犬用鹽酸特比萘芬噴霧劑處方篩選及含量測(cè)定研究

馬軍明，楊柳，杜守穎，譚寧,趙夢(mèng)迪，王承，白潔，陸洋(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

犬用鹽酸特比萘芬噴霧劑處方篩選及含量測(cè)定研究

馬軍明，楊柳，杜守穎，譚寧,趙夢(mèng)迪，王承，白潔*，陸洋*
(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

對(duì)犬用鹽酸特比萘芬噴霧劑進(jìn)行處方篩選并對(duì)鹽酸特比萘芬進(jìn)行含量測(cè)定。以噴霧劑成型性為指標(biāo)優(yōu)選出2%月桂氮卓酮(水溶性)，0.35 g/L苯甲酸鈉，10 % Kolliphor?HS 15和適量高純水制成水溶液。采用HPLC法測(cè)定該處方中有效成分鹽酸特比萘芬的含量,結(jié)果顯示鹽酸特比萘芬在0.0201～0.4026 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2.652×107X-2.418×104(r=0.9998，n=6)，平均回收率為104.14%，RSD為1.23%。通過采用HPLC法測(cè)量有效成分鹽酸特比萘芬的含量穩(wěn)定，所篩選的處方工藝可行，制備方法簡(jiǎn)單方便。

鹽酸特比萘芬；噴霧劑；處方篩選；含量測(cè)定

犬類皮膚真菌病又稱癬，是由皮膚真菌(小孢子菌屬和毛癬菌屬)侵入皮膚被毛和爪部，寄生或腐生于表皮，角質(zhì)，被毛和爪部的角質(zhì)蛋白組織中所引起的一種真菌性傳染病[1]。今年，犬類疾病遍布全國，尤其伴隨著人們養(yǎng)寵物狗的數(shù)量增多，患病犬類的數(shù)量也越來越多，因此這類疾病對(duì)犬類和犬類主人造成極大壓力和痛苦。鹽酸特比萘芬(Terbinafine hydrochloride)是一個(gè)丙烯胺類藥物，對(duì)于皮膚類、發(fā)和甲的致病性真菌均有廣泛的抗真菌活性。該藥的作用機(jī)制是高選擇性抑制真菌角鯊烯環(huán)氧化酶，使真菌細(xì)胞膜形成過程中角鯊烯環(huán)氧化反應(yīng)受阻，起到抑菌作用；該藥抑制角鯊烯環(huán)氧化酶后，其前體角鯊烯在細(xì)胞內(nèi)大量積聚，導(dǎo)致真菌細(xì)胞中毒死亡，起到殺菌作用[2]?？诜蚓植渴褂帽酒?能有效治愈須發(fā)癬菌或大小孢子菌引起的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性皮膚感染。本實(shí)驗(yàn)考慮到，近年來國內(nèi)市場(chǎng)上，治療動(dòng)物的皮膚病類藥物較少，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了篩選處方制作鹽酸特比萘芬噴霧劑的研究。

1 材 料

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；BSA224S型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。1.2 試劑與藥品 鹽酸特比萘芬原料藥(濟(jì)南明鑫制藥股份樣公司，批號(hào)13125510)；鹽酸特比萘芬對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100563-201402)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))；甲醇(Fisher，色譜純)；四氫呋喃(Fisher，色譜純)；磷酸(北京化工廠，色譜純)；甲基氫氧化銨(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；苯甲酸鈉(北京市旭東化工廠)；Kolliphor?HS 15(4832876E0 德國BASF公司)；月桂氮卓酮(藥用標(biāo)準(zhǔn),湖北武漢遠(yuǎn)成生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中華大蟾蜍，雌雄兼用，30～40 g，由北京閻村新生蟾蜍養(yǎng)殖中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸特比萘芬噴霧劑的處方篩選

2.1.1 根據(jù)藥物在不同溶劑中的溶解性來篩選溶劑 取鹽酸特比萘芬適量，分別溶于100 mL的高純水、PBS緩沖液、30%PEG-200溶液、30%PEG-400溶液、5% Kolliphor?HS 15[3]溶液、10% Kolliphor?HS 15溶液中，超聲15 min，以溶解性和溶液澄清度、顏色為觀察指標(biāo)，觀察現(xiàn)象見表1。

表1 溶劑觀察指標(biāo)

結(jié)果表明，30%PEG-400溶液、10% Kolliphor?HS 15溶液在溶解鹽酸特比萘芬后，溶解性、澄清度以及顏色符合要求。初步篩選，以上兩種溶液為噴霧劑的溶劑。

2.1.2 通過溶劑對(duì)黏膜刺激性研究進(jìn)一步篩選溶劑 由于采用外用給藥形式時(shí)，可能應(yīng)用到由于真菌感染引起的破損皮膚，因此需要考察溶劑對(duì)破損皮膚的刺激性。皮膚破損后黏霧暴露，可以借鑒黏膜刺激性的研究方法，考察溶劑的刺激性。采用在體蟾蜍實(shí)驗(yàn)方法，選用文獻(xiàn)公認(rèn)有嚴(yán)重纖毛毒性的去氧膽酸鈉作為陽性對(duì)照品，以生理鹽水作為空白對(duì)照，分別評(píng)價(jià)30%PEG-200、30%PEG-400、10% Kolliphor?HS 15溶液的纖毛毒性，結(jié)果見圖1。

1．生理鹽水；2． 1%去氧膽酸鈉；3． 30%PEG200；4． 30%PEG400；5． 10%Kolliphor?HS 15與生理鹽水比較，*P<0.05,**P<0.01圖1 各給藥組纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間

結(jié)果表明，給予陽性藥1%去氧膽酸鈉組纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間與生理鹽水相比有顯著性差異，說明其對(duì)纖毛有很大毒性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；給予30%PEG-200、10% Kolliphor?HS 15的纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間與生理鹽水相比沒有顯著性差異，說明其對(duì)纖毛作用基本無影響，即無纖毛毒性；而30%PEG-400藥物的纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間與生理鹽水相比有差異，說明其對(duì)纖毛有一定的毒性，不能作為噴霧劑的溶劑。結(jié)合溶解度試驗(yàn)，由于鹽酸特比萘芬在30%PEG-200中難以達(dá)到有效的治療濃度，因此選擇10%Kolliphor?HS 15為溶劑[4]。

2.1.2 處方中促透劑與防腐劑的篩選 按照未加促透劑與防腐劑的處方輔料比例配制鹽酸特比萘芬噴霧劑溶液，以10% Kolliphor?HS 15為溶劑，分別選擇1%、2%、3%濃度的氮酮[5]，0.25 g/L、0.3 g/L、0.35 g/L的苯甲酸鈉[6]配組，按照《中國藥典》[7]2015版四部噴霧劑制備準(zhǔn)則制備以及藥用輔料常用量進(jìn)行設(shè)計(jì)制備噴霧劑溶液，以藥液pH值穩(wěn)定性和促透效果[8]為指標(biāo)，結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，初步篩選處方為6。結(jié)果見表2。

表2 篩選數(shù)據(jù)表

2.3 處方與制備

2.3.1 處方 鹽酸特比萘芬適量， 2%氮酮(水溶性)，0.035%苯甲酸鈉， 10%Kolliphor?HS 15，適量高純水制成鹽酸特比萘芬水溶液。

2.3.2 制備 取10 g Kolliphor?HS 15于適量去離子水中，超聲振蕩使其溶解。向溶液中加苯甲酸鈉溶解后加入鹽酸特比萘芬繼續(xù)超聲振蕩溶解，最后在溶解中加入氮酮(水溶性)，待溶解完全，放入干凈的噴瓶中，即可。

2.3.3 性狀 按照處方工藝制備的鹽酸特比萘芬噴霧劑為微黃色透明溶液。

2.3.4 pH值 分別取三批的鹽酸特比萘芬噴霧劑樣品，批號(hào)分別為20151101、20151102、20151103,各取兩個(gè)樣品測(cè)定pH值，結(jié)果見表3，三批樣品的pH值均在3.6～4.1之間，符合要求。

表3 測(cè)量三批樣品的pH數(shù)據(jù)

2.4 鹽酸特比萘芬噴霧劑含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[9-10]方法，色譜柱：Merck KGaA Hibar-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-四氫呋喃-四甲基氫氧化銨(60∶20∶20)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，(取25%四甲基氫氧化銨5.8 mL，加水800 mL，用0.7 mol/mL磷酸溶液調(diào)pH值至7.8，加水稀釋至1000 mL)(60∶20∶20)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫，進(jìn)樣量20 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 按照所需濃度精密稱取鹽酸特比萘芬對(duì)照品，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為對(duì)鹽酸特比萘芬對(duì)照品溶液[9]。

2.4.3 供試品溶液的制備 將不同批次樣品，精密吸取0.25 mL的樣品(相當(dāng)于鹽酸特比萘酚約2.5 mg)，置25 mL棕色瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 線性關(guān)系考察 按照2.4.2項(xiàng)下對(duì)照品配制方法，配制濃度為0.4026 mg/mL的鹽酸特比萘酚對(duì)照品。精密取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，置于10 mL容量瓶中甲醇稀釋至刻度線，配制濃度分別為0.0201、0.0403、0.0805、0.1610、0.2416、0.3221、0.4026 mg/mL的對(duì)照品溶液。取不同濃度對(duì)照品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以鹽酸特比萘芬吸收峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣濃度(X, mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程Y= 2.652×107X-2.418×104(r=0.9998，n=6),表明鹽酸特比萘芬在0.0201～0.4026 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.4.5 重復(fù)性考察 按照2.4.3項(xiàng)下方法，配制成濃度為0.100 mg/mL供試品溶液，6份，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算鹽酸特比萘芬含量平均值及RSD值。樣品鹽酸特比萘芬平均含量為0.100 mg/mL，RSD為1.48%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.4.6 精密度考察 按照2.4.2項(xiàng)下方法，配制濃度為0.100 mg/mL的對(duì)照品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，日內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算精密度。計(jì)算得峰面積的RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 按照2.4.3項(xiàng)下方法，配制成濃度為0.100 mg/mL供試品溶液，6份，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算色譜圖和峰面積。計(jì)算峰面積的RSD為1.06%，表明供試品12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按照2.4.2項(xiàng)下方法，配制已知鹽酸特比萘芬含量0.25 mg/mL的溶液，從中精密吸取10 mL共6份，加入到50 mL容量瓶中，再精密量取0.25 mL鹽酸特比萘芬樣品6份，分別加入容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，搖勻，制成加樣回收液。按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD值，結(jié)果見表4。

表4 供試品加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.9 色譜圖 鹽酸特比萘芬噴霧劑陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液及樣品處理液的色譜圖，見圖2，鹽酸特比萘芬的保留時(shí)間為12.5 min左右，理論塔板數(shù)為11788。陰性對(duì)照品為按照鹽酸特比萘芬噴霧劑處方，不添加鹽酸特比萘芬藥物而制備。2.4.10 樣品含量測(cè)定 配制3批噴霧劑溶液，按照2.4項(xiàng)下方法制得鹽酸特比萘芬供試品與對(duì)照品溶液；按2.4.1色譜方法測(cè)定，三批樣品的含量分別99.02%、99.03%、100.45%，均符合規(guī)定[11]。

A:陰性對(duì)照溶液; B:對(duì)照品溶液; C:樣品處理液圖2 鹽酸特比萘芬噴霧劑色譜圖

3 討論與小結(jié)

本品是針對(duì)寵物犬類研究的一種藥品，這從對(duì)動(dòng)物的抗真菌類外用制劑藥物來說是一個(gè)創(chuàng)新與突破。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鹽酸特比萘芬劑型有很多，一般有乳膏劑、栓劑、凝膠、搽劑等，但這些都屬于長(zhǎng)效性的藥物，對(duì)于寵物犬來說，這些劑型在給藥方面會(huì)很困難。而采用噴霧給藥，與其他劑型相比較，藥物直接到達(dá)作用部位，給藥時(shí)與給藥部位無直接的機(jī)械摩擦，從而減少了對(duì)皮膚的損傷或刺激，具有使用方便，吸收快，噴霧均勻等優(yōu)勢(shì)[12]。

在溶劑篩選上，本研究選擇黏膜刺激性低的10% Kolliphor?HS 15作為有效成分的溶劑，與其他溶劑相比，其優(yōu)勢(shì)在于其生物相容性好、增溶能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高、粘度低，同時(shí)具有毒性低的特點(diǎn)。

經(jīng)皮制劑通常需要加入促透劑促進(jìn)有效成分透皮吸收。月桂氮卓酮(簡(jiǎn)稱氮酮)是一種新型高效、無毒、無刺激性的透皮吸收促進(jìn)劑，能改變皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，促進(jìn)藥物吸收，對(duì)親水性和疏水性成分均有較好的促滲作用，是目前國內(nèi)外常用的滲透促進(jìn)劑。研究表明，氮酮對(duì)于多數(shù)制劑的促進(jìn)作用優(yōu)于其他化學(xué)滲透劑，外用藥物制劑中單用氮酮在1%～6%濃度時(shí)促滲作用較好；另外，氮酮對(duì)一些細(xì)菌、真菌也有抑制作用[13]。

噴霧劑長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)滋生細(xì)菌，需要加入防腐劑。苯甲酸鈉是目前最常用的防腐劑，性質(zhì)穩(wěn)定、易溶解水，對(duì)多種細(xì)菌、霉菌及酵母菌都具有防腐作用。苯甲酸鈉屬于酸性防腐劑，在酸性條件下防腐效果較好，而鹽酸特比萘芬噴霧劑pH值在3.7～4.1，所以本實(shí)驗(yàn)選用苯甲酸鈉作為防腐劑，符合藥典要求[11]。

該制劑試應(yīng)用于犬類真菌性疾病，我們對(duì)2只患有體癬的犬采用噴霧劑治療4周,觀察皮膚表面患病處明顯改善有效率100%。治療8周，觀察皮膚患病處大部分好轉(zhuǎn)。對(duì)于治療犬的癬類疾病療效差異，需要根據(jù)患病動(dòng)物的病情而定。

鹽酸特比萘芬噴霧劑的應(yīng)用可降低治療真菌性癬類疾病的痛苦，減輕人們對(duì)治療寵物犬類疾病帶來的生活壓力。對(duì)治療動(dòng)物皮膚病，提供新路，而且本品都是采用較為廉價(jià)的藥物輔料制成，從生產(chǎn)成本的角度考慮亦有重要意義。

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(編輯：李文平)

Prescription-screening and Determined the Content of Hydrochloride Terbinafine Sprays for Dogs

MA Jun-ming，YANG Liu，DU Shou-ying，TAN Ning，ZHAO Meng-di，WANG Cheng，BAI Jie*，LU-Yang*
(SchoolofChinesePharmacyBeijngUniversityofTCM，Beijing100102,China)

The present experiment focused on the dogs with hydrochloride terbinafine sprays which the prescription was screening and the content of hydrochloride terbinafine was going to be determined. Forming the spray which was based on the index of its formability, the prescription were made up of laurocapram(water-soluble), sodium benzoate, 10% Kolliphor?HS 15 and purity water that formulated the aqueous solution. Then the active ingredient content of terbinafine hydrochloride was determined by HPLC. The content determination of hydrochloride terbinafine concentration in the range of 0.0201～0.4026 mg/mL had a good linear relationship, the regression equation wasY=2.652×107X- 2.418×104(r=0.9998,n=6), the average rate of recovery was 104.14%,RSDwas 1.23%.The active ingredient content of hydrochloride terbinafine was stable by HPLC. The screened prescription was feasible, and the formulation process of preparation was simple.

terbinafine hydrochloride；spray agent；prescription-screening；content determination

2016-09-03

A

1002-1280 (2017) 02-0049-05

S859.79

北京市科技新星計(jì)劃資助(xx2015A048)；2015年青年骨干教師專項(xiàng)(2015-JYB-QNJSZX004)

馬軍明，碩士研究生，從事中藥制劑新劑型與新技術(shù)研究。

白潔，E-mail：baijie22811@163.com；陸 洋，E-mail：landocean28@163.com