中華蜜蜂氣味受體基因AcOr170的克隆與序列分析

楊 樂, 曾志將, 張麗珍

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045)

中華蜜蜂氣味受體基因AcOr170的克隆與序列分析

楊 樂, 曾志將, 張麗珍*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，南昌 330045)

本研究采用自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)中華蜜蜂Apisceranacerana雄蜂觸角中氣味受體基因(Odorant receptors 170)AcOr170的cDNA序列進(jìn)行了克隆和序列分析，以探尋中華蜜蜂雄蜂氣味受體AcOr170基因在近緣種昆蟲間的進(jìn)化差異。結(jié)果表明：中華蜜蜂雄蜂氣味受體基因AcOr170的cDNA序列總長度為1356 bp，編碼區(qū)序列長度為1188 bp，共編碼396個(gè)氨基酸，其分子量為46.272 kDa，等電點(diǎn)8.96，Genbank登錄號(hào)：KX264359。結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示，該蛋白具有7tm-6一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，Or170的序列在中華蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂間的親緣性很近。

中華蜜蜂；氣味受體；Or170；基因比對(duì)；序列分析

昆蟲通過特殊嗅覺系統(tǒng)感知外界環(huán)境中的化學(xué)氣味，來維持其正常的覓食、求偶、繁殖和避害等生理行為(趙慧婷等，2012)。研究表明，在昆蟲觸角感受器中氣味受體蛋白(odorant receptors, OBs)、氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding, protein, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMPs)和氣味降解酶(odordegrading enzymea, ODEs)等蛋白均參與了接收氣味這一過程(Vosshalletal., 1999；Hallemetal., 2004；Vogtetal., 2009)。昆蟲的氣味受體基因包括編碼傳統(tǒng)氣味受體(conventional receptors)的基因和編碼非典型氣味受體Or83b家族的基因。哺乳動(dòng)物的嗅覺受體結(jié)構(gòu)包含7個(gè)跨膜區(qū)，并與G蛋白偶聯(lián)。由于昆蟲的氣味受體也含有7個(gè)α螺旋跨膜區(qū)，所以昆蟲的氣味受體被普遍認(rèn)為也與G蛋白相偶聯(lián)，但有一些試驗(yàn)證據(jù)并不支持此觀點(diǎn)(王妮娜，2005)。

氣味受體的研究對(duì)于認(rèn)識(shí)昆蟲化學(xué)信號(hào)的分子識(shí)別機(jī)制有重要意義(鞏中軍等，2008)。目前已有許多學(xué)者對(duì)昆蟲氣味受體基因進(jìn)行了大量的研究。第一個(gè)昆蟲氣味受體基因被Pennisi(1999)從黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中鑒定出來。Robertson等(2006)對(duì)西方蜜蜂Apismellifera基因組分析發(fā)現(xiàn)：西方蜜蜂基因組中有163個(gè)氣味受體基因。另外，Wanner等(2007)發(fā)現(xiàn)Or10、Or11、Or18和Or170在雄蜂觸角中高度表達(dá)。目前，10多種昆蟲的氣味受體已經(jīng)得到了全面鑒定，這對(duì)于它們近緣種昆蟲的相應(yīng)受體鑒定有重要意義(趙慧婷等，2012)。

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國特有的蜂種，簡稱中蜂。與西方蜜蜂相比，中蜂更加溫順，具有較強(qiáng)的抗疾病和抗螨蟲能力且善于搜索零星蜜粉源(Abrol，2012)。最近，有研究發(fā)現(xiàn)中蜂對(duì)于氣味的感知能力更強(qiáng)(陳盛祿，2001；曾志將，2009)。因此中蜂是研究昆蟲嗅覺機(jī)制的良好實(shí)驗(yàn)材料。另外，中蜂正常處女王交尾行為受到了西方蜜蜂雄蜂的嚴(yán)重干擾(王啟發(fā)等，2003)，因此有必要對(duì)中蜂雄蜂的氣味受體基因進(jìn)行研究。

本研究以中蜂雄蜂為實(shí)驗(yàn)材料，通過RT-PCR技術(shù)克隆了中蜂雄蜂觸角AcOr170基因，并對(duì)其序列進(jìn)行了分析。以期為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)蜜蜂取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂，蜂群健康且群勢較強(qiáng)。從蜂群的巢房內(nèi)隨機(jī)取中蜂雄蜂70頭，用鑷子小心將蜜蜂放入EP管中，然后立即放入液氮中速凍，最后-80℃保存，用于提取RNA。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

總RNA提取試劑TRIzol，pEasy-T3載體，Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞，X-gal，IPTG，氨芐青霉素，RNA酶抑制劑等購自全式金公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA marker DL2000，PCR反應(yīng)試劑購自Takara公司，質(zhì)粒微量抽提試劑盒與凝膠回收試劑盒購自上海生工。其他均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

移液槍(eppendorf)、小型冷凍離心機(jī)(eppendorf)、RT-PCR儀(eppendorf)、SHP-250型生化培養(yǎng)箱(揚(yáng)州三發(fā)電子有限公司)、電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)、RT-PCR儀(eppendorf)等。

1. 2 方法

1.2.1 總RNA的提取

RNA提取：用鑷子取70頭中蜂雄蜂的完整觸角，再用液氮研磨，并參照Trizol試劑盒說明書的步驟提取總RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照Promega(公司)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成單鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：將反應(yīng)體系(5×MLV Buffer 10 μL；dNTP Mixture 8 μL；RNase抑制劑1.5 μL；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.5 μL；DEPC水18 μL)混勻，于42℃溫育60 min，隨后70℃溫育15 min，最后向合成的cDNA中加入滅菌超純水稀釋，置于-80℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的近緣種西方蜜蜂AmOr170序列(登錄號(hào)為：NM_001242993.1)，設(shè)計(jì)了2對(duì)擴(kuò)增序列有重疊區(qū)域的引物用于擴(kuò)增中華蜜蜂相應(yīng)基因組序列(AcOr170)，引物序列如表1所示。

1.2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，膠回收

以觸角的cDNA第一鏈為模板，用引物對(duì)其進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min后；94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，得到的PCR產(chǎn)物保存于4℃。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在紫外燈下用消毒干凈的刀片切下含目的條帶的膠條，使用膠回收試劑盒回收目的片段。

表1 用于擴(kuò)增AcOr170的特異性引物

1.2.5 克隆和測序

將膠回收產(chǎn)物與P-Easy T3載體混勻后于25℃連接20 min，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)14 h。用質(zhì)粒微量提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，將得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行陽性鑒定。最后將鑒定的陽性克隆菌送至上海生工進(jìn)行測序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)用DNAstar軟件將AcOr170正反向測序后的序列拼接獲得AcOr170基因的cDNA序列；其氨基酸序列通過Bioedit軟件按照六讀框翻譯而成。AcOr170基因首先在NCBI中經(jīng)BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索比對(duì)檢查序列的正確性，通過Clustal X的多重序列比較分析AcOr170與其它物種的同源性；采用MEGA 6.0軟件對(duì)已報(bào)道物種的Or170氨基酸序列構(gòu)建鄰位相連法(Neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 中蜂AcOr170基因的克隆及序列分析

通過對(duì)中蜂AcOr170的克隆、測序以及序列拼接，獲得了1條氣味受體基因序列，命名為AcOr170(登錄號(hào)為：KX264359)。如圖1所示AcOr170的cDNA序列全長為1356 bp，包含一個(gè)長1188 bp，編碼396個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF，起始于第90個(gè)堿基，終止于第1280個(gè)堿基)。其分子量為46.272 kDa，等電點(diǎn)8.96。通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據(jù)庫分析AcOr170的氨基酸序列，得到28-54 bp的一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域7tm-6。

圖1 AcOr170基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequence of AcOr170注：橫線標(biāo)注部分為7tm-6一個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域。Note: The part marked in lines means a high conserved structure of 7tm-6.

2.2 同源性比對(duì)

2.2.1 核苷酸序列分析

所得測序結(jié)果通過BLAST比對(duì)，找到了2條與AcOr170同源的序列，通過Clustal X的多重序列比較分析與其它物種的同源性(圖2)。從圖2中能發(fā)現(xiàn)，兩氣味受體的DNA序列長度在中華蜜蜂Or170(AcOr170)、大蜜蜂Or22c-like(AdOr22c-like)、西方蜜蜂Or170(AmOr170)中有一定差異，但外顯子區(qū)長度是較為保守的。通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：AcOr170與AdOr22c-like、AmOr170一致性分別為90.57%，87.47%。

接上圖

圖2 AcOr170核苷酸序列與其它昆蟲相應(yīng)序列的比對(duì)Fig.2 Nucleotide sequences alignment of AcOr170 with that of other insects注：---代表缺少的堿基。AcOr170，中華蜜蜂氣味受體基因Or170；AmOr170，意大利蜜蜂氣味受體基因Or170；AdOr22c-like，大蜜蜂氣味受體基因Or22c-like。Note:---represent the missing base. AcOr170, Apis cerana cerana Or170(JN544932); AmOr170, Apis mellifera Or170(NM_001242993.1); AdOr22c-like, Apis dorsata Or22c-like(XM_006619001.1).

2.2.2 編碼區(qū)氨基酸序列分析

將AcOr170核苷酸序列通過Bioedit軟件按照六讀框翻譯得出，AcOr170外顯子區(qū)編碼396個(gè)氨基酸。經(jīng)BLAST比對(duì)，在結(jié)果中找出4條與其同源的膜翅目昆蟲氨基酸序列(圖3)。序列比對(duì)結(jié)果表明，AcOr170與大蜜蜂Or22c-like(AdOr22c-like)一致性為93.94%，相似性為97.98%；與西方蜜蜂Or170(AmOr170)一致性為94.46%，相似性為97.98%；與小蜜蜂Or67a-like(AfOr67a-like)一致性為74.94%，相似性為85.21%；與西方蜜蜂Or22c-like(AmOr22c-like)一致性為73.05%，相似性為83.63%。

2. 3 聚類分析

根據(jù)AcOr170氨基酸同源性的比對(duì)結(jié)果，采用Mega 6.0軟件中的NJ法構(gòu)建中華蜜蜂Or170與其它四種蜜蜂氣味受體系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。從圖4可以看出，中華蜜蜂Or170與西方蜜蜂Or170及大蜜蜂Or22c-like可以聚成一支，他們的親緣性較近；小蜜蜂Or67a-like與西方蜜蜂Or22c-like聚成一支，他們兩個(gè)親緣關(guān)系較近，而與中華蜜蜂Or170親緣性較遠(yuǎn)。

圖3 AcOr170 氨基酸序列與其它膜翅目昆蟲相應(yīng)序列比對(duì)圖Fig.3 Amino acid sequences alignment of AcOr170 with that of other insects in Hymenoptera注：---代表缺少的氨基酸。AcOr170，中華蜜蜂氣味受體基因Or170；AdOr22c-like，大蜜蜂氣味受體基因Or22c-like；AmOr170，意大利蜜蜂氣味受體基因Or170；AfOr67a-like，小蜜蜂氣味受體基因Or67a-like；AmOr22c-like，意大利蜜蜂氣味受體基因Or22c-like。Note:---resperant the missing amino acid. AcOr170, Apis cerana cerana Or170(JN544932); AdOr22c-like, Apis dorsata Or22c-like(XM_006619001.1); AmOr170, Apis mellifera Or170(NM_001242993.1); AfOr67a-like, Apis florea Or67a-like(XP_003692912.1); AmOr22c-like, Apis mellifera Or22c-like(XP_006564342.1).

圖4 AcOr170與其同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of AcOr170 with its homology genes of other insects

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AcOr170序列長度為1356 bp，A+T占68.81%，G+C占31.19%。AcOr170的蛋白質(zhì)由396個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為46.272 kDa，理論等電點(diǎn)為8.57的疏水性蛋白。AcOr170蛋白第28-54位是個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域—7tm-6。該結(jié)構(gòu)具有感知和傳輸氣味的功能，所有已知的這一組成員均是7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的受體蛋白，這些蛋白是果蠅受體基因的候選蛋白。這與高一龍等(2010)對(duì)于氣味受體基因分子的特征研究相一致。

前人研究表明Or170是西方蜜蜂雄蜂接受蜂王信息素的主要?dú)馕妒荏w之一，在婚飛過程中起十分重要的作用(Wanneetal.，2007)。而Plettner等(2007)發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂和意大利蜜蜂的蜂王上顎腺信息素在成分種類以及各成分含量均有差異。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)AcOr170、AmOr170在基因序列與長度上同樣存在一定差異。這可能是中意蜂雄蜂的Or170受體基因?qū)Ω兄髯苑浞N的蜂王信息素具有一定的專一性。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，中華蜜蜂Or170(AcOr170)與大蜜蜂Or22c-like(AdOr22c-like)以及西方蜜蜂Or170(AmOr170)相似性很高分別為97.98%和97.98%；與小蜜蜂Or67a-like(AfOr67a-like)以及西方蜜蜂Or22c-like(AmOr22c-like)相似性較低，分別為85.21%和83.63%。經(jīng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)AcOr170與AdOr22c-like和AmOr170聚為一支，表明三者的親緣關(guān)系很近，三者可能由同一個(gè)基因分化而來。另外，BLAST比對(duì)并未找到與其他目類下昆蟲同源的序列。這再一次驗(yàn)證在不同種類的昆蟲中，氣味受體基因是高度變異的，這可能是昆蟲對(duì)信息素感知具有專一性的重要原因之一(Touhara & Vosshall，2009)。

References)

Abrol DP. Asiatic HoneybeeApiscerana[M]. Berlin: Springer Netherlands, 2013.

Chen SL. The Apicultural Science in China [M]. Beijing: China Agriculture Press, 2001.[陳盛祿. 中國蜜蜂學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001]

Gao YL, Miu Q, Zhang HD,etal. Advances on olfactory receptor gene [J].Hereditas, 2010, 32 (1): 17-24.[高一龍, 繆勤, 張匯東, 等. 嗅覺受體基因的研究進(jìn)展[J]. 遺傳, 2010, 32 (1): 17-24]

Gong ZJ, Zhou WW, Zhu ZR,etal. Advances in the studies of insect olfactory receptors [J].ActaEntomologicaSinica, 2008, 51 (7): 761-768.[鞏中軍, 周文武, 祝增榮, 等. 昆蟲嗅覺受體的研究進(jìn)展[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2008, 51 (7): 761-768]

Hallem EA, Nicole FA, Zwiebel LJ,etal. Olfaction: Mosquito receptor for human-sweat odorant [J].Nature, 2004, 427 (6971): 212-213.

Pennisi E. Fruit fly odor receptors found [J].Science, 1999, 283 (5406): 1239-1239.

Plettner E, Otis GW, Wimalaratne PDC,etal. Species-and caste-determined mandibular gland signals in honeybees (Apis) [J].JournalofChemicalEcology, 1997, 23 (2): 363-377.

Robertson HM, Wanner KW. The chemoreceptor superfamily in the honeybee,Apismellifera: Expansion of the odorant, but not gustatory, receptor family [J].GenomeResearch, 2006, 16 (11): 1395-1403.

Touhara K, Vosshall LB. Sensing odorants and pheromones with chemosensory receptors [J].AnnualReviewofPhysiology, 2009, 71 (1): 307-32.

Vogt RG, Miller NE, Litvack R,etal. The insect SNMP gene family [J].InsectBiochemistry&MolecularBiology, 2009.

Vosshall LB, Amrein H, Morozov PS,etal. A spatial map of olfactory receptor expression in theDrosophila, antenna [J].Cell, 1999, 96 (5): 725-36.

Wang NN. The Intro Evolution of Entomic Olfactory Receptor Gene,Or83b-likeGene [D]. Shandong Agricultural University, 2008.[王妮娜. 昆蟲嗅覺受體Or83b-like基因內(nèi)含子的進(jìn)化研究[D]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008]

Wanner KW, Nichols AS, Walden KK,etal. A honey bee odorant receptor for the queen substance 9-oxo-2-decenoic acid [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 2007, 104 (36): 14383-8.

Wang QF, Li WS, Zhang QM,etal. The natural mating interference betweenApisceranaandA.mellifera[J].EntomologicalKnowledge, 2003, 40 (2): 164-167.[王啟發(fā), 李位三, 張啟明, 等. 中、西蜂間自然交尾干擾問題的觀察[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2003, 40 (2): 164-167]

Zeng ZJ. Apiculture [M]. Beijing: China Agriculture Press, 2009.[曾志將. 養(yǎng)蜂學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009]

Zhao HT, Gao PF, Zhang GX,etal. Advances in research on honeybee olfactory proteins [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 2012, 49 (5): 1366-1371.[趙慧婷, 高鵬飛, 張桂賢, 等. 蜜蜂嗅覺相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2012, 49 (5): 1366-1371]

Zhao HT, Gao PF, Zhang GX,etal. Gene cloning and sequence analysis ofOr1 andOr2 inApiscerana[J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 2012, 49 (5): 1117-1124.[趙慧婷, 高鵬飛, 張桂賢, 等. 東方蜜蜂氣味受體基因Or1和Or2的克隆與序列分析[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2012, 49 (5): 1117-1124]

Cloning and sequencing analysis ofOdourreceptor170 in honeybees,Apisceranacerana

YANG Le, ZENG Zhi-Jiang, ZHANG Li-Zhen*

(Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Aprimer for the geneOdourreceptor170 ofApisceranacerana(AcOr170) was designed to clone its cDNA sequence in drones. The aim was to compare evolutionary differences between theApisceranaceranaand other honeybee species. The experimental results showed that the overall sequence ofAcOr170 was 1356 bp in length. The coding region length was 1188 bp, encoding 396 amino acids. Its molecular weight was 46.272 kDa, isoelectric point was 8.96, and the accession ID of Genbank was KX264359. Structural domain analysis indicated that the encoded protein contained a highly conserved structure of 7tm-6. Sequence alignment showed that genome sequences were highly similar amongA.ceranacerana,A.melliferalinnaeus andA.dorsata.

Apisceranacerana；odorant receptors；Or170；sequence alignment；evolution analysis

國家自然科學(xué)基金(31572469, 31602015)；國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(No.CARS-45-kxj12)

楊樂，男，1992年生，碩士研究生，主要從事蜜蜂生物學(xué)研究工作，E-mail: 18735431277@163.com

*通訊作者 Author for correspondence, E-mail: lzcg@126.com

Received：2016-10-09；接受日期 Accepted：2016-11-23

Q963;S89

A

1674-0858(2017)01-0048-07

楊樂, 曾志將, 張麗珍.中華蜜蜂氣味受體基因AcOr170的克隆與序列分析[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(1):48-54.