意大利蜜蜂血淋巴HP19蛋白的表達(dá)及功能

王 琦，劉川冬，張智博，于 鶴，鄭彬悅，李江紅

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002)

意大利蜜蜂血淋巴HP19蛋白的表達(dá)及功能

王 琦，劉川冬，張智博，于 鶴，鄭彬悅，李江紅*

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002)

昆蟲血淋巴蛋白HP19主要參與蛻皮激素調(diào)控昆蟲的變態(tài)及發(fā)育進(jìn)程，蜂群內(nèi)的工蜂、蜂王和雄蜂具有不同的變態(tài)和發(fā)育歷期，為探究hp19在調(diào)控意大利蜜蜂Apismelliferaligustica三型蜂變態(tài)發(fā)育中的作用，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對hp19在不同發(fā)育時(shí)期的工蜂、雄蜂和蜂王體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該基因在工蜂和雄蜂3齡幼蟲體內(nèi)表達(dá)量分別為參照基因的104和105倍，在5齡幼蟲體內(nèi)的表達(dá)則分別降為參照的10和102倍，蛹期表達(dá)量又都顯著提高。hp19在蜂王整個(gè)幼蟲期的表達(dá)保持在參照的102倍，封蓋后逐漸上升，至化蛹前達(dá)到參照的105倍。在成年工蜂體內(nèi)的表達(dá)為參照的104倍，而在新羽化蜂王和雄蜂體內(nèi)表達(dá)水平為參照的107倍，但在性成熟的產(chǎn)卵蜂王和雄蜂體內(nèi)的表達(dá)顯著降低至參照的104倍。hp19在三型蜂體內(nèi)這種不同的表達(dá)模式說明其不僅與三型蜂差異的變態(tài)發(fā)育歷期有關(guān)，還可能與雄蜂和蜂王的生殖有關(guān)，具有多樣的生物學(xué)功能。

意大利蜜蜂；HP19；熒光定量PCR；轉(zhuǎn)錄表達(dá)；功能

變態(tài)是許多昆蟲的發(fā)育方式，其幼蟲和蛹在形態(tài)和生理方面差異明顯，這其中涉及儲存蛋白的作用(Krameretal., 1980; Roberts and Brock, 1981; Miller and Silhacek, 1982; Telferetal., 1983; Wyatt, 1990; Daniel, 2003) 。儲存蛋白是由6個(gè)相同或相似亞基組成的六聚或多六聚蛋白質(zhì)集合體，其亞基分子量在72-90 kDa(Thorstenetal., 1998; Yu, 2002; Marcia, 2006) 。研究表明多聚體蛋白hexamerin是昆蟲體內(nèi)主要的儲存蛋白，由幼蟲期脂肪體合成并釋放到血淋巴中，在末齡幼蟲期含量達(dá)到最高峰。在蛹期由脂肪體細(xì)胞對這些蛋白進(jìn)行重吸收，以滿足化蛹過程中的物質(zhì)和能量需求(Ismail and Dutta, 1990; Wang and Haunerland, 1994) 。此外，研究發(fā)現(xiàn)儲存蛋白還參與昆蟲飛行肌肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白的形成(Levenbook and Bauer, 1984) 。還在卵的發(fā)育(Diana, 1996) 、成蟲的滯育(Nagamanju, 2003) 以及脂質(zhì)運(yùn)輸(Lewis, 2002; Hahn, 2004) 等多種生物學(xué)進(jìn)程中也起著重要作用，功能多樣。

昆蟲發(fā)育受到激素的調(diào)控，20-羥基蛻皮激素(20E)控制昆蟲從幼蟲到成蟲的發(fā)育。在米蛾Corcyracephalonica末齡幼蟲，20E刺激酪氨酸激酶磷酸化一個(gè)位于脂肪體細(xì)胞膜上的分子量為120 kDa的儲存蛋白受體，只有磷酸化的受體才可以介導(dǎo)血淋巴內(nèi)的儲存蛋白通過內(nèi)吞作用重吸收至細(xì)胞內(nèi)，用于重構(gòu)蛹的結(jié)構(gòu)和組織(Wang and Haunerland, 1993) 。這一發(fā)育調(diào)節(jié)過程在麗蠅、麻蠅和果蠅等雙翅目昆蟲中都得到證實(shí) (Ueno and Natori, 1984; Burmesteretal., 1999; Hansenetal., 2002),是在昆蟲體內(nèi)普遍存在的一種變態(tài)發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，儲存蛋白受體磷酸化是昆蟲能夠完成從幼蟲到蛹變態(tài)發(fā)育的先決條件。

溶酶體在真核生物體內(nèi)負(fù)責(zé)舊組織的裂解與新組織的重構(gòu)，酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸的水解酶，是昆蟲體內(nèi)常用于研究溶酶體活性的標(biāo)記酶。研究表明昆蟲體內(nèi)ACP活性受20E滴度正調(diào)控(Verkuil, 1980),在幼蟲組織器官發(fā)生裂解、化蛹前的末齡幼蟲期活性達(dá)到峰值。但進(jìn)一步的研究表明ACP的活性在20E單獨(dú)作用下保持不變，還需要血淋巴內(nèi)一分子量為19 kDa的蛋白因子(HP19)誘導(dǎo)。氨基酸序列分析表明HP19屬于谷胱甘肽家族的S-轉(zhuǎn)移酶(GST),但普通GST在20E的作用下沒有增強(qiáng)ACP活性的能力。通過向米蛾幼蟲體內(nèi)注射親和純化的HP19多克隆抗體(αHP19- IgG) 來抑制它的功能，發(fā)現(xiàn)脂肪體中的ACP活性下降，導(dǎo)致幼蟲只能發(fā)育為幼蟲與蛹或蛹與成蟲的中間體，無法完成正常的發(fā)育(Abul and Damodar, 2007)。這進(jìn)一步說明HP19在昆蟲變態(tài)期是通過與20E相互作用來提高酸性磷酸酶活性，影響儲存蛋白受體磷酸化，進(jìn)而影響和調(diào)控昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程。

研究顯示HP19對儲存蛋白受體的磷酸化有抑制作用(Arifetal., 2004) 。在米蛾幼蟲血淋巴中高含量的HP19及低蛻皮激素滴度抑制了酪氨酸激酶活性，從而降低了儲存蛋白受體的磷酸化，使其不能吸收儲存蛋白，昆蟲保持在幼蟲發(fā)育的階段。而在幼蟲末期，蛻皮激素滴度較高而HP19含量較低，刺激酪氨酸激酶活性，增強(qiáng)了儲存蛋白受體的磷酸化，從而使儲存蛋白得以吸收，迅速進(jìn)入化蛹過程。HP19與酪氨酸激酶抑制劑均可以抑制酪氨酸激酶活性與儲存蛋白受體的磷酸化，且HP19的抑制作用十分快速、高效(Tomaschko, 1999; Abuletal., 2008) 。但在缺少20E的條件下HP19對酪氨酸激酶活性的抑制作用明顯降低，甚至無抑制作用。這些結(jié)果說明HP19通過抑制酪氨酸激酶活性影響儲存蛋白受體的磷酸化，進(jìn)而抑制了20E誘導(dǎo)的儲存蛋白的吸收和后續(xù)的化蛹過程。所以，HP19和20E的協(xié)同作用是儲存蛋白受體磷酸化的關(guān)鍵，直接影響和調(diào)控昆蟲的變態(tài)發(fā)育進(jìn)程。

蜜蜂是社會性昆蟲，也是研究社會性結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)生物學(xué)的模式生物。通過序列分析和比較，我們在蜜蜂基因組中找到與米蛾hp19同源性的基因。蜂群主要由工蜂、雄蜂和蜂王組成，它們的發(fā)育歷期差別很大，但HP19在三型蜂之間差異化的變態(tài)發(fā)育中的具體作用不得而知。研究表明，與儲存蛋白功能相近的卵黃原蛋白在蜜蜂的行為發(fā)育、生殖和壽命等多個(gè)方面具有重要的作用(Antonio, 2008),而儲存蛋白也直接與蜜蜂的生殖和壽命長短密切相關(guān)(Cristino, 2010) 。結(jié)合HP19在其他昆蟲變態(tài)發(fā)育及壽命、產(chǎn)卵等生物學(xué)進(jìn)程中廣泛且一致的作用，可以推測hp19在蜜蜂的級型發(fā)育、壽命和生殖等生物學(xué)過程中也有重要作用與功能?；虻墓δ芘c其在生物體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)特性密切相關(guān)。為系統(tǒng)研究蜜蜂體內(nèi)hp19在調(diào)控三型蜂變態(tài)發(fā)育中的功能，我們通過熒光定量PCR技術(shù)測定并分析其在不同發(fā)育階段意大利蜜蜂三型蜂體內(nèi)的表達(dá)特性，也為進(jìn)一步研究hp19在蜜蜂體內(nèi)的其他生物學(xué)功能提供試驗(yàn)依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用意大利蜜蜂Apismelliferaligustica采自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場；引物由上海生工生物工程有限公司合成；RNA提取試劑盒Trizol Reagent 購自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System 購自Promega 公司；熒光定量PCR試劑盒SYBR? Select Master Mix購自ABI公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀StepOne PlusTM購自Applied Biosystems公司；三氯甲烷、異丙醇、乙醇等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣本制備

標(biāo)記巢房幼蟲區(qū)域，放回蜂群正常飼養(yǎng)。根據(jù)發(fā)育時(shí)間的不同分別采集三型蜂3齡幼蟲、5齡幼蟲、封蓋之后1 d,2 d,和3 d的預(yù)蛹、全身白色的早期蛹和全身深色的后期蛹、新蜂(哺育工蜂，處女王，新出房雄蜂)以及老蜂(采集工蜂，產(chǎn)卵王，性成熟雄蜂)。

1.2.2RNA提取與cDNA合成

采集得到的樣本置于Trizol中提取總RNA。簡要步驟如下：向樣本中加入1 mL Trizol充分勻漿，隨后加入200 μL三氯甲烷萃取RNA，10000 g離心10 min 取上清，加入0.5 mL異丙醇沉淀RNA，最后加入75%乙醇洗滌所得RNA，再用無水乙醇封存置于-80℃?zhèn)溆?。使用時(shí)除去無水乙醇，加入適量體積(20-100 μL) 無核酸酶的去離子水溶解(李曉燕等，2016；李江紅等，2014)。

按照試劑盒操作說明Reverse Transcription System (Promega Inc) 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系組成如下：GoScriptTM5×Reaction buffer 4 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，PCR Nucleotide mix 1 μL，Oligo(dT)15Primer 0.5 μL，Random Primers 0.5 μL，Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.4 μL， GoScriptTMReverse Transcriptase 1 μL，RNA模板2 μL，Nuclease-Free Water 6.6 μL。充分混勻反應(yīng)液并置于42℃溫育15 min，然后95℃熱處理5 min，所得cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

選取hp19與β-actin表達(dá)均較高的樣本，將其cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋4次，得到一組共5個(gè)濃度依次降低的cDNA標(biāo)樣。對該組樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測分析，繪制得到Ct值與模板濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。并檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，判斷產(chǎn)物是否為特異性片段。

1.2.4熒光定量PCR

以β-actin為參照基因，利用特異性引物(表1) 對各樣本中目的基因的表達(dá)進(jìn)行熒光定量測定。構(gòu)建反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR? Select Master Mix 10 μL，Nuclease-Free Water 8 μL，cDNA模板1 μL，forward and reverse primer各0.5 μL。反應(yīng)液充分混勻后置于ABI StepOne PlusTMReal-Time PCR儀中擴(kuò)增檢測。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，每板反應(yīng)設(shè)置3個(gè)陰性對照。

表1　熒光定量PCR擴(kuò)增引物

1.2.5數(shù)據(jù)處理

檢測發(fā)現(xiàn)hp19和β-actin的擴(kuò)增效率基本一致，所以采用比較Ct法處理所得數(shù)據(jù)。利用 ABI Step OneTM Software Version 2.2 和Excel完成擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶解曲線以及目的基因相對表達(dá)量柱形圖的繪制。利用SPSS分析各組數(shù)據(jù)間的差異性，并采用方差分析LSD的多重比較法進(jìn)行各樣本間的顯著性差異檢驗(yàn)(P<0.05) 。

2　結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增效率及特異性

通過對目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行分析，結(jié)果表明hp19和β-actin的擴(kuò)增曲線均出現(xiàn)了明顯的指數(shù)增長和平臺(圖1A),擴(kuò)增效果良好。同時(shí)溶解曲線也呈現(xiàn)出特異性單峰 ( 圖1B),擴(kuò)增特異性強(qiáng)。

圖1　hp19和β-actin的熒光定量擴(kuò)增曲線(A)和溶解曲線(B)Fig.1　Amplification curves (A) and melting curves (B) of hp19 and β-actin for qRT-PCR

對系列梯度稀釋好的hp19和β-acting樣本進(jìn)行熒光定量PCR分析，繪制模板濃度與擴(kuò)增閾值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示hp19和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為-3.402和-3.3，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999和1，擴(kuò)增效率為別為93.008和100.902( 圖2) 。hp19和β-actin的擴(kuò)增效率基本一致，符合比較CT法的適用條件，因此在后續(xù)的定量分析中均采用該算法進(jìn)行分析。

圖2　hp19和β-actin的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curve of hp19 and β-actin for qRT-PCR

2.2hp19在意大利蜜蜂體內(nèi)的表達(dá)

為探究hp19在意大利蜜蜂體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)特性，采用熒光定量PCR的方法，以β-actin為內(nèi)參基因，矯正目的基因的表達(dá)量，并以表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)來表示相對表達(dá)量。

2.2.1工蜂不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

通過對不同發(fā)育時(shí)期工蜂體內(nèi)hp19的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在3齡幼蟲體內(nèi)特異性高表達(dá)，為參照的103-104倍。在5齡幼蟲體內(nèi)顯著降低至參照的10-102倍，化蛹前降至與參照基因同一水平。在早期蛹體內(nèi)達(dá)到最高峰值，為參照的105倍。羽化前降低至參照的102倍，出房后其表達(dá)量再次升高到參照的105倍，此后的整個(gè)成年蜂時(shí)期均保持在這一較高的表達(dá)水平(圖3) 。由此可見，hp19的表達(dá)與工蜂的發(fā)育時(shí)期密切相關(guān)。

2.2.2雄蜂不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

對雄蜂不同發(fā)育時(shí)期hp19的表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，在3齡幼蟲體內(nèi)與工蜂的表達(dá)相同，為參照基因的103-104倍，但隨著日齡的增加表達(dá)量顯著性升高為參照的106倍，封蓋后逐漸下降，同樣在化蛹前達(dá)到最低值，此時(shí)僅為參照的102倍。進(jìn)入蛹期后至新蜂羽化出房這一階段表達(dá)量顯著性升高，為參照基因的106-107，性成熟后下降到104倍(圖4)。

圖3　hp19在不同發(fā)育時(shí)期工蜂體內(nèi)的表達(dá)Fig.3　The expression level of hp19 in different development stage of worker注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) ；下同。Note: Date are mean ±SE, and different lowercase letters above bars indicate significant difference at the 0.05 level(P<0.05). The same below.

圖4　hp19在不同發(fā)育時(shí)期雄蜂體內(nèi)的表達(dá)Fig.4　The expression level of hp19 in different development stage of drone

2.2.3蜂王不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

hp19在蜂王整個(gè)幼蟲階段的表達(dá)較為穩(wěn)定，約為參照的102倍。封蓋后次日逐漸增加至參照基因的104-105倍，整個(gè)蛹期也都基本維持在這一表達(dá)水平，沒有明顯的差異。處女王體內(nèi)的表達(dá)量達(dá)到峰值，為參照基因的107，但在正常產(chǎn)卵蜂王體內(nèi)降低至參照的105倍(圖5)。

圖5　hp19在不同發(fā)育時(shí)期蜂王體內(nèi)的表達(dá)Fig.5　The expression level of hp19 in different development stage of queen

2.2.4hp19在各級型間的表達(dá)差異

對三型蜂不同發(fā)育階段hp19的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在雄蜂體內(nèi)整體表達(dá)量最高，蜂王次之，工蜂最小。工蜂和雄蜂體內(nèi)的表達(dá)隨著發(fā)育時(shí)期的不同有明顯的差異性，蜂王體內(nèi)則沒有明顯的差異性。在沒有生殖能力的成年工蜂體內(nèi)的表達(dá)沒有變化，但成年雄蜂和蜂王的不同發(fā)育階段表達(dá)差異明顯(表2)。這說明該基因在不同級型蜜蜂體內(nèi)以及不同生殖能力三型蜂之間的表達(dá)都有明顯的差別。

表2　不同發(fā)育時(shí)期三型蜂hp19的表達(dá)差異分析

3　結(jié)論與討論

昆蟲的發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制是昆蟲學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一，為害蟲的防控和益蟲的利用提供了理論基礎(chǔ)。一般認(rèn)為昆蟲的發(fā)育受保幼激素和蛻皮激素的協(xié)同調(diào)控(Truman and Riddiford, 1999; Riddifordetal., 2003; Dubrovsky, 2005)。然而，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種調(diào)控作用還受其它因子的調(diào)節(jié)和影響，本文提及的昆蟲血淋巴蛋白HP19，能夠抑制蛻皮激素通過酪氨酸激酶磷酸化脂肪體細(xì)胞膜受體，阻礙了儲存蛋白的吸收和蛹期的發(fā)育(Tomaschko, 1999; Wang and Haunerland, 1993; Arifetal., 2004; Abuletal., 2008) 。該機(jī)制是昆蟲變態(tài)發(fā)育調(diào)節(jié)和控制的普遍機(jī)制。蜜蜂是社會性昆蟲，蜂群有工蜂、蜂王和雄蜂三種級型，它們的發(fā)育歷期差別較大。本文通過熒光定量技術(shù)對不同發(fā)育時(shí)期的三種蜜蜂體內(nèi)的hp19進(jìn)行了測定，研究其與三型蜜蜂變態(tài)發(fā)育差異的關(guān)系，結(jié)果豐富了蜜蜂級型發(fā)育的相關(guān)理論，也補(bǔ)充了hp19調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育的內(nèi)容。

通過對不同發(fā)育時(shí)期三型蜂體內(nèi)的hp19進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)hp19在工蜂3齡幼蟲時(shí)期高表達(dá)，可以抑制儲存蛋白受體的磷酸化，儲存蛋白被大量合成并在血淋巴中累積。自末齡幼蟲開始hp19表達(dá)量開始降低，至化蛹前降至最低(圖3)。此時(shí)與高滴度的蛻皮激素聯(lián)合作用提高了受體的磷酸化使儲存蛋白得以被迅速吸收，為蛹的發(fā)育提供能量和物質(zhì)來源。這樣的表達(dá)模式與其在米蛾等昆蟲體內(nèi)的表達(dá)模式基本一致，反映了hp19在變態(tài)發(fā)育中的基礎(chǔ)功能和調(diào)控作用。至蛹后期hp19又顯著性的升高，這一階段的高表達(dá)可能與蜜蜂的羽化有關(guān)，需要酸性磷酸酶活性以構(gòu)建成年蜜蜂的組織和器官。新羽化的工蜂乃至其后的整個(gè)成年蜜蜂時(shí)期，工蜂體內(nèi)的hp19表達(dá)一直都保持在比較高的水平，這與一般昆蟲體內(nèi)高蛻皮激素滴度、低hp19表達(dá)量或者與之相反的作用模式一致。持續(xù)整個(gè)成年工蜂時(shí)期的相對高表達(dá)可能與成年蜜蜂的肌肉組織發(fā)育和蜜蜂高強(qiáng)度的飛行采集活動(dòng)有關(guān)，因?yàn)閮Υ娴鞍走€能夠參與調(diào)控昆蟲飛行肌肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白的合成(Levenbook and Bauer, 1984) 。

在雄蜂體內(nèi)hp19的表達(dá)也具有發(fā)育時(shí)期的特異性。幼蟲時(shí)期高表達(dá)，化蛹前明顯下降，使得儲存蛋白受體的磷酸化過程順利進(jìn)行，儲存蛋白被脂肪體細(xì)胞重吸收，化蛹后的表達(dá)量趨于平穩(wěn)(圖4)。這也與hp19對昆蟲的發(fā)育調(diào)控模式基本一致。hp19在工蜂3齡幼蟲體內(nèi)高表達(dá)，但自5齡幼蟲開始至變態(tài)期結(jié)束，其表達(dá)量都保持在較低的水平(圖3)。而在雄蜂體內(nèi)，hp19在預(yù)蛹期的前面2天都是在高水平表達(dá)，僅在化蛹前的最后一天突然降低，完成化蛹的過程。這種表達(dá)模式可能與雄蜂幼蟲更大的體型需要更長的取食時(shí)間有關(guān)，即便在封蓋的巢房內(nèi)，其依然在取食，此階段不能立即很快進(jìn)入化蛹模式，需要維持高水平的hp19表達(dá)量抑制化蛹進(jìn)程。此外，整個(gè)蛹期和羽化后早期雄蜂體內(nèi)hp19表達(dá)量顯著高于工蜂，這也與其體型較工蜂大、肌肉組織的發(fā)育需要更高的hp19表達(dá)量有關(guān)。而發(fā)育至性成熟時(shí)期，hp19的表達(dá)降低至與一般成年工蜂相同的水平，能夠維持自身的肌肉系統(tǒng)發(fā)育即可(表2)。所以，hp19在雄蜂體內(nèi)的表達(dá)模式與其發(fā)育和生物學(xué)特性密切相關(guān)，表現(xiàn)出與工蜂表達(dá)模式不完全一致的現(xiàn)象。

蜂王體內(nèi)，hp19在整個(gè)幼蟲期的表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢，且并沒有出現(xiàn)幼蟲期高表達(dá)、化蛹前顯著降低的情況。這種表達(dá)模式與工蜂和雄蜂幼蟲的表達(dá)完全不同，也與一般昆蟲體內(nèi)的hp19調(diào)節(jié)蛻皮激素對儲存蛋白受體的磷酸化，影響化蛹和變態(tài)發(fā)育的機(jī)制不一樣。蜂王是蜂群內(nèi)唯一的雌性器官發(fā)育完全的個(gè)體，其個(gè)體遠(yuǎn)比工蜂大，但其發(fā)育歷期卻極短，只要16 d便完成個(gè)體的發(fā)育過程。這其中是否存在不同于普通昆蟲的蛻皮激素和HP19調(diào)節(jié)化蛹和變態(tài)發(fā)育的獨(dú)特機(jī)制還值得進(jìn)一步的探究。另一個(gè)原因或許是因?yàn)榉渫跤紫x的發(fā)育速度極快，其對應(yīng)的變態(tài)發(fā)育歷期也很短，若其少于一天時(shí)間，則很可能在采樣時(shí)沒有將這一短暫狀態(tài)的蜂王幼蟲采集測定到，從而導(dǎo)致現(xiàn)在這種結(jié)果的出現(xiàn)。無論何種原因，都值得進(jìn)一步深入研究。蜂王體內(nèi)hp19的表達(dá)在蛹期一直維持在比幼蟲期還高的水平(圖5)。與雄蜂一樣，在羽化前后也沒有出現(xiàn)于工蜂類似的低表達(dá)情況，但其中的原因不明。新羽化的處女王體內(nèi)表達(dá)量最高，這與新羽化雄蜂一樣，與其進(jìn)一步的發(fā)育和肌肉組織的成熟密切相關(guān)。至產(chǎn)卵期，其表達(dá)量稍微回調(diào)，但也維持在與工蜂和雄蜂對應(yīng)階段基本一致的水平(表2)。因此，hp19在蜂王體內(nèi)的表達(dá)模式與工蜂、雄蜂和一般的表達(dá)機(jī)制完全不同。

總體而言，雄蜂和蜂王由于個(gè)體大、物質(zhì)能量需求大于工蜂，hp19的表達(dá)量也遠(yuǎn)高于工蜂。蜂王作為正常蜂群中唯一具有生殖能力的雌性個(gè)體，專飼生殖，而雄蜂僅承擔(dān)著交配的任務(wù)，并且雄蜂在后期蛹至羽化出房后不久生殖系統(tǒng)發(fā)育完全并產(chǎn)生生殖細(xì)胞，蜂王在羽化后卵巢也開始膨大進(jìn)一步發(fā)育，與之對應(yīng)的是hp19在雄蜂和蜂王體內(nèi)及對應(yīng)發(fā)育階段的高表達(dá)，這說明hp19也可能與蜜蜂的生殖調(diào)控有關(guān)。

蜂群內(nèi)三種大小、重量、發(fā)育歷期及生物學(xué)功能完全不同的工蜂、雄蜂和蜂王為發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制的研究提供了很好的材料。本研究通過定量測定不同發(fā)育階段的三型蜂體內(nèi)hp19的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在工蜂和雄蜂體內(nèi)具有與其他昆蟲基本一致的在幼蟲高表達(dá)、在變態(tài)化蛹期低表達(dá)的普遍性表達(dá)模式。但在蜂王體內(nèi)則具有完全不同于這一普遍性的表達(dá)和調(diào)控模式，有其自身的特殊性。而在成年蜜蜂階段，三型蜂體內(nèi)也表現(xiàn)出與生殖密切相關(guān)的表達(dá)模式。這些結(jié)果豐富了蜜蜂發(fā)育及其調(diào)控生物學(xué)研究內(nèi)容，也為下一步深入研究蜜蜂體內(nèi)hp19的功能提供了理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

References)

Abul A, Damara M, Damodar G. Regulation of hexamerin receptor phosphorylation by hemolymph protein HP19 and 20-hydroxyecdysone directs hexamerin uptake in the rice mothCorcyracephalonica[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology, 2008, 38(3): 307-319.

Abul A, Damodar G. Significance of the 19-kDa hemolymph protein HP19 for the development of the rice mothCorcyracephalonica: Morphological and biochemical effects caused by antibody application [J].ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology, 2007, 66(1): 32-44.

Antonio DSM, Guidugu KR. RNAi-mediated silencing of vitellogenin gene function turns honeybee (Apismellifera) workers into extremely precocious foragers [J].Naturwissenschaften, 2008, 95(10): 953-961.

Arif A, Vasanthi P, Hansen IA. The insect haemolymph protein HP19 mediates the nongenomic effect of ecdysteroids on acid phosphatase activity [J].TheJournalofBiologicalChemistry, 2004, 279(27): 28000-28008.

Burmester T, Antoniewski C, Lepesant JA. Ecdysone-regulation of synthesis and processing of fat body protein 1, the larval serum protein receptor ofDrosophilamelanogaster[J].EuropeanJournalofBiochemistry, 1999, 262(1): 49-55.

Cristino AS, Nunes FMF, Barchuk AR. Organization, evolution and transcriptional profile of hexamerin genes of the parasitic waspNasoniavitripennis(Hymenoptera: Pteromalidae) [J].InsectMolecularBiology, 2010, (Suppl. 1)19: 137-146.

Daniel AH. Presence of a single abundant storage hexamerin in both larvae and adults of the grasshopper,SchistocercaAmericana[J].JournalofInsectPhysiology, 2003, 49(12): 1189-1197.

Diana E. A role for storage proteins in autogenous reproduction inAedesatropalpus[J].JournalofInsectPhysiol., 1996, 42(10): 961-966.

Dubrovsky EB. Hormonal cross-talk in insect development [J].TrendsinEndocrinologyandMetabolism, 2005, 16(1): 6-11.

Hahn DA, Wheeler DE. Presence of a single abundant storage hexamerin both larvae and adults of the grasshopper,Schistocercaamericana[J].JournalofInsectPhysiology, 2004, 49(2): 1189-1197.

Hansen IA, Meyer SR, Schafer I. Interaction of the anterior fat body protein with the hexamerin receptor in the blowflyCalliphoravicina[J].EuropeanJournalofBiochemistry, 2002, 269(3): 954-960.

Ismail SM, Dutta GA. 20-Hydroxyecdysone mediated activation of larval haemolymph protein uptake by fat body cells ofCorcyracephalonica[J].BiochemistryInternationa, 1990, 22(2): 261-268.

Kramer S, Mundall E, Law J. Purification and properties of manducin, an amino acid storage protein of the haemolymph of larval and pupalManducasexta[J].InsectBiochemistry, 1980: 10(3), 279-288.

Levenbook L, Bauer AC. The fate of the larval storage protein calliphorin during adult development ofCalliphoravicina[J].InsectBiochemistry, 1984, 14(1): 77-86.

Lewis DK. A hexamerin protein, AgSP-1, is associated with diapause in theBollweevil[J].JournalofInsectPhysiology, 2002, 48(9): 887-901.

Li JH, Liang QH, Chen DF. Differences in the expression of the major royal jelly protein 8 gene in different castes ofApismellifera[J].ActaEntomologicaSinica, 2014, 57(1): 1-7. [李江紅，梁慶環(huán)，陳大福，等. 西方蜜蜂不同級型王漿主蛋白MRJP8基因的表達(dá)差異[J]．昆蟲學(xué)報(bào)，2014, 57(1): 1-7]

Li XY, Liang QH, Yang WJ. Expression of the major royal jelly protein 7 gene in honeybee (ApismelliferaligusticaSpinola) [J].JournalofEnvironmentalEntomology, 2016, 38(2): 371-377. [李曉燕，梁慶環(huán)，楊文靜，等. 王漿主蛋白MRJP7基因在意大利蜜蜂體內(nèi)的表達(dá)[J]．環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2016, 38(2): 371-377]

Marcia MG, Adriana MN, Adriana DC. Characterization and expression of the Hex 110 gene encoding a glutamine-rich hexamerin in the honey bee,Apismellifera[J].ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology, 2006, 63(2): 57-72.

Miller S, Silhacek D. The synthesis and uptake of haemolymph storage proteins by the fat body of the greater wax mothGalleriamellonella(L.) [J].InsectBiochemistry, 1982, 12(3): 293-300.

Nagamanju P, Hansen IA, Burmester T. Complete sequence, expression and evolution of two members of the hexamerin protein family during the larval development of the rice moth,Corcyracephalonica[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology, 2003, 33(1): 73-80.

Riddiford LM, Hiruma K, Zhou X. Insights into the molecular basis of the hormonal control of molting and metamorphosis fromManducasextaandDrosophilamelanogaster[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology, 2003, 33(12): 1327-1338.

Roberts D, Brock H. The major serum proteins of dipteran larvaeExperientia[J].CellularandMolecularLifeSciences, 1981, 37(2): 103-110.

Telfer W, Keim P, Law J.Arylphorin, a new protein fromHyalophoracecropia: Comparisons with calliphorin and manducin [J].InsectBiochemistry, 1983, 13(6): 601-613.

Thorsten B, Claudia K, Birgit S. Complete sequence, expression, and evolution of the hexamerin LSP-2 ofcalliphoravicina[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology, 1998, 28(1): 11-22.

Tomaschko KH. Nongenomic effects of ecdysteroids [J].ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology, 1999, 41(2): 89-98.

Truman JW, Riddiford LM. The origins of insect metamorphosis [J].Nature, 1999, 401(6752): 447-452.

Ueno K, Natori S. Identification of storage protein receptor and its precursor in the fat body membrane ofSarcophagaperegrine[J].JournalofBiologicalChemistry, 1984, 259(19): 12107-12111.

Verkuil EVP. The induction of lysosomal enzyme activity in the fat body ofCalliphoraerythrocephala: Changes in the internal environment [J].JournalofInsectPhysiology, 1980, 26(2): 91-101.

Wang ZX, Haunerland NH. Storage protein uptake inHelicoverpazea. Purification of the very high density lipoprotein receptor from perivisceral fat body [J].TheJournalofBiologicalChemistry, 1993, 268(22): 16673-16678.

Wang ZX, Haunerland NH. Receptor-mediated endocytosis of storage proteins by the fat body ofHelicoverpazea[J].CellandTissueResearch, 1994, 278(1): 107-115.

Yu CZ. cDNA sequences and mRNA levels of two hexamerin storage proteins PinSP1 and PinSP2 from the Indianmeal moth,Plodiainterpunctella[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology, 2002, 32(5): 525-536.

Expression of the 19 kDa Hemolymph Protein in honeybeeApismelliferaligustica

WANG Qi, LIU Chuan-Dong, ZHANG Zhi-Bo, YU He, ZHENG Bin-Yue, LI Jiang-Hong*

(College of Bee Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China)

Insect 19 kDa haemolymph protein mainly participate in regulation the metamorphosis development. There are three type of bees with different development duration in honeybee colony. To explore the role ofhp19 in regulation the metamorphosis development of honeybeeApismelliferaligustica, its expression in different developing stage of worker, queen and drone were determined by using Real-time PCR technology. The results showed that the expression ofhp19 were 104and 105times of reference in 3rdinstar larvae of worker and drone respectively, decreased to 10 and 102times of reference in 5rdinstar larvae of worker and drone respectively, and both increased significantly in pupae stage. However,hp19 was 102times of reference expressed in whole larvae stage of queen, gradually increased in caped larvae, and reached to 105times of reference in late pupae stage. While in adult bees,hp19 was 104times of reference expressed in worker bee, but significantly high expressed in new emerged queen or drone with an expression of 107times of reference, then decreased to 104times of reference in old drone or egg laying queen. Such a different expression ofhp19 suggest it not only related to the difference in metamorphosis development of three castes of honeybee, but also be associated with the reproductive of drone and queen, and thus might have multiple biological function.

Apismelliferaligustica; HP19; real-time PCR; transcription; function

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472156)

王琦，男，1991年生，山東人，碩士研究生，研究方向?yàn)槊鄯渖飳W(xué)，E-mail：710828596@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: leejh6972@126.com

Received：2016-11-08；接受日期Accepted：2016-11-25

Q963; S893.3

A

1674-0858(2017)01-0085-08

王琦，劉川冬，張智博，等.意大利蜜蜂血淋巴HP19蛋白的表達(dá)及功能[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(1):85-92.