地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)奶牛后腸道與乳中菌群數(shù)量、體細(xì)胞數(shù)及表觀消化率的影響

李 洋，竇秀靜，張幸怡，王一臻，張永根

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

地頂孢霉培養(yǎng)物對(duì)奶牛后腸道與乳中菌群數(shù)量、體細(xì)胞數(shù)及表觀消化率的影響

李 洋，竇秀靜，張幸怡，王一臻，張永根*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

本試驗(yàn)旨在研究地頂孢霉培養(yǎng)物（Acremonium Terricola culture，ATC）對(duì)奶牛后腸道與乳中菌群數(shù)量、體細(xì)胞數(shù)和表觀消化率的影響。試驗(yàn)一采用隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇30頭生產(chǎn)性能相近的泌乳后期荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為3組，每組10頭。對(duì)照組飼喂普通TMR日糧，低劑量組、高劑量組在TMR日糧基礎(chǔ)上分別每天每頭添加15 g和30 g ATC；試驗(yàn)二采用自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用5頭體重、產(chǎn)奶量、胎次和體細(xì)胞數(shù)均相近的泌乳后期奶牛，1～7 d（試驗(yàn)前期）只飼喂TMR日糧，8～28 d（試驗(yàn)期）飼喂TMR日糧和ATC，29～35 d（試驗(yàn)后期）停止添加ATC。結(jié)果表明：ATC能夠提高后腸道糞便中的乳酸菌相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）以及干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率（P＜0.05）；降低試驗(yàn)期乳中體細(xì)胞數(shù)量和乳房鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）。綜上所述，ATC能夠增殖奶牛后腸道益生菌的數(shù)量，提高表觀消化率；對(duì)乳中體細(xì)胞數(shù)和致病菌相對(duì)數(shù)量的抑制也有顯著效果。在本試驗(yàn)條件下，適宜添加量為每天每頭30 g ATC。

地頂孢霉培養(yǎng)物；菌群數(shù)量；體細(xì)胞數(shù)；表觀消化率

在我國(guó)，奶牛疾病的預(yù)防和生產(chǎn)性能的提高長(zhǎng)期以應(yīng)用抗生素為主要手段。然而，由于畜產(chǎn)品中的抗生素殘留和耐藥性等問(wèn)題日益突出，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家已經(jīng)逐步全面禁止飼用抗生素的使用。因此，尋找新的抗生素替代物已迫在眉睫。

地頂孢霉培養(yǎng)物（Acremonium Terricola culture，ATC）是從古尼蟲草分離的地頂孢霉菌經(jīng)人工發(fā)酵而得到的產(chǎn)品，擁有蟲草素、蟲草酸、多糖、甾醇和氨基酸等與古尼蟲草相似的功能性成分。ATC能夠提高仔豬增重和飼料利用效率[1]，提高蛋鴨的體重和產(chǎn)蛋率，改善蛋品質(zhì)[2]。ATC所含有的功能性成分和蟲草提取物能夠改善動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力和免疫能力[3-4]，通過(guò)選擇性抑制致病菌和腸道有害菌[5]，促進(jìn)腸道益生菌的作用[6]，從而提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能。同時(shí)，地頂孢霉發(fā)酵液提取物具有優(yōu)于維生素E的自由基清除能力[7]。由于乳中體細(xì)胞數(shù)與奶牛乳房炎的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)[8]，奶牛免疫能力低下會(huì)導(dǎo)致其清除細(xì)菌的能力下降[9]，從而導(dǎo)致體細(xì)胞數(shù)升高和乳房炎的發(fā)生。因此，控制乳中體細(xì)胞數(shù)和致病菌數(shù)量也是保證奶牛健康的重要手段之一。以上研究提示，ATC可能在調(diào)節(jié)奶牛腸道菌群、提高飼料消化率、降低體細(xì)胞數(shù)等方面具有很大的潛力。因此，本試驗(yàn)旨在研究ATC對(duì)奶牛后腸道與乳中菌群量、體細(xì)胞數(shù)及表觀消化率的影響，為ATC在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品來(lái)源 ATC來(lái)自合肥邁可羅生物工程有限公司。ATC是一種由古尼蟲草上提取的地頂孢霉菌（菌種號(hào)：CGMCC NO. 0346）經(jīng)固液雙相發(fā)酵獲得的滅活的蟲草類真菌飼料添加劑，含有26.84%粗蛋白（CP）、5.00%粗纖維（CF）、3.06%粗脂肪（EE）、4.04%粗灰分（Ash）和61.06%無(wú)氮浸出物（NFE）（干物質(zhì)基礎(chǔ)）。其中功能性成分含量蟲草酸84.50 g/kg、蟲草多糖44.60 g/kg、蟲草素0.432 g/kg、甾醇0.597 g/kg、總氨基酸218.1 g/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧管理 試驗(yàn)一：選用30頭體重相近（650 kg左右）的經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為3組。3組奶牛的生產(chǎn)性能參數(shù)見(jiàn)表1。

對(duì)照組飼喂普通TMR日糧，低劑量組飼奶牛完全采食添加劑。每天07：00和19：00各飼喂1次，每天分別在06：30、12：00和18：30進(jìn)行擠奶，自由飲水。日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

試驗(yàn)二：采用自身對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選用5頭體重（637±25）kg、產(chǎn)奶量（25.74±0.87） kg/d、胎次相同（3胎）、泌乳期（230±6）d、體細(xì)胞數(shù)（34.29±4.79）萬(wàn)/mL的泌乳奶牛。每天07∶00和19∶00各飼喂1次，每天06∶30、12∶00和18;30擠奶3次，自由飲水。試驗(yàn)期共35 d，分為3期。1～7 d為試驗(yàn)前期，奶牛飼喂TMR日糧（日糧配方同試喂TMR+ATC 15 g/（d·頭），高劑量組飼喂TMR+ATC 30 g/（d·頭）。試驗(yàn)共8周，第1周預(yù)試，后7周為正試期。每天晨飼前，將ATC與100 g 左右TMR日糧均勻混合，單獨(dú)飼喂給試驗(yàn)牛，保證驗(yàn)一）；8～28 d為試驗(yàn)期中期，奶牛飼喂TMR日糧+30 g/（d·頭）ATC；29～35 d為試驗(yàn)后期，奶牛停止飼喂ATC，只飼喂TMR日糧。飼喂方式與試驗(yàn)一相同。

表1 3組奶牛的生產(chǎn)性能參數(shù)（n=10）

表2 TMR日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 試驗(yàn)一指標(biāo)測(cè)定 后腸道糞中菌群相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定：于試驗(yàn)期的最后2 d，對(duì)所有試驗(yàn)牛（30頭）進(jìn)行直腸（距肛門約20～30 cm處）采糞，收取100 g左右糞樣，立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃冰箱內(nèi)，以備菌群DNA提取。按照OMEGA Stool DNA Kit（D4015，上海玉博）試劑盒直接對(duì)糞便樣本進(jìn)行細(xì)菌總DNA的提取。熒光定量所用儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀，Real-time PCR SYBR Green I RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)包括95℃變性7 min，55℃ 1 min，72℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。特異性引物序列由生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)（上海），具體序列見(jiàn)表3。本試驗(yàn)中，糞便中檢測(cè)的細(xì)菌有乳酸菌、大腸桿菌和雙歧桿菌。試驗(yàn)通過(guò)熒光定量方法，測(cè)定不同細(xì)菌相對(duì)于總菌的基因倍數(shù)。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

養(yǎng)分消化率的測(cè)定：于試驗(yàn)期的最后2 d，對(duì)所有試驗(yàn)牛（30頭）進(jìn)行直腸采糞（方法同上），加入10%的硫酸10 mL固氮。采樣結(jié)束后，將同一頭牛2 d的糞樣等質(zhì)量均勻混合，取150 g，-20℃保存，待測(cè)。于試驗(yàn)結(jié)束前2 d，四分法收集各組日糧2 kg，送往實(shí)驗(yàn)室待測(cè)。消化率的測(cè)定采用酸不容灰分法（AIA法）測(cè)定，計(jì)算公式：

表3 糞便和原奶中菌群的PCR引物序列

其他指標(biāo)測(cè)定：干物質(zhì)和粗蛋白含量根據(jù)（AOAC，2000）[10]測(cè)定，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的測(cè)定參考Van Soest的方法[11]。

1.3.2 試驗(yàn)二指標(biāo)測(cè)定 乳中體細(xì)胞數(shù)的測(cè)定：于試驗(yàn)前期、試驗(yàn)期和試驗(yàn)后期的最后2 d收集奶樣，每次擠奶時(shí)棄掉頭三把奶后，收集100 mL奶樣，將早、中、晚的奶樣按照4：3：3進(jìn)行混合，加入防腐劑后送往實(shí)驗(yàn)室，采用利拉伐體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄體細(xì)胞數(shù)量。

乳中病原微生物的測(cè)定：于試驗(yàn)前期、試驗(yàn)期和試驗(yàn)后期的最后2 d收集奶樣后，將早、中、晚的奶樣按照4：3：3進(jìn)行混合，并立即保存于-80℃冰箱內(nèi)，以備菌群DNA的提取。

原奶中總DNA的提取：采用細(xì)菌DNA提取試劑盒（美國(guó)，Sigma公司），具體操作步驟參照說(shuō)明書。熒光定量所用儀器及反應(yīng)條件同試驗(yàn)一，乳中菌群PCR引物序列由生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)（上海），具體序列見(jiàn)表3。

本試驗(yàn)中，乳中病原菌有乳房鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌。數(shù)據(jù)處理同試驗(yàn)一。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用7500 System Software分析Real-time PCR結(jié)果。所有數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.1軟件中ANOVA程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan's法，菌群相對(duì)數(shù)量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，表觀消化率與體細(xì)胞數(shù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ATC對(duì)奶牛后腸道菌群相對(duì)數(shù)量的影響 如圖1所示，試驗(yàn)組顯著提高了奶牛后腸道糞便中乳酸菌的相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05），但是低劑量組和高劑量組間差異不顯著（P＞0.05）。同時(shí)，ATC對(duì)后腸道糞便中大腸桿菌和雙歧桿菌的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

2.2 ATC對(duì)奶牛養(yǎng)分表觀消化率的影響 由表4可見(jiàn)，隨著ATC添加量的提高，干物質(zhì)和粗蛋白的表觀消化率顯著增加（P＜0.05）。但是，ATC對(duì)纖維的表觀消化率沒(méi)有顯著改善（P＞0.05）。低劑量組各指標(biāo)與對(duì)照組相比均有下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 ATC對(duì)乳中體細(xì)胞數(shù)的影響 由表5可知，試驗(yàn)期和試驗(yàn)后期乳中體細(xì)胞數(shù)量顯著低于試驗(yàn)前期（P=0.0034），試驗(yàn)期和試驗(yàn)后期體細(xì)胞數(shù)差異不顯著，說(shuō)明ATC的有效作用時(shí)間至少持續(xù)1周。

圖1 不同添加量ATC對(duì)奶牛后腸道菌群相對(duì)數(shù)量的影響

圖2 ATC對(duì)乳中病原菌的影響

表 4 不同添加劑量ATC對(duì)奶牛表觀消化率的影響 %

2.4 ATC對(duì)乳中病原微生物相對(duì)數(shù)量的影響 圖2顯示，與試驗(yàn)前期相比，試驗(yàn)期ATC的添加顯著降低了乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的豐度（P＜0.05）。試驗(yàn)后期，幾種病原菌的豐度均有所回升。然而，乳房鏈球菌的基因相對(duì)表達(dá)量仍然低于試驗(yàn)前期（P＜0.05）。試驗(yàn)期間，停乳鏈球菌與試驗(yàn)前期相比有降低趨勢(shì)（P=0.07），但是ATC對(duì)無(wú)乳鏈球菌的基因表達(dá)量沒(méi)有影響（P=0.91）。

3 討 論

3.1 ATC對(duì)奶牛后腸道糞便菌群的影響 動(dòng)物腸道內(nèi)各種微生物區(qū)系間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)動(dòng)物機(jī)體非常重要。家畜的健康狀況與家畜本身腸道內(nèi)的菌群平衡關(guān)系密切。大腸桿菌等致病菌的數(shù)量會(huì)隨著家畜腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡的破壞而顯著增加，從而產(chǎn)生毒副作用，引起消化機(jī)能的紊亂，導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)性能和消化機(jī)能的下降[12]。本試驗(yàn)中，ATC雖然沒(méi)有抑制糞便中大腸桿菌的量，但顯著增加了乳酸菌的相對(duì)表達(dá)量。Koh等[6]已經(jīng)證明，蛹蟲草提取物能夠降低肉雞小腸內(nèi)沙門氏菌和大腸桿菌的數(shù)量，并增加乳酸菌的數(shù)量，從而提高其生長(zhǎng)性能，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。蟲草素對(duì)梭菌的選擇抑制作用也有報(bào)道[5]。而本試驗(yàn)中，ATC對(duì)致病菌的抑制作用不明顯可能與加工工藝和成分含量不同有關(guān)，但ATC對(duì)益生菌的選擇增殖作用同樣非常重要。研究表明，有益優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量的增加能夠降低病原菌或有害菌的數(shù)量。益生菌能夠同有害菌競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分或吸附位點(diǎn)，并消耗氧氣、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等途徑抑制致病菌等有害微生物的增殖；同時(shí)益生菌本身能夠成為非特異性免疫因子，通過(guò)細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分刺激宿主細(xì)胞的體液免疫和細(xì)胞免疫水平來(lái)提高機(jī)體抵抗力[12]。

3.2 ATC對(duì)奶牛表觀消化率的影響 動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的高消化率是動(dòng)物高消化性能的重要體現(xiàn)，更是促進(jìn)家畜生長(zhǎng)的重要保證。本試驗(yàn)中，奶牛后腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的提高與ATC提高奶牛后腸道乳酸菌數(shù)量有關(guān)。后腸道乳酸菌數(shù)量的提高有利于腸道內(nèi)有機(jī)酸的產(chǎn)生，從而提高動(dòng)物腸胃的消化機(jī)能[13]；同時(shí)，有益微生物的增殖能夠?qū)暳现懈嗟姆堑鞍椎D(zhuǎn)化為可被機(jī)體吸收利用的菌體蛋白，從而提高氨基酸含量和蛋白質(zhì)質(zhì)量[14]，并提高日糧中粗蛋白和干物質(zhì)的表觀消化率，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。魏建忠等[1]通過(guò)仔豬飼喂試驗(yàn)證明了ATC能夠提高其飼料轉(zhuǎn)化率，并改善其生長(zhǎng)性能。同時(shí)，ATC對(duì)蛋鴨的體重、產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)也有明顯的改善作用[2]。因此，可以推測(cè)ATC在提高飼料消化吸收、改善飼料利用率、提高動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)性能方面具有一定的作用。

3.3 ATC對(duì)奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)和菌群的影響 作為衡量奶牛乳腺健康的重要檢測(cè)指標(biāo)，乳中體細(xì)胞數(shù)與奶牛乳房炎的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)[8]，乳房的感染幾率會(huì)隨著體細(xì)胞數(shù)的增加而上升，從而導(dǎo)致奶牛乳房炎發(fā)病率的提高。本試驗(yàn)中，ATC對(duì)乳中體細(xì)胞數(shù)量有顯著降低作用，可能與ATC的功能性成分的抗氧化作用有關(guān)。本課題組的前期研究結(jié)果已經(jīng)證明，ATC能夠提高SD大鼠肝臟和血液中的抗氧化酶活性，改善機(jī)體的抗氧化和免疫功能[15]。國(guó)內(nèi)外大量試驗(yàn)也證明，蟲草類物質(zhì)以及活性成分（蟲草多糖，蟲草素）具有調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的作用[3-4]。而前人研究已經(jīng)證明，抗氧化劑的攝入能夠提高水牛谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和總抗氧化能力，并降低乳中體細(xì)胞數(shù)量[16]。因此，ATC的功能性成分是該添加劑發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。而本試驗(yàn)中ATC對(duì)乳中病原菌豐度的調(diào)節(jié)也是降低體細(xì)胞數(shù)的重要原因。當(dāng)乳中體細(xì)胞數(shù)超過(guò)10萬(wàn)時(shí)，體細(xì)胞數(shù)與乳房感染間存在著高度相關(guān)性[17]。而導(dǎo)致乳房感染和體細(xì)胞數(shù)升高的最主要致病菌有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌。本試驗(yàn)中，隨著ATC的飼喂，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌的豐度顯著降低，隨之而來(lái)的就是體細(xì)胞數(shù)的降低。雖然前人研究證明，蟲草素和蟲草多糖具有抑制梭菌[5]和腸道內(nèi)大腸桿菌[6]等有害菌的作用，但是ATC在控制乳腺病原菌方面的機(jī)理還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

ATC能夠增殖奶牛后腸道益生菌的數(shù)量，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率；同時(shí)，對(duì)乳中體細(xì)胞數(shù)和致病菌相對(duì)數(shù)量的抑制也有顯著效果。在本試驗(yàn)條件下，適宜添加量為每頭每天30 g。

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E ff ects of Acremonium terricola Culture on Flora Amount in Intestinal and Milk, Somatic Cell Counts and Nutrients Apparent Digestibility of Dairy Cows

LI Yang, DOU Xiu-jing, ZHANG Xing-yi, WANG Yi-zhen, ZHANG Yong-gen*
(College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Heilongjiang Harbin 150030, China)

This experiment was conducted to study the e ff ects of Acremonium terricola culture (ATC) on fl ora amount in intestinal and milk, somatic cell counts (SCC) and apparent digestibility of dairy cows. In experiment 1, according to completely randomized design, thirty late-lactating Holstein dairy cows with similar performance were randomly allotted to three treatments, ten cows in each group: a basal diet plus 0, 15 or 30 g/d·cow ATC. In experiment 2, by self-control design, fi ve late-lactating Holstein dairy cows with similar body weight, milk production, parity and SCC were used. Five dairy cows were fed the TMR diet from d 1 to 7 (Pre-trial period). From d 8 to 28 (trial period), the same cows were fed 30 g/d·cow ATC. Supplementation with ATC was stopped from d 29 to 35 (Post-trial period). The results showed that the relative expression of lactobacillus in intestinal in experimental group was signi fi cantly higher than that in control group after supplementing with ATC (P＜0.05), and the nutrient apparent digestibility of crude protein and dry matter in experimental group was significantly higher than that in control group (P＜0.05). Meanwhile, SCC and the relative expression of Streptococcus uberis, Escherichia coli and Staphylococcus aureus in milk were significantly decreased (P＜0.05). In conclusion, Acremonium Terricola culture can improve the relative expression of intestinal probiotics and enhance apparent digestibility of some nutrients in TMR, and significantly inhibit SCC and the relative expression of pathogenic bacteria. In the conditions of this study, the suitable recruitment is 30 g / d·cow.

Acremonium Terricola culture; Flora amount; Somatic cell counts; Apparent digestibility

S823.5

：A

：10.19556/j.0258-7033.2017-02-110

2016-06-06；

2016-07-14

國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37）

李洋(1989-)，男，肇東市人，博士，主要從事反芻動(dòng)物生產(chǎn)的研究，Email:liyang1405053@sina.com

* 通訊作者：張永根，教授，E-mail:zhangyonggen@sina.com