GPR119對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

陳志平+王嵐楓+胡蓉

＼[摘要]目的 分析THP-1巨噬細(xì)胞中過表達(dá)GPR119對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建過表達(dá)GPR119載體，轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，用佛波酯（160 nmol/L，48 h）分化成巨噬細(xì)胞。NC組：空載體轉(zhuǎn)染THP-1+Dil-oxLDL（50 μg/ml）48 h；GPR119（H）組：過表達(dá)GPR119轉(zhuǎn)染THP-1+Dil-oxLDL（50 μg/ml）48 h。檢測過表達(dá)GPR119轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞后脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果 過表達(dá)GPR119組SR-B1、APOE、LCAT基因表達(dá)顯著高于NC組表達(dá)（P=0.000）。結(jié)論 過表達(dá)GPR119能引起脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)變化。

[關(guān)鍵詞]GPR119；脂質(zhì)代謝；基因表達(dá)；THP-1巨噬細(xì)胞

[中圖分類號] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0138-03

[Abstract]Objective To investigate the effects of overexpression of GPR119 on expression of genes related to lipid metabolism in THP-1 macrophages.Methods Expression vector GPR119，and transfected into THP-1 cells with phorbol ester （160 nmol/L，48 h） to differentiate into macrophages were constructed.NC group：the empty vector transfected into THP-1 Dil-oxLDL （50 g/ml） 48 h；GPR119 （H） group：over expression of GPR119 transfected with THP-1 Dil-oxLDL （50 g/ml） 48 h.detection of lipid metabolism related genes expression in GPR119 transfected macrophages after THP-1.Results The expression of GPR119 in group SR-B1，APOE，LCAT gene expression were significantly higher than those of control group （P=0.000）.Conclusion Over expression of GPR119 can cause changes in the expression of genes related to lipid metabolism.

[Key words]GPR119；Lipid metabolism；Gene expression；THP-1 macrophage

GPR119是一個(gè)新的可能參與調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的膜受體[1-2]。GPR119屬于G蛋白偶聯(lián)受體A家族，有7個(gè)跨膜區(qū)，在胞漿內(nèi)與三個(gè)亞單位（α、β、γ）所組成的G蛋白偶聯(lián)，主要表達(dá)在胰島和胃腸道細(xì)胞[3-4]。人源性GPR119的基因定位于Xq26.1，該基因的開放閱讀框架僅有一個(gè)外顯子，不含內(nèi)含子，編碼335個(gè)氨基酸。GPR119在治療2型糖尿病及肥胖的作用有比較深入的研究，并提示GPR119可能參與脂質(zhì)代謝[5-8]。本文旨在探討GPR119是否參與脂質(zhì)代謝，研究過表達(dá)GPR119后脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

1資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞從American Type Culture Collection （ATCC，Manassas，VA，USA）獲得，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，RPMI-1640培養(yǎng)基包含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37°C，5%CO2。細(xì)胞被種植于6孔板或12孔板或60 mm平皿，并且生長到鋪滿平皿達(dá)80%～90%時(shí)待用。NC組：空載體轉(zhuǎn)染THP-1+Dil-oxLDL（50 μg/ml）48 h；GPR119（H）組：過表達(dá)GPR119轉(zhuǎn)染THP-1+Dil-oxLDL（50 μg/ml）48 h。

1.2主要儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；超凈工作臺（美國Thermo公司）；7500 Fast熒光定量儀（美國ABI公司）；胎牛血清（四季青公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；PrimeScript RRT Enzyme MixI和SYBRRPremix Ex TaqTMII等基因檢測試劑（購自Takara公司）。

1.3轉(zhuǎn)染

Lipofectamine 2000過表達(dá)GPR119，轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞（按美國Invitrogen公司說明書操作），用佛波酯（160 nmol/L，48 h）分化成巨噬細(xì)胞。

1.4基因檢測

THP-1巨噬細(xì)胞PBS清洗3遍，提取總RNA，并將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為：37℃下15 min，85℃下5 s（表1）。

按試劑說明書操作ABI 7500 Fast Real-Time RCR System，反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性30 s，95℃下5 s，60℃下34 s，40次循環(huán)后分離（表2）。

所有標(biāo)本均于同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，每份重復(fù)檢測3次。

1.5檢測指標(biāo)

檢測過表達(dá)GPR119轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞后脂質(zhì)代謝相關(guān)基因清道夫B1（SR-B1）、載脂蛋白E（APOE）及卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

采用實(shí)時(shí)定量PCR測定過表達(dá)GPR119后THP-1巨噬細(xì)胞中SR-B1、APOE及LCAT表達(dá)，結(jié)果表明，與NC組比較，GPR119（H）組SR-B1、APOE及LCAT表達(dá)顯著升高（P<0.01）（表3）。

3討論

本研究表明，過表達(dá)GPR119后THP-1巨噬細(xì)胞中SR-B1、APOE、LCAT表達(dá)顯著上調(diào)（P=0.000）。SR-B1是一個(gè)多配體受體，能在高密度脂蛋白（HDL）與細(xì)胞間介導(dǎo)雙向脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，可以在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的巨噬細(xì)胞中表達(dá)，對肝臟膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和抗動(dòng)脈粥樣硬化都是必須的。SR-B1敲除鼠可導(dǎo)致快速的冠狀動(dòng)脈閉塞、心肌梗死、心功能降低和死亡，提示SR-B1對于脂質(zhì)調(diào)節(jié)和抗動(dòng)脈粥樣硬化起重要作用[9]。APOE是血漿中脂蛋白的重要組成成分，在脂質(zhì)代謝中起著重要作用，APOE通過不同機(jī)制對動(dòng)脈粥樣硬化起一定抑制作用[10]。LCAT是一種血漿中起催化作用的酶，其作用是將HDL的卵磷脂的C2位不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)移給游離膽固醇，生產(chǎn)溶血卵磷脂和膽固醇酯，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[11-12]。

GPR119在治療2型糖尿病及肥胖的作用已有比較深入的研究。GPR119與激動(dòng)劑結(jié)合后，通過cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)葡萄糖依賴性胰島素和腸肽激素的分泌，是治療2型糖尿病和肥胖癥的藥物靶點(diǎn)[13-14]。最新研究表明，GPR119在APOE敲除鼠中降低血清脂質(zhì)和炎癥因子，可能成為動(dòng)脈粥樣硬化的治療靶點(diǎn)[15-17]。

本研究提示，GPR119在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝平衡中發(fā)揮重要作用，間接參與對肝臟膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，可能為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2016-12-22 本文編輯：顧雪菲）