技術人員的幫助，特此鳴謝。

參考文獻：

[1] 潘浣鈺，彭少麟，張素梅，等. 土壤理化性質與褐根病感染的相互關系[J]. 生態(tài)環(huán)境，2008（17）：1650-1653.

[2] 林石明，廖富榮，陳紅運，等. 臺灣褐根病發(fā)生情況及研究進展[J]. 植物檢疫， 2012（26）：54-60.

[3] Ann P， Lee H， Huang T. Brown root rot of 10 species of fruit trees caused by Phellinus noxius in Taiwan[J]. Plant Disease， 1999， 83：746-750.

[4] Huang H， Sun L， Bi K， et al. The Effect of Phenazine-1-Carboxylic Acid on the Morphological， Physiological， and Molecular Characteristics of Phellinus noxius[J]. Molecules， 2016； 21： 613

[5] 畢可可，阮琳，代色平，等. 10種殺菌劑對樹木褐根病菌的室內抑菌試驗. 中國觀賞園藝研究進展[C]，北京：中國林業(yè)出版社，2012，705-707.

[6] Ann P-J， Chang T-T， Ko W-H. Phellinus noxius brown root rot of fruit and ornamental trees in Taiwan[J]. Plant Disease， 2002， 86： 820-826.

[7] 梁艷瓊，吳偉懷，李銳，等. 橡膠樹褐根病菌的分子檢測[J]. 熱帶作物學報，2016，37：576-581.

[8] 蔡志濃，謝文瑞，安寶貞，等. 褐根病菌Phellinus noxius檢測用專一性引子對的開發(fā)[J].植病會刊，2007（16）：193-202.

[9] 孫艷秋，趙奎華，劉長遠，等. 快速檢測黃瓜細菌性角斑病菌的間接ELISA法優(yōu)化[J]. 沈陽農業(yè)大學學報，2014（2）：213-216.

[10] 吳孟玲，洪挺軒，蔡佳欣，等. 樹木褐根病單元抗體檢測技術的建立[J].中華林業(yè)季刊，2010（43）：191-199.

[11] 劉旭光，宋福平，張杰. 寡核苷酸芯片在微生物檢測中的應用[J]. 生物技術通報，2005（1）：29-33.

[12] Tzean Y， Shu PY， Liou RF， et al. Development of oligonucleotide microarrays for simultaneous multi-species identification of Phellinus tree-pathogenic fungi[J]. Microbial biotechnology， 2016， 9： 235-244.

[13] Henson JM， French R. The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis[J]. Annual review of phytopathology， 1993， 31： 81-109.

[14] Cook KL， Layton AC， Dionisi HM， et al. Evaluation of a plasmid-based 16S-23S rDNA intergenic spacer region array for analysis of microbial diversity in industrial wastewater[J]. Journal of microbiological methods， 2004， 57： 79-93.

[15] 吳孟玲，張東柱，莊鈴木. 樹木褐根病PCR檢測技術的建立[J]. 中華林業(yè)季刊，2009（42）：239-247.

[16] Wang Y-F， Meng H， Gu VW， et al. Molecular diagnosis of the brown root rot disease agent Phellinus noxius on trees and in soil by rDNA ITS analysis[J]. Applied Environmental Biotechnology， 2016， 1（1）： 81–91.

[17] Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research， 2000， 28： E63.

[18] 黃裕星，陳昭翰，洪挺軒，等. 樹木褐根病的恒溫環(huán)狀擴增法（LAMP）檢測方法的研發(fā)[J]. 植病會刊，2014（23）：1-13.

[19] 姜鈺，董懷玉，徐秀德，等. 放線菌在植病生防中的研究進展[J]. 雜糧作物，2005（25）：329-331.

[20] Kothandaraman R， Joseph K， Mathew J， et al. Actinomycete population in the rhizosphere of Hevea and its inhibitory effect on Phellinus noxius[J]. Indian Journal of Natural Rubber Research， 1991， 4： 150-152.

[21] Yanti Y， Zainon MN， Marshida AHU. Antagonistic activity of three Actinomycetes， MG01， MG02 And KT2F towards Phellinus noxius. Business， Engineering and Industrial Applications （ISBEIA）（C）. 2012， 729-732.

[22] Harman GE. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp[J]. Phytopathology， 2006， 96： 190-194.

[23] 倪蕙芳，許淑麗， 陳瑞祥，等. 臺灣地區(qū)土壤中木霉菌株對植物病原真菌拮抗能力的篩選[J]. 臺灣農業(yè)研究，2010（59）：29-41.

[24] Schwarze FW， Jauss F， Spencer C， et al. Evaluation of an antagonistic Trichoderma strain for reducing the rate of wood decomposition by the white rot fungus Phellinus noxius[J]. Biological Control， 2012， 61： 160-168.

[25] 李和平，唐朝榮，陽美芳，等. 木霉菌對橡膠樹褐根病菌的拮抗作用[J]. 福建農業(yè)學報，2015（30）：362-366.

[26] 李明，雙寶，李海濤，等. 枯草芽孢桿菌的研究與應用[J]. 東北農業(yè)大學學報，2009（40）：111-114.

[27] 趙璐璐，賀春萍，鄭肖蘭，等. 枯草芽孢桿菌Czk1菌株對橡膠樹根病菌的抑制作用及對炭疽病生防效果研究初報[J]. 南方農業(yè)學報，2011（42）：740-743.

[28] Chakraborty U， Chakraborty B， Basnet M， et al. Evaluation of Ochrobactrum anthropi TRS-2 and its talc based formulation for enhancement of growth of tea plants and management of brown root rot disease[J]. Journal of applied microbiology， 2009， 107： 625-634.

[29] 佘俊弘. 褐根菌抑制機制之研究[D]. 臺灣：國立成功大學，2012.

[30] 吳孟玲，許育晏，李芷蕓，等. 微生物制劑在褐根病管理的應用研究[J]. 臺灣林業(yè)科學，2014（29）：S41-53.

[31] 畢可可， 譚鳳圓， 吳超， 等. 一株拮抗樹木褐根病菌的伯克霍爾德菌的分離及鑒定[J]. 林業(yè)與環(huán)境科學， 2016， 32（4）： 7-11.

[32] 張東柱. 認識樹木褐根病及其防治. 植物重要防疫檢疫病害診斷鑒定技術研習會?？痆C]. 臺北：中華林學會，2007：39-51.

[33] 蔡志濃，安寶貞，謝文瑞. 抑制褐根病菌、白紋羽菌及南方靈芝菌的化學藥劑篩選[J]. 植病會刊，2005（14）：115-124.

[34] Fu CA， Hu BA， Chang TA， et al. Evaluation of dazomet as fumigant for the control of brown root rot disease[J]. Pest management science， 2012， 68： 959-962.