大孔樹脂富集新疆啤酒花中總黃酮工藝研究

朱佳++胡月月++葛亮

【摘要】目的：篩選適合富集新疆啤酒花中總黃酮的大孔吸附樹脂并確定純化工藝參數(shù)。方法：以靜態(tài)吸附下大孔樹脂的吸附率和解析率為指標(biāo)，確定富集總黃酮的最佳大孔樹脂，并明確新疆啤酒花中總黃酮的最佳富集工藝。結(jié)果：D-101型樹脂對(duì)新疆啤酒花中總黃酮有良好的富集效果，其具體的工藝參數(shù)條件為：上樣濃度為05g/mL，最大上樣量為15BV，上樣流速為10mL/min，洗脫劑為50%乙醇，洗脫劑用量為5BV，洗脫流速為10mL/min。結(jié)論：采用D-101型大孔吸附樹脂可有效富集新疆啤酒花中總黃酮類成分。

【關(guān)鍵詞】新疆啤酒花；總黃酮；大孔吸附樹脂

【中圖分類號(hào)】R914【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）04-0020-03

Enrichment of Total Flavonoids in Humulus Lupulus L in Xinjiang by Macroporous ResinZHU Jia1HU Yueyue2GE Liang2*

1The first aid hospital of Xinjiang autonomous region， Urumqi 830017， China；

2 College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， ChinaAbstract：Objective Screen the macroporous resins for enrichment the total flavonoids in Humulus Lupulus L from Xinjiang and make sure the optimum parameters of purification Methods The adsorption rate and resolution rate with macroporous adsorption resin static adsorption rate were as the index， screening out the enrichment of total flavonoids best resin in Humulus Lupulus L and the optimum conditions for purification the total flavonoids in Humulus Lupulus L was finishedResults D-101macroporous resin could enrich the total flavonoids of Humulus Lupulus LThe specific process parameters were： sample concentration was 05g·mL-1，maximum sample volume is 15 BV， control the sample flow rate of 10 mL/min， the eluent concentration is 50% ethyl alcohol， elution volume was 5 BV，the eluent flow rate of 10 mL/minConclusion D-101 macroporous adsorption resin could purify the total flavonoids in Humulus Lupulus L from Xinjiang

Keywords：Xinjiang Humulus Lupulus L； Total Flavonoids； Macroporous Resin

啤酒花（Humulus Lupulus L）是?？迫劜輰俣嗄晟葙|(zhì)蔓生藤本植物，其雌性球穗花序簡(jiǎn)稱酒花[1]。它是一種較耐寒不耐熱的植物，主要分布于我國(guó)西北地區(qū)、新疆北部、東北、華東及山東、甘肅、陜西等地。我國(guó)啤酒花產(chǎn)量約占全世界的13%，僅次于美國(guó)和德國(guó)，居世界第三位[2]。啤酒花中含有黃酮類、樹脂類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、膽堿、粗纖維、氨基酸等多種化學(xué)成分[3]。其味苦、性平，有健胃、消食、利尿、安神、止咳化痰之功效，其具有抗氧化[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤和植物雌激素樣作用[6]、鎮(zhèn)靜[7]、治療結(jié)核[8]、神經(jīng)衰弱[9] 等多種功效。新疆啤酒花在新疆自治區(qū)有廣泛分布，并且儲(chǔ)量豐富，經(jīng)過(guò)查閱已有對(duì)新疆啤酒花進(jìn)行相關(guān)的研究，如總黃酮、總多糖的提取與含量測(cè)定、微量元素與揮發(fā)油的分析，但是對(duì)其主要活性成分總黃酮類化合物的富集工藝研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)是對(duì)采用大孔吸附樹脂對(duì)新疆啤酒花中主要的總黃酮類成分進(jìn)行富集，為其進(jìn)一步研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1儀器與材料

11儀器TU-1810可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用公司）；BN-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS220S電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

12材料新疆啤酒花采自新疆自治區(qū)烏魯木齊市昌吉地區(qū)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室徐海燕副教授鑒定為菊科植物新疆啤酒花Humulus Lupulus L的干燥地上部分和根。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：100080-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院），AB-8、X-5、D-101、HPD-300、HPD-100、HPD-400購(gòu)置于河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。所用試劑均為分析純。

2方法及結(jié)果

21測(cè)定方法的建立

211標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取于干燥至恒重的蘆丁1000mg，置于50 mL的量瓶中，加入60%乙醇超聲溶解，加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，制成02mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

212標(biāo)準(zhǔn)曲線建立分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1、2、3、4、5、6mL至25mL容量瓶中，各加入60%乙醇至6 mL，先加入5%NaNO2溶液1mL，混勻，放置 6min；再加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，混勻，放置6min；接著加入4%NaOH溶液10mL，搖勻，最后加入60%的乙醇定容至刻度，放置15min，以510nm處的吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=98624X-00054，r=09997，線性范圍為0008～0048 mg/mL。

213提取液制備[10]稱取新疆啤酒花藥材粗粉200g， 60%乙醇超聲提取40min，料液比為1∶15，過(guò)濾，經(jīng)測(cè)定總黃酮含量為81mg/g。

22樹脂預(yù)處理[11]將新購(gòu)買的大孔樹脂用95%乙醇浸泡24h，濕法裝柱后，用95%乙醇洗脫，到水與流出液混合不呈白色為止，再用適量水洗盡乙醇至無(wú)醇味，備用。

23大孔樹脂類型的篩選稱取處理好的6種大孔吸附樹脂：AB-8、X-5、D-101、HPD-300、HPD-100、HPD-400、各2g，放入25mL錐形瓶中，然后再加入20mL的新疆啤酒花溶液，在恒溫振蕩器連續(xù)振搖24h。過(guò)濾后得到吸附液，放入25mL容量瓶中，以60%乙醇定容。測(cè)定各吸附液中的總黃酮濃度，按照公式計(jì)算各樹脂的吸附率和吸附量。并將上述吸附飽和后的樹脂，再加入95%乙醇20mL置于錐形瓶中，振蕩24h進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液中的總黃酮濃度，并計(jì)算各樹脂的解析率。

吸附率=（Po-Pa）/Po（%）

式中Po：樣品液中總黃酮的初始濃度（mg/mL）；Pa：吸附平衡后溶液中總黃酮濃度（mg/mL）

吸附量=（Po-Pa）×V/W

式中Po：樣品液中總黃酮的初始濃度（mg/mL）；Pa：吸附平衡后溶液中總黃酮濃度（mg/mL）；V：樣品液的體積（mL）；W：樹脂重量（g）

解析率=（洗脫液濃度×洗脫液體積）/（樣品液的初始濃度-平衡液中樣品濃度）×樣品體積×100%，結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1樹脂吸附考察結(jié)果

樹脂型號(hào)AB-8X-5D-101HPD-300HPD-100HPD-400吸附率/%750273118986812682758372吸附量/mg/g101221233238311128982657解析率/%741278028516792672547921

根據(jù)表1，考慮不同樹脂在靜態(tài)吸附-解析實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果，確定D-101樹脂為富集新疆啤酒花中總黃酮的最佳樹脂。

24大孔樹脂富集總黃酮有效部位工藝考察

241最佳上樣濃度篩選分別量取濃度04、05、06 g/mL的樣品溶液各30mL，以10mL/min的流速上樣，吸附后再測(cè)定各流出液中總黃酮的含量，并計(jì)算其洗脫率。結(jié)果表明，上樣液濃度為05g/mL，洗脫率最高，結(jié)果見(jiàn)表2。表2最佳上樣濃度篩選結(jié)果

上樣濃度/g/mL洗脫率/%046237058045067382077631

242最大上樣體積選擇量取05 g/mL的上樣液100mL，以10 mL/min的速度進(jìn)行上樣，以每5mL為1份，收集各份洗脫液，并測(cè)定其總黃酮含量，確定最大上樣量樣品中總黃酮濃度從第6份處濃度率顯著增大，在此處開(kāi)始泄漏。綜合考慮，確定30mL為最大上樣量，即15BV。，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

243最佳上樣流速篩選量取05 g/mL的上樣液適量，分別以05、10、15mL/min流速上樣，收集各流速下的流出液，測(cè)定其總黃酮含量，計(jì)算洗脫率，結(jié)果選擇吸附流速為10 mL/min，結(jié)果見(jiàn)表3。 表3最佳上樣流速選擇結(jié)果

上樣流速/mL/min洗脫率/%056732107845157456

244最佳洗脫溶劑與用量的選擇量取05g/mL的樣品溶液30mL，加于20mL（1BV）D-101樹脂柱上，以10 mL/min的速度進(jìn)行吸附，先用水（3BV）洗除雜，再采用20%，30%、50%、70%、95%乙醇各120mL（6BV）進(jìn)行洗脫，每1BV收集一次，以1mL/min流速洗脫，測(cè)定各洗脫液中總黃酮的濃度，確定最佳洗脫溶劑為50%乙醇。

由圖2可知，總黃酮濃度從第5份以后，總黃酮濃度變化不大，綜合考慮確定洗脫劑用量為5BV。

245洗脫流速的篩選量取05g/mL的上樣液15BV（30mL），以10mL/min的速度上樣，用水（3BV）洗去雜質(zhì)，再用50%的乙醇分別以05、10、15mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中的總黃酮的含量，綜合考慮以10mL/min為洗脫流速，結(jié)果表4。

表4最佳洗脫流速的選擇

洗脫流速/mL/min洗脫率/%056547107932157183

246樹脂重復(fù)使用次數(shù)考察按上述確定的最佳富集條件，取含05g/ mL 藥液過(guò)柱，在同一根樹脂柱上重復(fù)操作4次，測(cè)定4次洗脫液中總木脂素的含量并計(jì)算洗脫率，結(jié)果見(jiàn)表5。 可見(jiàn)樹脂重復(fù)使用 4次后，對(duì)總木脂素的吸附與解吸性能未見(jiàn)明顯變化，故樹脂可以重復(fù)使用 4次以上。

表5樹脂重復(fù)使用次數(shù)考察

次數(shù)/g/mL洗脫率/%17487274683742947375

3討論

新疆啤酒花在新疆分布廣泛，具有明顯的地域特色，目前對(duì)其研究并不深入，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)其黃酮類成分研究較多。大孔吸附樹脂是一種新的富集有效成分的常規(guī)方法，常用于中藥活性成分的純化工藝研究，可以得到純度較高的中藥有效部位，為相應(yīng)的后期相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)和參照。

實(shí)驗(yàn)對(duì)新疆特色啤酒花中總黃酮類成分進(jìn)行深入研究，采用NaNO2- Al（NO3）3-NaOH法對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)，該方法穩(wěn)定可靠。并采用靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)篩選確定了最佳的樹脂類型-D-101大孔吸附樹脂，該樹脂使用十分廣泛，廣泛的用于中藥材中總黃酮類成分的富集純化工作，具有良好的實(shí)驗(yàn)效果。綜合考慮確定新疆啤酒花中總黃酮的最佳富集工藝為：采用D-101大孔樹脂，取30mL （15BV）05g/mL的上樣液，以1mL/min的速度上樣，水洗除雜，再用5BV 50%乙醇以10mL/min-1的速度洗脫。按最佳富集工藝進(jìn)行所得的洗脫物中總黃酮含量為7352%，總黃酮富集效果十分顯著，可為新疆啤酒花的進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2016-12-09編輯：梁志慶）