不同移蟲日齡蜂王卵巢中hexamerin110、hexamerin70b的差異表達分析

龐 倩，王 瑩，王 康，張文文，吉 挺

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

不同移蟲日齡蜂王卵巢中hexamerin110、hexamerin70b的差異表達分析

龐 倩，王 瑩，王 康，張文文，吉 挺*

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

為探究不同移蟲日齡的西方蜜蜂蜂王卵巢中hexamerin110、hexamerin70b的表達及其調控機理，以β-actin為內參基因，運用qRT-PCR技術檢測不同移蟲日齡蜂王卵巢中hexamerin110、hexamerin70b mRNA的表達水平，用Western blot方法檢測hexamerin110、hexamerin70b蛋白的表達。結果顯示，hexamerin110、hexamerin70無論是在mRNA水平還是蛋白水平，隨著移蟲日齡的增加，其表達量均呈降低的趨勢。1日齡移蟲培育的蜂王卵巢hexamerin110基因表達量顯著高于其他組(P<0.05)，1日齡移蟲培育的蜂王卵巢的hexamerin70b基因的表達量極顯著高于其他組(P<0.01)。Hexamerin110、hexamerin70b在1日齡移蟲發(fā)育的蜂王卵巢中的表達水平最高，推測其可能與蜂王生殖發(fā)育以及級型分化有關。

移蟲日齡；卵巢；hexamerin110；hexamerin70b；級型分化

蜜蜂是以群體為單位的社會性昆蟲，包括蜂王、雄蜂以及工蜂。蜂王和工蜂都是由受精卵發(fā)育而來的雌性蜂，兩者的遺傳組成完全一致，但它們在外部形態(tài)、生理結構和行為上都存在巨大的差異。蜂王個體大、壽命長并且繁殖力極強，而工蜂個體小、壽命極短，沒有繁殖能力(Hartfelder and Engels, 1998；Page and Peng, 2001)，這種現象稱為蜜蜂的級型分化，是現今蜜蜂研究的熱點問題。研究發(fā)現幼蟲攝取的食物會影響其級型分化，決定其發(fā)育成具有繁殖力的蜂王或無繁殖性能的工蜂(陳璇和胡福良，2011；石元元，2011)。

昆蟲儲存蛋白(hexamerin)在昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程中具有至關重要的作用，其通常在幼蟲的脂肪體內合成，在血淋巴內儲存，化蛹時重新進入脂肪體，在昆蟲變態(tài)發(fā)育期間被利用(Burmester and Scheller, 1999)。一直以來，hexamerin都被當作是非進食期昆蟲生長發(fā)育的氨基酸來源，然而，研究發(fā)現hexamerin家族的蛋白除了與變態(tài)、蛹的生長發(fā)育有關，可能還與級型分化有關(Martinsetal., 2008)。

卵巢作為雌性蜜蜂生殖系統的重要功能組織，其大小和發(fā)育程度代表著蜂王的繁殖能力，其發(fā)育受到移蟲日齡的影響，沈芳(2015)研究發(fā)現不同移蟲日齡所培育的蜂王在生長發(fā)育和繁殖性能方面存在顯著差異。而不同移蟲日齡培育的蜂王卵巢中hexamerin的表達是否有差異尚不清楚，國內關于hexamerin對蜜蜂級型分化的影響的研究也比較少。有研究在發(fā)育中的卵巢和睪丸中檢測到hexamerin110和hexamerin70b的轉錄本(Martinsetal., 2010)。因此，為了揭示不同移蟲日齡對蜜蜂hexamerin的影響，本研究以hexamerin110、hexamerin70b為研究對象，利用qRT-PCR方法以及Western blot方法比較不同移蟲日齡蜂王卵巢內hexamerin110 、hexamerin70b在mRNA及蛋白水平的表達，探究不同移蟲日齡對其的影響，為hexamerin110、hexamerin70b對蜜蜂級型分化的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗蜂群

處女王(西方蜜蜂)出房后8 d人工注射單只雄蜂的精液，獲得單雄授精的蜂王，組織單雄授精蜂王進行產卵。單雄受精蜂王及組織蜂群工作均在吉林蜜蜂研究所實驗蜂場進行。

1.1.2 主要試劑

Trizol購自Invitrogen公司；氯仿，異丙醇，75%乙醇，DEPC水，FastQuant RT Kit(with gDNase)FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(KR106)購自北京天根生化科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒(cw0956)購自北京康為世紀生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；β-actin小鼠單克隆抗體購自上海艾博抗貿易有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、hexamerin110單克隆抗體、hexamerin70b單克隆抗體購自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司；ECL顯色試劑盒、硝酸纖維素膜購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司；低分子量蛋白Marker購自Thermo Scientific公司。

1.1.3 主要儀器

高靈敏蛋白印跡成像和多色熒光定量分析系統，ABI7500熒光定量PCR儀，臺式冷凍離心機，酶標儀，普通PCR儀，均質器。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂王的培育

滅菌后的空巢脾，放入限王產卵器中，經工蜂清理24 h后，控制蜂王產卵6 h，將空脾轉移到繼箱中孵育。98 h后移取巢脾上的幼蟲為1日齡幼蟲，122 h后移取巢脾上的幼蟲為2日齡，146 h后移取巢脾上的幼蟲為3日齡。培育至蜂王出房的前一天，全部轉移到昆蟲培養(yǎng)箱等待蜂王出房。

1.2.2 引物設計與合成

根據Genebank中hexamerin110的序列(NM_001101023.1)、hexamerin70b的序列(NM_001011600.1)，按照熒光定量引物設計原則，設計引物，hexamerin110上游：5′-AACGTGCCAGGC GCAGTTGT-3′，下游：5′-TTCACCAGCATGGAGGT TCTGGA-3′；hexamerin70b上游：5′-TGCCG CCAATGTACGAGGTG-3′，下游：5′-GCTCGGGCAC GTTGTGTTTG-3′，以β-actin作為內參基因，上游：5′-TCCTGCTATGTATGTCGC-3′，下游：5′-AGT TGCCATTTCCTGTTC-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 qRT-PCR

實驗分為3組，每組3個重復，每個重復取2頭西方蜜蜂蜂王的雙側卵巢，混池，將卵巢組織樣品勻漿后按試劑說明書操作，用Trizol提取卵巢總RNA，根據各樣品總RNA濃度，對RNA樣品進行稀釋，使其終濃度為200 ng/μL，然后按照FastQuant RT Kit(with gDNase)FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(KR106)操作程序進行反轉錄。根據熒光定量PCR試劑盒(cw0956)說明書進行操作，所有步驟均在冰上進行，qRT-PCR反應體系為20 μL體系：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL，RNase-Free Water 6 μL，PCR擴增程序為95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)，PCR反應在ABI7500熒光定量PCR儀上進行，最后用2-ΔΔCt的方法計算基因的表達量。

1.2.4 Western Blot檢測

實驗分為3組，每組3個重復，每個重復取2頭西方蜜蜂蜂王的雙側卵巢，混池，加入裂解液后，勻漿、超聲破碎、離心，用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白在沸水中水浴煮沸5 min，使蛋白變性，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，封閉液封閉，TBST沖洗后，分別與一抗、二抗雜交，ECL法于暗室中顯色，運用高靈敏蛋白印跡成像和多色熒光定量分析系統觀察Western blot結果。

1.2.5 蛋白結構預測

利用ProtParam tool軟件分析蛋白質序列的理化性質，利用SOPMA軟件預測蛋白質的二級結構，利用Tmpred對蛋白質跨膜區(qū)進行分析。

1.2.6 數據分析和處理

利用SPSS 17.0軟件對不同移蟲日齡蜂王卵巢內hexamerin110、hexamerin70b基因的表達量進行統計分析，用ANOVA的LSD法進行顯著性分析，以0.05為顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 qRT-PCR的結果

2.1.1 不同移蟲日齡蜂王卵巢中hexamerin110基因的表達

從圖1可以看出，隨著移蟲日齡的增加，hexamerin110基因的表達量呈現降低趨勢，1日齡移蟲培育的蜂王卵巢的hexamerin110基因的表達量最高，顯著高于2日齡和3日齡移蟲所培育的蜂王卵巢的hexamerin110基因的表達量(P<0.05)，2日齡和3日齡移蟲培育的蜂王卵巢的hexamerin110基因的表達量相近，差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同移蟲日齡hexamerin110基因的表達量Fig. 1 Expression level of hexamerin110 of different grafted instar注：相同字母代表差異不顯著，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Note: The same letters represent no significant difference, the different letters represent significant difference (P<0.05).

2.1.2 不同移蟲日齡蜂王卵巢中hexamerin70b基因的表達

圖2 不同移蟲日齡的hexamerin70b基因表達量Fig.2 Expression level of hexamerin70b of different grafted instar注：相同字母代表差異不顯著，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Note: The same letters represent no significant difference, the different letters represent significant difference (P<0.05).

從圖2可以看出，隨著移蟲日齡的增加，hexamerin70b基因的表達量呈現降低趨勢，1日齡移蟲培育的蜂王卵巢的hexamerin70b基因的表達量最高，而且極顯著高于2日齡和3日齡移蟲培育的蜂王卵巢的hexamerin70b基因的表達量(P<0.01)，2日齡和3日齡移蟲培育的蜂王卵巢的hexamerin70b基因的表達量相近，差異不顯著(P>0.05)。

2.2 Western Blot的結果

如圖3所示，Western Blot的結果表明，隨著移蟲日齡的增加，1日齡、2日齡、3日齡移蟲所培育的蜂王卵巢中hexamerin110、hexamerin70b蛋白的表達水平均呈現降低趨勢。

圖3 不同移蟲日齡hexamerin110蛋白和hexamerin70b蛋白的表達Fig.3 Expression levels of hexamerin110 and hexamerin70b of different grafted instar

2.3 蛋白結構預測結果

用ProtParam tool軟件分析蛋白質序列的理化性質，結果顯示hexamerin110蛋白分子量112.2 kDa，等電點6.43，負電荷氨基酸殘基總數64，正電荷氨基酸殘基總數57，總平均疏水性；hexamerin70b蛋白分子量79.5 kDa，等電點6.72，負電荷氨基酸殘基總數70，正電荷氨基酸殘基總數66，總平均疏水性。利用SOPMA軟件預測蛋白質的二級結構，結果表明，hexamerin110含有α螺旋(h)38.89%，延伸鏈(e)17.66%，β轉角(t)9.92%，無規(guī)卷曲(c)33.53%；hexamerin70b含有α螺旋(h)39.39%，延伸鏈(e)23.43%，β轉角(t)8.93%，無規(guī)卷曲(c)28.26%(圖4、圖5)。利用Tmpred對蛋白質跨膜區(qū)進行分析，發(fā)現hexamerin110可能的8個跨膜螺旋區(qū)，分別為：29-47，100-122，236-260，383-409，664-684，776-794，900-925，939-961。膜外到膜內5個，分別為：29-47，100-123，664-684，774-792，939-957。發(fā)現hexamerin70b可能的1個跨膜螺旋區(qū)，為32-52，膜外到膜內1個，為30-52。

圖4 hexamerin110蛋白二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of hexamerin110 protein

圖5 hexamerin70b蛋白二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of hexamerin70b protein

3 結論與討論

Hexamerin110基因有9個外顯子，編碼1008個氨基酸，其編碼的蛋白富含谷氨酰胺，hexamerin110在幼蟲血淋巴含量特別高，在結繭期減少，在成蜂中再一次升高(Bitondietal., 2006)。Hexamerin110除了為變態(tài)和蛹的發(fā)育提供氨基酸，還參與雌性昆蟲的產卵(Wheeler and Buck, 1995; Pan and Telfer, 1996; Seoetal., 1998; Wheeleretal., 2000; Pan and Telfer, 2001)，并且在產卵蜂王卵巢中高表達(Martinsetal., 2010)。qRT-PCR和Western blot的結果顯示，隨著移蟲日齡的增加，hexamerin110的表達量無論是在mRNA水平還是蛋白水平，均呈現降低趨勢，可能是因為移蟲日齡會對蜂王的生長發(fā)育以及繁殖性能產生影響，隨著移蟲日齡的增加，蜂王的卵巢重顯著減輕，卵巢管數顯著減小(沈芳, 2015)，移蟲越晚，人工培育的蜂王的卵巢發(fā)育的越不完全，從而導致與產卵有關的hexamerin110表達量的降低。也可能是因為高產蜂王的卵巢發(fā)育和產卵需要更多的能量與蛋白質的供給，從而誘導了與產卵有關的hexamerin110的高表達。Bitondi等(2006)發(fā)現工蜂卵巢的發(fā)育程度與hexamerin110基因的表達水平有關，卵巢的發(fā)育需要hexamerin110基因的高水平表達。因此推測，hexamerin110可能與蜂王的繁殖能力有關，hexamerin110的高表達有利于蜂王卵巢的發(fā)育，提高蜂王的繁殖性能。

Hexamerin70b基因有7個外顯子，編碼683個氨基酸，Cunha等(2005)研究得出hexamerin70b基因的表達受保幼激素(JH)和蛻皮激素的調節(jié)，用保幼激素處理或者注射蛻皮激素會使工蜂hexamerin70b的高表達期延長。隨著移蟲日齡的增加，hexamerin70b的表達量無論是在mRNA水平還是蛋白水平，均呈現降低趨勢，與隨著移蟲日齡的增加，蜂王幼蟲的保幼激素和蛻皮激素的含量顯著降低的結果一致(沈芳, 2015)。Hexamerin70b的表達之所以會隨著移蟲日齡的增加而降低可能是因為不同移蟲日齡培育的蜂王取食到的蜂王漿不同，而蜂王漿會影響成熟幼蟲的保幼激素濃度(彭文, 2007；Riddifordetal., 2010)，保幼激素和蛻皮激素能夠調控hexamerin70b的表達。Wirtz和Beetsma(1972)的研究表明保幼激素JHⅢ在蜜蜂級型分化過程中具有重要的作用。幼蟲血淋巴JHⅢ濃度的差異能夠激活幼蟲體內不同的發(fā)育模式，從而使得幼蟲發(fā)育成蜂王和工蜂這兩種完全不同的級型。同時，JHⅢ可以促進幼蟲期卵巢的發(fā)育(Barchuketal., 2007)，并且與蛻皮激素協同作用，共同調節(jié)蜜蜂的發(fā)育和變態(tài)過程。Hexamerin70b可能與保幼激素和蛻皮激素共同調控蜜蜂的級型分化。

本研究運用qRT-PCR技術及Western blot方法檢測了hexamerin110、hexamerin70b在不同移蟲日齡培育的西方蜜蜂蜂王卵巢中的表達，結果表明其在1日齡培育的蜂王卵巢中的表達明顯高于2日齡、3日齡的表達，而2日齡與3日齡之間表達差異不明顯，說明1日齡移蟲的蜂王繁殖性能具有更明顯的優(yōu)勢。

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Analysis on differential expression ofhexamerin110 andhexamerin70b in the ovaries of queens reared from different instar of the grafted larvae

PANG Qian1, WANG Ying, WANG Kang, ZHANG Wen-Wen, JI Ting*

(College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 22500, Jiangsu Province, China)

To explore the expression and molecular regulation mechanism ofhexamerin110 andhexamerin70b in the ovaries of queens reared from different instar of the grafted larvae, mRNA and protein expression ofhexamerin110 andhexamerin70b were assessed by qRT-PCR and Western blot. The results showed that the expression levels of thehexamerin110 andhexamerin70b decreased with the increasing instar of the grafted larvae, the expression levels of thehexamerin110 in ovaries of queens reared from 1 day instar of the grafted larvae were significantly higher than others (P<0.05). Meanwhile, the expression levels of thehexamerin70b in ovaries of queens reared from 1 day instar of the grafted larvae were extremely significantly higher than others (P<0.01). The expression levels of thehexamerin110 andhexamerin70b of 1 day instar of the grafted larvae are the highest, it is speculated thathexamerin110 andhexamerin70b may be associated with queen reproductive development and caste differentiation.

Instar of the grafted larvae; ovary;hexamerin110;hexamerin70b; caste differentiation

國家自然科學基金(31502020，31172272)；現代農業(yè)產業(yè)技術體系(CARS-45-SYZ6)

龐倩，女，1994年生，安徽宿州人，碩士研究生，E-mail：18852717155@163.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail：tji@yzu.edu.cn

Received：2016-08-17；接受日期Accepted：2016-09-23

Q963;S89

A

1674-0858(2017)01-0062-06

龐倩，王瑩，王康，等.不同移蟲日齡蜂王卵巢中hexamerin110、hexamerin70b的差異表達分析[J].環(huán)境昆蟲學報，2017,39(1):62-67.