辣椒類Pto蛋白激酶（PLPK）基因家族全基因組分析和進化研究

Jelli Venkatesh Molly Jahn Byoung-Cheorl Kang *

（1. 植物科學與植物基因組育種研究所， 蔬菜育種研究中心， 首爾大學 首爾， 151–921韓國； 2. 威斯康星大學， 麥迪遜市 威斯康星州，WI53706美國）

1 前言

植物應(yīng)對病原物產(chǎn)生了多種防御反應(yīng)?？共⌒酝ǔＪ怯芍参锟共』颍≧）編碼的蛋白和病原物無毒基因（Avr）編碼的相應(yīng)效應(yīng)蛋白的基因?qū)蚍绞交プ鳟a(chǎn)生的。這種互作激活了寄主中抑制病原物入侵的防御相關(guān)級聯(lián)反應(yīng)[1-2]。一些植物的R基因已經(jīng)被克隆，對寄主抗性機制的研究也取得了很大進展[3-8]。

植物的R基因根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分為8類[7,9]。醋栗番茄（Solanum pimpinellifoliumL.）的Pto基因是R基因的最好例子[10]。Pto編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶（STK）與抗丁香假單胞菌（P. syringae）的效應(yīng)蛋白AvrPto和AvrPtoB直接互作，從而引發(fā)寄主植物的抗性[12,14-15]。AvrPto和AvrPtoB在其原本不存在的細菌菌株中表達時顯示毒性會增加[16-18]。AvrPtoB的致病機理是通過抑制細胞程序性壞死來擾亂寄主的防御反應(yīng)[18]。有趣的是，AvrPto也能夠抑制本氏煙（Nicotiana benthamiana）和番茄中非寄主病原體導(dǎo)致的細胞程序性壞死[19]。在抗Pst系統(tǒng)中已經(jīng)確定了三類下游效應(yīng)器。Pti1是增強體內(nèi)超敏反應(yīng)的蛋白激酶；Pti4、Pti5和Pti6是防御相關(guān)的類乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子（EREBP）[16,20-21]，Prf是一個結(jié)合核苷酸的富亮氨酸重復(fù)（NB-LRR）的蛋白質(zhì)。通過Prf的識別，AvrPto效應(yīng)子使Pto激酶磷酸化，從而產(chǎn)生抗性[22-25]。

盡管對植物特別是番茄中的Pto通路基因有了廣泛的研究，但除了茄屬植物，其他植物都沒有鑒定到識別AvrPto的Pto功能同系物。在一些植物物種中尋找類Pto序列一直都在嘗試[26-27]。在這些研究中，有人認為識別AvrPto的分子可能類似于番茄中的Pto激酶。然而，突變分析顯示AvrPto蛋白在番茄和煙草中被差異性識別[17]，這表明煙草中的AvrPto識別蛋白可能與番茄Pto序列無關(guān)[17]。已有報道在大豆中鑒定出了AvrPto[28]，這表明AvrPto的識別和下游信號級聯(lián)可能在物種間保守[28]。植物中對AvrPto的識別也引起了關(guān)于AvrPto識別蛋白在Pst非寄主物種中的作用問題。

最近，已經(jīng)在一些茄屬植物[27]以及菜豆[26]、葡萄[29]、黃瓜[30]、香蕉[31]、草莓[32]和柑橘[33]等植物中鑒定出類Pto基因。但是，兩種不同的番茄（S.lycopersicum）基因型中不存在Pto同源物[34-35]。而由特異性AvrPto和Pto介導(dǎo)的抗性可能是從醋栗番茄（Solanum pimpinellifoliumL.）中進入到一些栽培番茄品種中[10,36]。盡管對Pto基因在分子遺傳學方面研究有所進展，但對Pto基因的分子進化研究仍然知之甚少。了解Pto基因的進化關(guān)系對于解開其功能差異以及了解其在非寄主抗病性中的作用非常重要。

辣椒是一種重要的香料作物，一直被認為是Pst的非寄主。有證據(jù)表明辣椒可能具有識別AvrPto蛋白并誘導(dǎo)抗性的能力[19]。然而，Pto激酶并未被確定為識別組分。本研究中，我們使用PVX系統(tǒng)檢測辣椒能否識別AvrPto。此外，我們對辣椒中類Pto基因家族（PLPKs）進行了全基因組分析，共確定了25個PLPK基因，同時基于序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將其分為8個亞族（PLPKⅠ－PLPKⅧ）。為了解植物類Pto基因的進化多樣性，使用其他茄科植物如番茄、馬鈴薯、本氏煙（Nicotiana benthamiana）、擬南芥和水稻的Pto家族基因進行系統(tǒng)發(fā)育比較和分子進化分析。根據(jù)計算機工具研究辣椒PLPK的結(jié)構(gòu)特征。最后，我們使用RNA-seq數(shù)據(jù)對各種辣椒基因型的PLPK基因表達譜進行分析。

2 材料與方法

2.1 植物材料

本研究使用Robert Stall提供的C.annuum‘NuMex Rnaky’（RNaky），Early CalWonder 30（ECW），‘Criollo de Morelos 334’（CM334），‘Perennial’，C. chinense‘PI159234’（234）和‘Habanero’等不同基因型的辣椒品種。試驗品種包括生產(chǎn)中重要的易感病品種（ECW和RNaky），以及抗病品種（Perennial，CM334，Habanero和PI159234）。使用本氏煙（Nicotiana benthamiana）進行PVX載體擴增。

2.2 使用PVX衍生載體在辣椒中瞬時表達AvrPto

將G.Martin和X.Tang提供的AvrPto和AvrPtoI96T突變體克隆到由D.Baulcombe提供的pPVX201載體中，來構(gòu)建PVX衍生載體的瞬時表達系統(tǒng)[37]。選 擇 5'-ATATCGATGGGAAATATATGTGTC-3'和5'-GAGGTCGACATTATGACGCC-3'作 為 引 物，利用PCR從質(zhì)粒pPtE6[28]和pPtE6:I96T[17]中擴增每個AvrPto基因的528 bp編碼區(qū)。引物中的ClaI和Sall位點用下劃線標注。擴增片段克隆到pGEMT載體中，并通過測序檢測。用限制酶ClaI和Sall消化基因并亞克隆到相應(yīng)載體位點。所得到的pPVX201衍生物稱為pPVX201::AvrPto和pPVX201::AvrPtoI96T。攜帶GFP cDNA的pPVX201衍生物pPVX204當作對照[37]。利用15%膨潤土懸浮液和43 mM磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），將≥50 μg的質(zhì)粒摩擦接種到4～6周大小的本氏煙草（Nicotiana benthamiana）中[37]，產(chǎn)生接種物。使用pPVX201、pPVX204或pPVX載體，系統(tǒng)侵染本氏煙草（Nicotiana benthamiana），在接種后14 d其出現(xiàn)了系統(tǒng)花葉病癥狀，而pPVX::AvrPto導(dǎo)致植株白化和出現(xiàn)死斑，然后出現(xiàn)系統(tǒng)壞死癥狀[38]。沒有發(fā)生壞死癥狀的本氏煙（Nicotiana benthamiana）的煙葉在接種后10～14 d用50 mM磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）進行勻漿，然后摩擦接種到6～8周大小的辣椒植株中。模擬接種的辣椒作為常規(guī)對照。通過雜交分析和抗PVX抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（Agdia, Elkhart, IN）確定感染[39]。接種14 d后從植物的未接種上部葉提取總RNA，將其印跡到尼龍膜N+上，并與放射性標記的PVX衍生序列和AvrPto序列雜交。

2.3 Pto通路同源物基因定位和全基因組分析

利用已發(fā)表的辣椒遺傳連鎖圖譜[40]來確定Pto通路基因的位置。Pto、Fen和Prf克隆的cDNA由S.D.Tansksley（康奈爾大學，伊薩卡，紐約）提供。Pti1、Pti4、Pti5和Pti6的克隆基因由G.Martin（康奈爾大學，伊薩卡，紐約）提供。為研究PI159234和NuMex Rnaky品種的限制性片斷長度多態(tài)性（RFLPs），用EcoRⅠ、EcoRⅤ、DraⅠ、BclⅠ、BstNⅠ、HindⅢ和XbaⅠ限制酶消化親代DNA，并與Pto通路基因雜交。根據(jù)Livingstone等[40]描述的75個植物F2代的定位來收集RFLP標記物的分離。通過MAPMAKER軟件對照原始框架標記數(shù)據(jù)集，來確定PCR克隆片段的圖譜位置。

以番茄（S.pimpinellipolium）中具有Pto基因同源序列的LpimPth2（AAF76305）,LpimPth3（AAF76304）,LpimPth4（AAF76303）,Fen_kinase（AAF76307） 和Pto_kinase（AAF76306） 作 為引用數(shù)據(jù)，使用BLAST程序在CM334 20140109（v1.5）PROTEINS數(shù) 據(jù) 庫（http://cab.pepper.snu.ac.kr/）中鑒定出辣椒（C.annuum）基因組的Pto基因家族成員。從茄科基因組學資源數(shù)據(jù)庫（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/）中獲得預(yù)測的馬鈴薯Pto蛋白同源序列。在擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫（TAIR）和水稻基因組注釋計劃（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中以番茄Pto同源序列作為引用數(shù)據(jù)，利用BLAST程序獲得擬南芥和水稻的類Pto蛋白激酶序列。利用番茄Pto序列作為引用數(shù)據(jù)在茄科基因組學數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）中進行BLASTP比對得到番茄和煙草的類Pto蛋白序列。我們也使用番茄Prf1（AAF76308）、Pti1（U28007）、Pti4（U89255）、Pti5（U89256）和Pti6（U89257）序列作為引用數(shù)據(jù)，通過BLAST程序鑒定出番茄Prf同系物和辣椒Pti同系物。

2.4 辣椒類Pto基因和其他辣椒Pto通路相關(guān)基因的染色體定位

通過辣椒基因組數(shù)據(jù)庫（http://cab.pepper.snu.ac.kr/）獲得辣椒PLPK基因和其他Pto通路基因的染色體定位。使用MapChart程序?qū)LPK定位到辣椒染色體上[41]。從辣椒基因組數(shù)據(jù)庫（http://cab.pepper.snu.ac.kr/）獲得辣椒基因組的DNA和CDS序列。在GSDS網(wǎng)站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/） 中通過比較基因組DNA和其對應(yīng)的CDS序列，做出PLPK基因和其他Pto通路基因外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。

2.5 確定進化分析與保守模體

進化樹中包括辣椒、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥和水稻等植物的蛋白序列以確定進化關(guān)系。為確定辣椒和其他物種PLPKs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用所有可得到的植物物種PLPK序列，例如水稻、擬南芥、番茄、煙草和辣椒預(yù)測的PLPK序列，使用 Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）程序（參數(shù)默認）進行多重序列比對。各種類型的擬南芥蛋白激酶[42]也包括在系統(tǒng)發(fā)育分析中，用來區(qū)分Pto和PLPK成員。使用軟件JalView 2.8[43]編輯由高差異區(qū)域或缺失造成不確定比對的序列，并將其排除在進一步分析之外。使用MEGA 6.0軟件（鄰接法）對全長PLPK序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析[44]，Bootstrap參數(shù)為1 000。類似地，對辣椒的PLPK蛋白進行了單獨的系統(tǒng)進化分析。在進化樹根是辣椒類受體激酶（PLK）蛋白。由其他植物的PLPK成員的進化關(guān)系對辣椒的PLPK蛋白成員進行分類。通過EuLoc網(wǎng)站對辣椒PLPK進行亞細胞定位預(yù)測[45]。利用SMART網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）來分析PLPK蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域。

2.6 選擇壓力檢測

利用Datamonekey在線服務(wù)器（http://www.datamonkey.org/）來估計核酸密碼子的非同義（dN）和同義（dS）替換速率，以及dN與dS的比值（ω），以此確定Pto和PLPK蛋白殘基的絲氨酸/蘇氨酸激酶（STK）結(jié)構(gòu)域選擇壓力的性質(zhì)。為避免假陽性，我們進行了重組檢測的遺傳算法（GARD）[46]。在Datamonekey網(wǎng)站上[47]我們使用幾種基于密碼子的最大似然法計算特定位點的選擇壓力：固定效應(yīng)似然法（FEL），內(nèi)部固定效應(yīng)似然法（IFEL）和單一似然祖先計算（SLAC）。使用REV核酸替換模型來研究核酸位點。為確定多樣化選擇的單獨密碼子，我們進行了進化的混合效應(yīng)模型（MEME）分析。ω值< 1表示負（純化）選擇，ω值> 1表示正（多樣化）選擇，ω＝1表示位點不受選擇壓力的影響。

2.7 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

利用前人研究的RNA-seq數(shù)據(jù)對各種辣椒基因型中PLPK基因的表達模式進行分析[48]。使用軟件CLC Genomics Workbench v8.0（CLC Bio,Aarhus, Denmark）（參數(shù)默認）將測序片段比對到辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中（http://cab.pepper.snu.ac.kr）。所得數(shù)據(jù)用每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的讀長（RPKM）標準化。RPKM值進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，并使用R中g(shù)gplot包的heatmap.2函數(shù)生成熱圖。

3 結(jié)果

3.1 辣椒中AvrPto特異性誘導(dǎo)超敏反應(yīng)和PVX抗性

圖1 接種PVX載體的辣椒幼苗用于表達GFP，AvrPto和AvrPtoI96T

為了確定辣椒中是否發(fā)生了AvrPto的特異性識別，我們使用PVX衍生載體[49]表達AvrPto和AvrPtoI96T，體外和體內(nèi)實驗中96位點的取代突變阻止AvrPto和Pto的相互作用，使其對毒力沒有影響[17]。在預(yù)實驗中，我們對包括Perennial、234、Habanero、Rnaky、ECW和CM334等6種不同的辣椒基因型進行PVX的易感性篩選（附圖1）。單獨接種載體時，234、Habanero、ECW和Rnaky基因型的整個植株出現(xiàn)感病癥狀（附圖1）。隨后生長的234和ECW基因型植株被單獨接種PVX載體或者GFP、AvrPto和AvrPtoI96T來表達構(gòu)建體（圖1）。病原和PVX同源序列在接種部位 （數(shù)據(jù)未顯示）和上部未接種組織（圖1）都存在，并且接種GFP構(gòu)建體的植株中，其未接種的葉片在紫外線下產(chǎn)生熒光（數(shù)據(jù)未顯示），這些都證明單獨接種載體（附圖1） 和接種包含GFP的PVX構(gòu)建體 （圖1A中Ⅰ，Ⅱ）都導(dǎo)致了系統(tǒng)癥狀的感染。相比之下，當植物接種pPVX::AvrPto時，癥狀被限制在接種葉片下端的葉上，并表現(xiàn)出局部壞死癥狀（圖1A中Ⅲ，Ⅳ）。另外，僅在接種組織中檢測到PVX抗原、PVX-和AvrPto-同源序列（數(shù)據(jù)未顯示），而在未接種組織沒有檢測到（圖1B）。在感病的辣椒植株中，PVX從感染部位散布到整個植株。同樣，PVX::AvrPto也被認為是全身性移動。然而，PVX::AvrPto的散布在辣椒中受到限制，只能在感染的下部葉片中檢測到。這可能是由于AvrPto是通過Pto同系物定位在接種葉上，從而抑制PVX::AvrPto的全身移動。因此，在未接種的上部葉片中PVX和AvrPto都沒有檢測到（圖1B，道4）。

根據(jù)局部病變特征性壞死的出現(xiàn)，所有對PVX敏感的辣椒基因型似乎都識別AvrPto，因此不適用需要不同寄主反應(yīng)的常規(guī)遺傳方法。與Pto不互作的突變激發(fā)子AvrPtoI96T的獲得，讓我們有了一種替代方法。如果辣椒Pto同源序列在體內(nèi)編碼可以識別AvrPto的功能基因產(chǎn)物，且該識別對定位PVX感染是重要的，那么表達AvrPtoI96T的PVX載體應(yīng)該是系統(tǒng)性擴散的。當辣椒幼苗接種pPVX::AvrPtoI96T后，在不親和互作中觀測到在接種的葉片上出現(xiàn)褪綠斑點，局部性壞死發(fā)展為相同尺寸的壞死性暈圈。這些癥狀隨后遍布整個植株（圖1A中Ⅴ, Ⅵ）。由于PVX抗原的存在（數(shù)據(jù)未顯示）和上部未接種葉片的總RNA與PVX-和AvrPto-同源探針的雜交證實系統(tǒng)感染（圖1B）。

總之，只有兩種辣椒品種表達AvrPto的PVX載體限于接種組織。其他所有PVX載體全身移動，這與辣椒中Pto同系物可以在體內(nèi)識別AvrPto假設(shè)一致。

3.2 Pto和PLPK的鑒定、分類和進化關(guān)系

為鑒定AvrPto可能的互作因子，我們對栽培種CM334進行全基因組分析，尋找辣椒中的番茄Pto同系物。我們用許多植物的Pto同源物和擬南芥的PLK構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[42]，將Pto同系物與含STK結(jié)構(gòu)域的其他類型的蛋白區(qū)分開。只有在系統(tǒng)進化樹中包括STK結(jié)構(gòu)域亞域Ⅰ和Ⅺ之間的區(qū)域，包括PLPK在內(nèi)的Pto同系物清晰地形成了擬南芥PLK和其他蛋白激酶的獨立簇（附圖S2）。根據(jù)序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析，我們在辣椒基因組中鑒定出25個Pto類蛋白激酶基因（表1）。

為了確定Pto和PLPK同源物之間的進化關(guān)系，并對辣椒PLPK進行分類，我們用預(yù)測的辣椒PLPK序列和許多植物（比如番茄、煙草、馬鈴薯、擬南芥和水稻）的全長Pto和PLPK同源物構(gòu)建進化樹（圖2）。系統(tǒng)進化分析顯示在Pto同系物之間，Pto和PLPK存在兩個不同的簇（圖2）。茄科植物的Pto進化枝不同，并且在這個進化枝中番茄Pto同源物聚在一起。然而，在辣椒中沒有發(fā)現(xiàn)Pto進化枝成員，這表明Pto的起源發(fā)生在茄科亞系的早期進化階段。辣椒PLPK進一步分成八個亞族（PLPKⅠ至PLPKⅧ）。在PLPKⅠ和PLPKⅣ亞族中，許多雙子葉植物的PLPK聚集在一起，而PLPKⅡ、PLPK Ⅲ、PLPKⅤ、PLPKⅥ 和PLPKⅦ亞族中，雙子葉植物和單子葉植物PLPK成員都存在。然而，在PLPKⅡ和PLPKⅢ亞族中，單子葉和雙子葉植物形成了不同的進化枝。除了在茄科中比較特別的PLPKⅧ亞族，其他所有的PLPK亞族中都觀測到了至少一個擬南芥的PLPK成員?？傊?，系統(tǒng)進化分析表明辣椒PLPK基因簇模式與其他雙子葉植物相似。此外，在進化樹中的雙子葉植物成員中間發(fā)現(xiàn)來自水稻的PLPK成員，這意味著PLPK蛋白家族是在單子葉和雙子葉植物的共同祖先中進行進化。

3.3 辣椒PLPK蛋白家族系統(tǒng)進化分析

我們單獨構(gòu)建了辣椒PLPK蛋白系統(tǒng)進化樹，來確定辣椒PLPK蛋白之間的系統(tǒng)進化關(guān)系。從這個進化分析來看，辣椒PLPK蛋白可以分為 PLPKⅠ和 PLPK Ⅷ 8個亞族（圖3）。亞族PLPKⅠ和PLPKⅥ包括2個成員，PLPKⅢ和PLPKⅤ包括3個成員，PLPKⅡ、PLPKⅣ、PLPKⅦ和PLPKⅧ分別包括1、3、6、5個成員。

3.4 辣椒PLPKs和番茄Pto與PLPK的比較系統(tǒng)進化分析

為了確定辣椒和番茄Pto同源物的進化關(guān)系，我們生成了一個系統(tǒng)進化樹（圖F3），這表明辣椒中不存在類Pto成員。除了PLPKⅥ族在番茄中沒有存在外，其他所有的PLPK同源物在辣椒和番茄中都顯示出相同的聚類模式。辣椒和番茄的PLPKⅠ、 PLPKⅡ和PLPKⅣ族成員數(shù)量是一樣的，分別是1、2和3個。番茄和辣椒的PLPKⅦ族中分別鑒定到5和6個成員。在PLPKⅧ族中，在辣椒中發(fā)現(xiàn)了5個成員，而在番茄中只有1個成員。這些觀測結(jié)果表明，茄科植物中存在Pto和PLPK亞系擴大和分化。

表1 辣椒中類Pto基因和其他與Pto途徑相關(guān)基因

3.5 辣椒PLPK和Pto通路基因的染色體分布和結(jié)構(gòu)

我們根據(jù)基因在染色體上的順序?qū)⒗苯稰LPK基因命名為PLPK1到PLPK25。表1中列出了辣椒基因名稱和其ID的詳細信息。25個PLPK基因中有7個未被定位到染色體上。其余的18個PLPK基因定位到6條染色體上。Chr1、Chr4、Chr5、Chr8和Chr12上的染色體數(shù)差別很大，Chr2上最多有7個，Chr3和Chr6各有3個PLPK基因。Chr9和Chr10分別觀測到了2個PLPK基因，然而Chr7只有1個基因（附圖S4A）?；谶B鎖圖譜分析，在未分配到任何染色體的7個PLPK基因中，至少有一個PLPK基因能分配到Chr12，并且2個PLPK基因（HPto-a和HPto-d）與Prf同系物Prf1.2（HPrf-c）和Prf1.3（HPrf-b）可以定位到Chr11（附圖S4B）。HPto-a和HPrf-b（Prf1.3）被定位在番茄Pto進化枝的對應(yīng)位置，這表明HPto-a是番茄Pto的直系同源物。然而，與嵌入Pto簇的番茄Prf相比，HPrf-b與HPto-a距離約2 cM。

圖2 番茄Pto旁系同源基因與PLPK基因的系統(tǒng)進化分析

在 4個 Prf同 源 物 中，Prf1.1位 于 Chr4，Prf1.2和Prf1.3位于Chr11，Prf1.4不與任何染色體相關(guān)。在4個Pti1同源基因中，Pti1.1、Pti1.2（HPti1-a）和Pti1.3分別位于Chr3、Chr5和Chr12，基于連鎖圖，Pti1.4（Hpti1-b）可能位于Chr5（附圖S4B）。在辣椒中檢測到的2個Pti1同系物HPti1-a和Hpti1-b與番茄Chr5具有共線性，且Pti4、Pti5和Pti6.1分別位于Chr5、Chr2和Chr6。Pti6.2不位于任何染色體。

外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，辣椒大多數(shù)PLPK基因的內(nèi)含子較少，少數(shù)例外；PLPK3、PLPK5、PLPK6、PLPK7和PLPK18顯示有 1個內(nèi)含子，PLPK4顯示有2個內(nèi)含子（圖3B）。相反，辣椒Prf基因顯示有3到6個不同長度和位置的內(nèi)含子（附圖S5）。同樣，Pti基因也被發(fā)現(xiàn)是高度分散的，并且顯示具有0到7個內(nèi)含子的復(fù)雜結(jié)構(gòu) （附圖 S5）。

3.6 辣椒PLPK基因的保守基序分析

使用Clustal Omega程序?qū)?5個辣椒PLPK蛋白的預(yù)測氨基酸序列和番茄Pto的相應(yīng)區(qū)域進行多序列比對。辣椒PLPK序列預(yù)測長度從683到898個氨基酸不等。辣椒的PLPK蛋白的預(yù)測氨基酸序列分析顯示，其與番茄Pto有54%～71%的序列同源性。在辣椒PLPK進化組中，氨基酸序列的同源性變化范圍從35%～96%。所有辣椒PLPK蛋白都顯示出約275個氨基酸的高度保守的STK結(jié)構(gòu)域（圖4）。8個亞族都含有在大多數(shù)植物的STK結(jié)構(gòu)域亞域Ⅰ至Ⅺ中發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸殘基。氨基酸序列比對表明高度保守的Pto同源物PLPK的幾個顯著特征，如STK結(jié)構(gòu)域，位于亞域Ⅶ和Ⅷ之間的激活域，以及負責與AvrPto效應(yīng)器特異性結(jié)合的內(nèi)部P+1環(huán)結(jié)合位點[50]。STK結(jié)構(gòu)域也包含幾個分散的可變氨基酸位點。另外，Pto激活域的4個自磷酸化位點（Ser或Thr）中的3個保留在所有辣椒的相應(yīng)區(qū)域中[51]。據(jù)報道，高度保守的Val55和His94的突變破壞了酵母中的Pto-AvrPto的相互作用，并抑制Pto介導(dǎo)的抗性[52]。

圖3 辣椒PLPK蛋白系統(tǒng)進化分析

我們用SMART程序來確認PLPK的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)大部分PLPK蛋白包含4個功能域：信號肽區(qū)、麥角蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和STK結(jié)構(gòu)域（圖3C）。相比之下，番茄Pto只包含STK結(jié)構(gòu)域。PLPKⅤ成員PLPK18在其C端具有額外的激酶結(jié)構(gòu)域。PLPKⅧ成員PLPK7在其N端有2個抗病性的stress-antifung結(jié)構(gòu)域。另外，幾種辣椒PLPK蛋白區(qū)域顯示出低復(fù)雜度區(qū)域（low complexity regions）。蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測工具EuLoc[45]表明，所有辣椒的PLPK蛋白質(zhì)都預(yù)測定位到質(zhì)膜上。所有的Pti1蛋白也都預(yù)測定位在質(zhì)膜上，而Pti4、Pti5和Pti6都預(yù)測定位于細胞核，Prfs被預(yù)測定位于細胞質(zhì)。

為鑒定辣椒的PLPK激活域中保守的Pto自磷酸化位點和其他關(guān)鍵殘基，我們用辣椒和番茄的Pto序列進行了多重序列比對分析（圖4）。 5個Pto自磷酸化位點中的3個，包括Thr195、Ser198和Thr199[51]在辣椒PLPKs中高度保守，有少數(shù)例外。Thr195被PLPK24和PLPK25中的Gly取代，Ser198被 PLPK10和 PLPK13中 的 Val、PLPK24和PLPK25序列中的Thr取代。 Ser198是AvrPto-Pto介導(dǎo)的超敏反應(yīng)所必需的，并且在辣椒PLPKs中高度保守。Pto自磷酸化位點Thr190在大多數(shù)辣椒PLPK中被Pro取代。在一些PLPK中，例如PLPK3、PLPK4、PLPK5 和 PLPK7，Ser被 Thr取代，產(chǎn)生了另一個磷酸化位點。在PLPK22中，Thr190被Leu取代。另外兩個Pto磷酸化殘基Thr204和Tyr207對于Pto功能至關(guān)重要，但不是對體外自體磷酸化[14,53]。這兩個Pto磷酸化殘基高度保守；然而，在所有辣椒PLPK中Thr204被Ser取代。

3.7 選擇壓力分析

我們對選擇壓力的變化進行了分析，檢驗類Pto和PLPK基因在基因倍增之后是否經(jīng)歷了適應(yīng)性進化。通過使用Datamonkey網(wǎng)站中的各種模型多序列比對，我們基于密碼子來檢測選擇壓力[47]。我們還使用GARD分析比對以排除重組斷裂點，分析顯示沒有任何重組事件的證據(jù)。

為鑒定單個密碼子過去的選擇，我們使用基于密碼子的似然方法（FEL、IFEL和SLAC）計算每個密碼子位點上的非同義（dN）和同義（dS）替換率以及dN/dS（ω）值。有趣的是，這些方法并沒有顯示在任何位點正向選擇的證據(jù)（表2和附圖S6）。大部分位點都顯示為負（凈化）選擇，而位點13和22 （取決于使用哪種模式）是以中性速率進化。有趣的是，進化混合效應(yīng)模型（MEME）確定了16個氨基酸位點（附圖S6）是處于偶發(fā)性正選擇（0.1顯著水平）。其中，位于STK結(jié)構(gòu)域的N末端有兩個氨基酸位點，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ-b和Ⅶ亞結(jié)構(gòu)域各有一個氨基酸位點，Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ亞基有兩個位點，在Ⅺ亞基有3個位點。這些結(jié)果表明，除純化作用之外，正向選擇在植物Pto同源物的進化過程中發(fā)揮了重要作用，并在適應(yīng)性抗病性的進化中也發(fā)揮了重要作用。

3.8 Pto通路基因表達圖譜

Pto通路基因的表達譜是用來自5種不同辣椒種質(zhì)的RNA-seq數(shù)據(jù)生成的[48]。為分析不同材料間辣椒PLPK基因的表達圖譜，我們根據(jù)log2轉(zhuǎn)化的RPKM值生成熱圖和層次聚類（圖5）。根據(jù)表達模式，我們將辣椒PLPK基因分為3組：C1、C2和C3（圖5）。在C1組中，相對高表達的PLPK1，PLPK12-PLPK13和PLPK16-PLPK20聚集在一起。有趣的是，除了Ⅷ亞族以外，在C1中觀測到每個辣椒至少一個PLPK亞族的基因。所有的亞族Ⅷ成員（PLPK3-PLPK7）和分別屬于亞族Ⅴ和Ⅶ的PLPK22、PLPK23都聚類到C2組，并且都是溫和水平表達。辣椒PLPK基因PLPK2、PLPK8 -PLPK11和PLPK14 - PLPK15都聚類到C3組，并以低水平表達。有趣的是，除了PLPKⅡ和PLPKⅧ亞族，每個亞族中至少有一個基因在C3組中。包括Pti和Prf的許多Pto通路基因也表現(xiàn)出中等到低的表達水平。一般來說，植物R基因在感染或未感染的植物中表現(xiàn)出低水平的組成型表達，這與其在病原體中識別一般規(guī)律一致[54-55]?？傊?，5種辣 椒 種 質(zhì)（C.annuum'PI201234'，'YCM334'，C.chinense'Aji Dulce'，'PI152225'和C.chacoense'PI260429'）基因型中Pto通路基因的表達譜非常相似（圖5），這表明辣椒物種中Pto信號基因調(diào)控機制是高度保守的。

4 討論

在番茄中，Pto位點由5個存在于5號染色體上的Pto同源物組成，這些Pto同源物可能是通過連續(xù)的基因復(fù)制和缺失進化的[10,34]。Pto位點及其在AvrPto識別特異性中的基因?qū)蚰Ｊ皆谇芽莆锓N是保守的[19,54]。然而，Pto的識別在許多茄科物種（包括辣椒和馬鈴薯）中是否是具有特異性還是未知的。盡管許多植物物種中的AvrPto已經(jīng)被鑒定了，但其識別是否由類Pto激酶介導(dǎo)尚不清楚。另外，除了番茄和煙草之外，在其他植物物種中沒有鑒定出識別AvrPto的功能性類Pto蛋白。辣椒PVX載體系統(tǒng)的結(jié)果為AvrPto的體內(nèi)識別提供了證據(jù)。當然，我們不能排除辣椒中識別AvrPto的是類Pto基因或者其他PLKs基因的可能性，除非使用反向遺傳方法來驗證該結(jié)果。Pto通過與NBLRR和Prf相互作用介導(dǎo)番茄中AvrPto/AvrPtoB的識別[56]。然而，AvrPto/AvrPtoB的靶點是各種RLK[57-60]的激酶結(jié)構(gòu)域，而不是Pto的STK結(jié)構(gòu)域。Pto被Rrf當作分子誘餌來與病原效應(yīng)蛋白相互作用[61-62]。AvrPto/AvrPtoB效應(yīng)物與幾種植物分子互作，如擬南芥GTPase RabE[63-64]和幾種PLK激酶結(jié)構(gòu)域，如 CERK1，BAK1，EFR1 和 FLS2[57-60,65]。

圖4 STK結(jié)構(gòu)域的多重序列比對

為了鑒定辣椒中可能與AvrPto相互作用的番茄Pto同系物，我們進行了全基因組分析，共鑒定了25個全長的類Pto（PLPK）基因。大多數(shù)R基因是多基因家庭的成員，并且在植物基因組中以簇的形式出現(xiàn)?；蛑貜?fù)和多樣化被認為是R基因簇進化擴張的原因[5]。一些植物物種的Pto同系物的進化分析鑒定出了Pto同源物的幾個亞族[27,30,32]。在趣的是，辣椒中沒有發(fā)現(xiàn)Pto進化枝成員。我們利用3個不同的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫“CM334”、“Chiltepin”和“Zunla-1”（http://cab.pepper.snu.ac.kr/） 和NCBI中的辣椒表達序列標簽（ESTs）證實了辣椒基因組中沒有番茄Pto同系物（Pto 進化枝）。Wan等人[66]在使用針對Pto基因保守區(qū)域設(shè)計的引物時，未在辣椒中擴增出真正的Pto同系物。此外，在番茄中進行R基因定位實驗沒有檢測出番茄類Pto的同源物[67]。除Pto進化枝外，辣椒和其他植物的茄科PLPK蛋白在進化樹枝干中均勻分布，這表明PLPK蛋白是先于單子葉和雙子葉分化由共同的祖先基因產(chǎn)生。辣椒中番茄Pto同源物的缺失進一步表明茄科的分支特異性擴大了Pto進化枝。這一觀察結(jié)果也表明，Pto基因在病原識別和抗病中的作用可能是茄科早期進化過程中產(chǎn)生的[27,35]，或者是從辣椒中喪失的。

表2 多物種類Pto基因STK結(jié)構(gòu)域正選擇分析

圖5 5個不同辣椒品種的PLPK基因表達譜

可能導(dǎo)致辣椒和一些番茄基因型中Pto進化枝缺失的潛在機制尚不清楚[34-35]。一些栽培番茄（S.lycopersicum）品種表現(xiàn)出對AvrPto特異的，從番茄（S.pimpinellifolium）引入的Pto介導(dǎo)的Pst抗性[10,36]。有2個可能的原因來解釋Pto特異識別在一些番茄品種中保留，并在一些親緣關(guān)系很近的物種中喪失的現(xiàn)象。第一，在野生番茄（S.lycopersicum）的馴化過程中，可能發(fā)生了強烈的遺傳瓶頸效應(yīng)，并導(dǎo)致缺乏Pto基因的番茄品系的選擇[35]。第二，在缺乏具有AvrPto和Pst的基因的情況下，與Pto位點相關(guān)的適合度代價可能導(dǎo)致對含有Pto基因的番茄品系的選擇[35]。雖然Pto基因位點的有毒效應(yīng)可能難以通過實驗確定[35]，但是沒有證據(jù)顯示在含有Pto位點和不含有Pto位點的番茄的近等基因與Pst抗性有相關(guān)的適合度代價[35,68]。

盡管對番茄進行了廣泛的研究，但其他茄科植物中Pto同系物的功能特異性還不太清楚。Pto同源物與番茄Pto有78%～91%的核苷酸相似性，并且其具有功能性蛋白激酶活性，但都不能與AvrPto和AvrPtoB效應(yīng)子互作[12,69]。Pto基因家族的基因復(fù)制以及隨后的多樣化可能導(dǎo)致了可變的特異識別性[70]。Pto和Pto同系物僅在幾個氨基酸殘基上變化，這可能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，導(dǎo)致與其他蛋白質(zhì)物理性相互作用能力的改變[36]。Fen基因是5個Pto旁系同源物之一，與Pto基因有87%的相似度，并參與共同的導(dǎo)致超敏反應(yīng)的信號事件。但是，它是由一個不同的信號激活的[70-71]。相反，LhirPto顯示出與Pto基因97%的相似度，只有17個氨基酸的不同使其與Pto區(qū)分開來，但是LhirPto不能取代Pto的抗病性[35]。這些觀察結(jié)果進一步表明在Pto-AvrPto的識別特異性上有選擇壓力[72]。

多樣化選擇和適應(yīng)性選擇被假定在R基因的進化中起關(guān)鍵作用。適應(yīng)性選擇被認為是推動寄主－病原體識別功能基因區(qū)進化的重要力量[5,73]。有趣的是，純化選擇似乎是對含有STK結(jié)構(gòu)域以保持其祖先狀態(tài)的基因的主要選擇性壓力[32]。然而前人的研究認為是偶發(fā)性正選擇，這表明在進化過程中選擇壓力可能發(fā)生了變化。有報道稱，適應(yīng)性進化常常涉及在某個基因的少數(shù)幾個位點上偶發(fā)的突變，并可能只影響系統(tǒng)進化的一部分基因[74]。與此一致的是，MEME分析顯示一些密碼子屬于偶發(fā)性正選擇。Pto的激活結(jié)構(gòu)域（氨基酸182和211之間的區(qū)域），在AvrPto識別中起重要作用[27]。有趣的是，我們結(jié)果顯示Ser198和Ile208這兩個位置都經(jīng)歷了片段正選擇，這意味著它們在適應(yīng)性進化中發(fā)揮了重要作用。最近的文獻顯示，已被用作Pto/AvrPto反應(yīng)的陰性對照的本氏煙草（N.benthamiana）也可以用基因?qū)虻姆绞阶R別AvrPto，并且這種識別依賴于Prf[19]。AvrPto的識別使植物產(chǎn)生抗性也在遠距離的分類群中觀察到，例如在大豆中[28]。這些觀察結(jié)果進一步表明，除了進化和平衡選擇外[72]，適應(yīng)性選擇也可能影響Pto位點的進化。

總之，在不同辣椒基因型中觀察到來自于Pst的AvrPto效應(yīng)子的識別相關(guān)的非寄主應(yīng)答。AvrPto的識別可能是由Pto同源物或其他RLK蛋白介導(dǎo)的。我們通過全基因組分析鑒定了25個辣椒PLPK基因，發(fā)現(xiàn)它們分為8個系統(tǒng)進化亞族。Pto進化枝代表茄科植物最近起源的基因家族，但PLPK基因代表了古代共同起源的分歧基因。在辣椒基因組中沒有番茄Pto旁系同源物，這表明Pto基因家族經(jīng)歷了對Pst抗性的不同適應(yīng)性進化過程。辣椒PLPK基因的特點是存在高度保守的STK結(jié)構(gòu)域。PLPK基因中與碳水化合物結(jié)合的麥芽糖結(jié)合蛋白類似結(jié)構(gòu)域的存在暗示糖代謝與疾病抗性信號傳導(dǎo)通路可能具有某種聯(lián)系[75]。在全部5種的辣椒基因型中觀察到Pto通路基因的類似表達譜，這些觀察結(jié)果表明具有高度保守功能域的PLPK基因與辣椒基因型中的Pto信號傳導(dǎo)通路有共同的高度保守的基因調(diào)控機制。對于Pto和PLPK，以及它們與AvrPto或其他效應(yīng)物的相互作用的進一步研究將對植物－病原體共同進化過程提供更多思路，對于辣椒PLPK基因的全基因組分析為進一步功能研究提供了重要的基因資源，也為揭示辣椒非寄主抗病性提供了分子基礎(chǔ)。

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（文獻來源：PLoS ONE 11（8）： e0161545）華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院 胡震竺 劉越 孔秋生 譯