金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶PtT1的克隆與生物信息學分析

李媛++李國棟++張愛麗++錢子剛

【摘要】目的：克隆金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶（PtT1）全長基因，并進行生物信息學分析。方法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆金鐵鎖PtT1全長cDNA，命名為PtT1，并通過生物信息學軟件對該基因進行蛋白結構預測和構建進化樹等分析。結果：克隆得到PtT1基因，其cDNA全長1529bp，ORF長1377bp，編碼458個氨基酸，相對分子質(zhì)量為5125KDa，等電點580，定位于線粒體，與同科植物香石竹糖基轉(zhuǎn)移酶基因DcT227具有很高的同源性。結論：成功克隆、分析了金鐵鎖PtT1基因，為金鐵鎖該基因的后續(xù)功能鑒定提供了基礎。

【關鍵詞】金鐵鎖；糖基轉(zhuǎn)移酶；生物信息學

【中圖分類號】R9141【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）04-0023-04

Cloning of PtT1 genes of Psammosilene tunicoides and BioinformaticsLI YuanLI GuodongZHANG Aili*QIAN Zigang*

Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants， Yunnan University

of Traditional， Chinese Medicine， Kunming 650500， ChinaAbstract：Subject To clone the glycosyltransferase gene（PtT1） in Psammosilene tunicoides， and to analyze the bioinformation of PtT1. Methods cDNA was reversely transcriped according to the Transcriptome Sequencing. The protein characteristics was analyzed and the phylogenetic tree of PtT1 was constructed using the bioinformatics. ResultsThe 1529bp sequence in P. tunicoides was obtained， which has a 1377bp ORF， encoding 458 amino acids. The protein molecular weight was5125KD， with the isoelectric point of 580. The protein was located at mitochondria. The PtT1 in P.tunicoides was most similar with Dianthus caryophyllus DcT227 by NCBI blast. Conclusions The PtT1 in P. tunicoides was successfully cloned and analyzed， which provides the foundation for this gene function characterization.

Keywords： Psammosilene tunicoides； Glycosyltransferase； Bioinformation

植物中化合物的糖基化是一種很普遍的生理現(xiàn)象，是植物細胞維持代謝平衡的主要機制之一[1]。糖基轉(zhuǎn)移酶則是負責催化分子糖基化修飾反應的酶，其可將活性糖基從尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖（UDP-glucose）轉(zhuǎn)移至次級代謝物及植物內(nèi)外源毒性物質(zhì)等一系列植物小分子化合物受體中[2]。糖基化經(jīng)常是次生代謝產(chǎn)物主要的后修飾方式，往往修飾合成途徑中的最終一步或幾步。植物三萜皂苷類次生代謝產(chǎn)物，往往都具有較高的藥理活性價值。其合成途徑可前體形成，骨架構建及后修飾等三個過程[3]。次生代謝產(chǎn)物結構的基本骨架形成之后，經(jīng)過細胞色素P450 酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等一系列關鍵酶基因的后修飾，最終形成眾多種類繁多的三萜皂苷[4]。

金鐵鎖來源于石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖Psammosilene tunicoides W C Wu et C Y Wu的干燥根[5]。主要分布在云南、貴州、西藏等省，為云南的道地藥材[6]，是云南白藥等中成藥的重要主要組成藥之一。其活性成分為齊墩果烷型的三萜總皂苷[7-8]，具有顯著鎮(zhèn)痛、抗炎等的藥理活性[9-10]。目前，參與金鐵鎖三萜皂苷合成途徑前體形成，骨架構建等過程的關鍵酶基因都已有報道[11-12]，而后修飾環(huán)節(jié)中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因還未見報道。

鑒于此，本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過設計特異性引物克隆了一條金鐵鎖PtT1家族基因，命名為PtT1，并采用生物信息學軟件對其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結構特征、功能及系統(tǒng)演化關系等進行了預測分析。結果將為金鐵鎖PtT1基因的功能鑒定研究奠定基礎，揭示金鐵鎖三萜皂苷的分子形成機制。

1儀器與材料

11植物材料金鐵鎖采集于云南省麗江市，經(jīng)云南中醫(yī)學院錢子剛教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖Psammosilene tunicoides WCWu et C Y Wu。

12儀器高速冷凍離心機（eppendorf）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（BIO-RAD公司）；DYC-33A微型電泳槽（BIO-RAD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司）；PCR反應擴增儀（BIO-RAD公司）；移液槍（范圍100～1000μL，20～200μL，05～10μL）（eppendorf）。

13試劑EastepTM總RNA提取試劑盒（普洛麥格生產(chǎn)批號：7020001018）； PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa生產(chǎn)批號：AK3201）；TransStart KD Plus DNA Polymerase（Trans生產(chǎn)批號：K10511）；薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（GENEray生產(chǎn)批號：1601G20）；pEASY-T1 cloning kit（Trans生產(chǎn)批號：I40914）； DL2000 DNA Marker（TaKaRa生產(chǎn)批號：A2101A）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2方法

21引物設計根據(jù)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組中糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列，設計1對特異性引物PtT1F： AAAAATGAAACACCAAGAAAAGCAG，PtT1R： GATTGAAGAAACCAAAGAAGGGGGC。

22PtT1基因的克隆按照EastepTM總RNA提取試劑盒（普洛麥格）說明書提取金鐵鎖根中的總RNA；并根據(jù)PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）說明書合成cDNA。以cDNA為模板使用TransStart KD Plus DNA Polymerase（AP301）通過PCR擴增目的片段。表1PCR反應體系

ComponentsVolumeTemplate1 μLForward Primer（10 μM）1 μLReverse Primer（10 μM）1 μL5×TransStart KD Plus Buffer10 μL25 mM dNTPs4 μLTransStart KD Plus DNA Polymerase1 μLddH2Oto 50 μLPCR反應條件：94℃、5min；94℃、30s；45℃、30s，68℃、2 min30sec，35個循環(huán)；68℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選取較亮的目的條帶進行回收純化，并將回收產(chǎn)物與1μL pEASY-T1 cloning kit（Trans）配成連接體系，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞后，涂布于含Amp+ 抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)。挑選白色單克隆進行菌液PCR鑒定，選取陽性單克隆過夜搖菌保種后測序。

23金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物信息學分析在NCBI（http：//wwwncbinlmnihgov）網(wǎng)站上通過BLAST程序進行序列比對，應用 BioEdit翻譯為氨基酸序列，使用ORF Finder（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）確定開放閱讀框。并用ProtParam（http：//webexpasyorg/protparam/）預測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量等；使用ProtScale（http：//webexpasyorg/protscale/）軟件進行疏水性分析；TMHMM（http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/）工具預測PtT1蛋白的跨膜螺旋區(qū)；Signal 30（http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP-30/）預測蛋白質(zhì)信號肽；利用在線工具TargetP 11（http：//wwwcbsdtudk/services/TargetP/）預測PtT1的亞細胞定位情況。使用PORTER對二級結構預測SWISS-MODEL（http：//swissmodel expasyorg/interactive/k5MUhF/models/）服務器對三級結構預測；然后使用MEGA 50軟件內(nèi)置的NJ法構建系統(tǒng)進化樹。

3結果與分析

31金鐵鎖PtT1基因的克隆以金鐵鎖根cDNA為模板進行PCR反應，擴增得到2000bp左右的片段。使用pEASY-T1載體通用引物對單克隆進行菌液PCR檢測為陽性克隆后送樣測序，結果表明擴增序列與轉(zhuǎn)錄組序列基本一致。見圖1。

32PtT1基因的生物信息學分析PtT1糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA全長1529bp，ORF長1377bp，編碼458個氨基酸。通過Blastn比對分析可知與石竹科香石竹同源性最高，為81%。采用ProtParam工具預測PtT1編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，從分析結果中可知PtT1的分子質(zhì)量為5125KDa，理論等電點為580；在組成糖基轉(zhuǎn)移酶的20種氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占的比例最高，達到114%；PtT1的不穩(wěn)定指數(shù)為3719，為穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為9044。采用ProtScale分析PtT1氨基酸序列的疏水性/親水性，結果顯示415左右位置有一個典型的親水性區(qū)域，見圖2。

利用TMHMM 20對PtT1蛋白進行跨膜結構預測。推測其不存在跨膜區(qū)域，該糖基轉(zhuǎn)移酶編碼的蛋白不屬于跨膜蛋白。見圖3

使用SignalP 30對PtT1蛋白質(zhì)的信號肽進行預測，由神經(jīng)網(wǎng)絡模型分析可判斷該蛋白不存在信號肽。隱馬爾夫模型進一步證實了金鐵鎖PtT1編碼的蛋白是非分泌蛋白質(zhì)，沒有信號肽存在。將PtT1編碼的蛋白質(zhì)序列輸入在線細胞定位分析工具TargetP 11服務器，分析表明目的蛋白的分泌途徑為線粒體型，即定位在線粒體上。

對糖基轉(zhuǎn)移酶PtT1的結構域進行預測，在190位到442位之間存在高度保守的結構功能域—UDPGT，即UDPGT家族成員共有的典型結構域。見圖4。

利用PORTER對金鐵鎖PtT1進行二級結構分析，該蛋白二級結構中α-螺旋（H）占4432%，β-折疊（E）占1245%，無規(guī)則卷曲（C）占4323%，該蛋白質(zhì)的二級結構屬于混合型。利用Swiss-Model Workspace對糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)三維立體結構進行預測。見圖5。

將金鐵鎖PtT1與GenBank數(shù)據(jù)庫中17種植物的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白進行Clustal W比對分析后，利用MEGA 51中的Neighbor-Joining 方法，構建系統(tǒng)進化樹。結果表明金鐵鎖與同科植物香石竹聚為一類，親緣關系最近；其次與北柴胡、小麥、擬南芥等植物的親緣關系也比較接近，與蓖麻等植物中的PtT1親緣關系較遠。見圖6。

4 討論

糖基轉(zhuǎn)移酶催基因催化三萜皂苷骨架糖基化的反應，其通過催化生物物體內(nèi)已活化的糖，連接到不同的受體分子上，對一系列化合物進行激活、抑制或者調(diào)節(jié)溶解度，從而參與植物體多種調(diào)控和代謝途徑。目前已發(fā)現(xiàn)的催化植物中天然產(chǎn)物糖基化的酶均屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族Ⅰ，其作用是將活性糖基從核苷糖（尿嘧啶核苷二磷酸糖）轉(zhuǎn)移到包括次生代謝物在內(nèi)的多種植物小分子化合物受體上[13]。

目前，僅有少數(shù)幾個參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶被報道[14-19]。本研究立足于金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，從金鐵鎖根中克隆得到一條糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtT1，其cDNA全長1529bp，ORF長1377bp，編碼458個氨基酸。Blast比對分析可知與同科植物香石竹有較高的同源性，保守結構域分析顯示其具有UDPGT家族成員共有的典型結構域，說明所得糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白具有較高的結構保守性。通過構建進化樹，發(fā)現(xiàn)該基因與香石竹、北柴胡、擬南芥等植物的親緣關系比較接近。為進一步研究金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌異源表達，三萜皂苷合成代謝途徑及其關鍵酶表達模式等研究奠定一定的基礎。參考文獻

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（收稿日期：2016-12-05編輯：梁志慶）