QuEChERS-超高效液相色譜法-串聯質譜法同時檢測豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量

李丹妮，嚴鳳，周悅榕，沈偉強，陶軍，張婧(.上海市動物疫病預防控制中心，上海 00；.上海市松江區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 060；.上海市嘉定區(qū)農業(yè)技術推廣服務中心，上海 0800)

QuEChERS-超高效液相色譜法-串聯質譜法同時檢測豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量

李丹妮1，嚴鳳1，周悅榕1，沈偉強2，陶軍3，張婧1
(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.上海市松江區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 201620；3.上海市嘉定區(qū)農業(yè)技術推廣服務中心，上海 201800)

建立了QuEChERS前處理結合超高效液相色譜-串聯質譜同時檢測豬組織中賽庚啶和可樂定殘留量的方法。豬肉樣品添加0.5 g C18粉，豬肝和豬腎樣品添加3.0 g硫酸鎂和2.0 g氯化鈉，再分別加入10 mL 0.1%甲酸乙腈進行提取，提取液經濃縮后采用LC-MS/MS進行檢測，內標法定量。該方法線性關系良好，豬肉、豬肝和豬腎中賽庚啶和可樂定在1～50 μg/kg濃度范圍內加標回收率分別為62%～112%和106%～121%，相對標準偏差均<10%，方法檢出限為0.5 μg/kg。方法靈敏度高，選擇性好，可作為豬組織中賽庚啶和可樂定殘留量檢測的確證方法。

賽庚啶；可樂定；液相色譜-串聯質譜；豬組織

賽庚啶(Cyproheptadine, CYP)，是一種組胺H1受體拮抗藥[1]，作為人用藥可用于蕁麻疹、濕疹、過敏性和接觸性皮炎等疾病。賽庚啶可以通過結合下丘腦的5-羥色胺位點阻斷其活性[2]，興奮攝食中樞，從而達到增加動物體重和促進采食的作用?？蓸范?Clonidine，CLO)是一種中樞神經系統腎上腺素能α2-受體激動劑[3]，屬于咪唑啉衍生物，近年來開始將可樂定用于促進動物生長和改善酮體組成的研究[4]。因此，出現了將可樂定和賽庚啶兩種藥物在動物養(yǎng)殖過程中進行非法使用的情況，消費者在食用含有藥物殘留的生豬產品后會產生嚴重的食品安全隱患。賽庚啶和可樂定作為新型非法添加物已被寫入農業(yè)部1519號公告《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》，明確禁止使用。目前已有開展關于飼料[5]、豬尿[6]、動物飲水[7]、血液[8]、食品[9]及動物組織[10-11]基質中可樂定及賽庚啶含量的相關檢測方法，研究組織中的賽庚啶和可樂定殘留量檢測有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters超高效液相色譜串聯質譜系統(Waters?UPLC-TQ MS，Masslynx?工作軟件)；PL202-L感量為0.01 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；AB135-S感量為0.00001 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；漩渦混合器(美國 Talboys公司)； TARGIN VX-Ш多管渦旋振蕩器(北京踏棉科技有限公司)。AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(美國BECKMAN COULTER公司)； N-EVAP112 氮吹儀(美國 Orangaomation公司)；Milli-Q A10 超純水機(美國Millipore)； 0.22 μm 親水PTFE過濾膜(上海安譜科學儀器有限公司)。Sk7210HP 超聲波清洗器(上?？茖Ч?；C18粉(美國Agilent公司)；乙腈、甲酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；無水硫酸鎂、無水氯化鈉(化學純，上海凌峰化學試劑有限公司)。

標準品： 鹽酸賽庚啶(純度98%)，鹽酸可樂定(純度98%)，鹽酸二苯拉林(純度98%)，以上均購自美國sigma公司。鹽酸可樂定-D4(純度98%)，來源CDN，含量大于98%。

標準儲備液的配制：精密稱取鹽酸賽庚啶(以賽庚啶計)、鹽酸可樂定(以可樂定計)、鹽酸二苯拉林(以二苯拉林計)和鹽酸可樂定-D4(以可樂定-D4計)對照品各10.0 mg，分別于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度均為1 mg/mL的鹽酸賽庚啶、鹽酸可樂定、鹽酸二苯拉林和鹽酸可樂定-D4標準貯備液。

混合標準工作液和混合內標工作液的配制：分別精密量取鹽酸賽庚啶和鹽酸可樂定貯備液各1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為10 μg/mL的鹽酸賽庚啶和鹽酸可樂定標準儲備液。分別精密量取1 mg/mL鹽酸二苯拉林貯備液100 μL和1 mg/mL鹽酸可樂定-D4貯備液1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成鹽酸二苯拉林的濃度為1 μg/mL和鹽酸可樂定-D4的濃度為10 μg/mL的混合內標工作液。

混合標準工作曲線配制：精密量取混合標準工作液和混合內標工作液適量，用乙腈-0.1%甲酸溶液稀釋成賽庚啶和可樂定濃度為0.5、1、10、50、100 μg/L系列混合標準工作液，其中含鹽酸二苯拉林的濃度和鹽酸可樂定-D4的濃度分別為5 μg/L和50 μg/L，臨用現配。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent C18(100 mm×2.1 mm，粒徑1.8 μm)，柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流速0.3 mL/min；流動相 A為乙腈；B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～4 min，20～60% A；4～4.5 min，60～95% A；4.5～6.5 min，95% A；6.5～8.0 min，95～20% A；8.0～10 min，20% A。

1.2.2 質譜條件 電離模式：正離子電噴霧電離(ESI+)；質譜檢測模式：多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；脫溶劑溫度：500 ℃；孔流速：50 L/h；碰撞氣(Ar)流速：0.3 mL/min。分析中以保留時間和離子對豐度比作為定性分析依據，經過試驗優(yōu)化后的質譜參數如表1所示。

表1 可樂定、賽庚啶及其內標化合物的MRM參數

在定量離子的選擇過程中，避免選擇干擾較大的100以內的離子通道。

1.2.3 樣品前處理 稱取試料(2.00±0.02)g于50 mL離心管中，加入50 μL混合內標工作液后，豬肉樣品加入0.5 g C18粉，豬肝和豬腎樣品加入3.0 g硫酸鎂和2.0 g氯化鈉，振蕩混勻，加0.1%甲酸乙腈10 mL，充分振蕩，于8000 r/min離心5 min，取上清液，于離心管中，于50 ℃水浴氮氣吹干，用1.0 mL 0.1%甲酸/乙腈(80/20)溶液溶解，經0.22 μm濾膜過濾后進樣測定。

2 結果與分析

2.1 線性范圍 可樂定和賽庚啶的混合標準對照工作液用流動相配制，線形范圍為0.5～100 ng/mL。用液相色譜-串聯質譜測定工作液，獲得內標法標準曲線A賽庚啶=0.9721+0.1346C，線性相關系數r=0.9959，A可樂定=0.7702C+0.1782，線性相關系數r=0.9928。

2.2 方法回收率與精密度 選擇空白豬肝、豬肉、豬腎樣品作為測試對象，進行加標回收率實驗，在豬組織中添加可樂定和賽庚啶濃度為1、2、10、50 μg/kg的樣品進行加標回收實驗，考察方法的準確性和精密度。每批次內同一濃度做6次平行實驗，共重復3批次，結果見表2～表4，豬肉中添加回收圖譜見圖1。豬組織中可樂定回收率達到106%～121%，賽庚啶回收率達到62%～112%，相對標準偏差均<10%。

表2 豬肉中添加可樂定和賽庚啶回收率試驗結果

表3 豬肝中添加可樂定和賽庚啶回收率試驗結果

表4 豬腎中添加可樂定和賽庚啶回收率試驗結果

圖1 豬肉中可樂定和賽庚啶添加回收率MRM圖(添加濃度10 μg/kg)

2.3 檢測限和定量限 豬腎、豬肝、豬肉樣品中可樂定和賽庚啶方法最低檢測限為0.5 μg/kg，信噪比S/N(Peak to Peak)>3。方法最低定量限為1.0 μg/kg，信噪比S/N(Peak to Peak)>10。

3 討論與小結

3.1 定量方法的確定 藥物分析一般均采用外標法，體內藥物分析因提取步驟煩瑣，其回收率會受到較大影響，故盡量采用內標法進行校正。本研究選擇可樂定-D4可作為可樂定的內標物質。二苯拉林(Diphenylpyraline, DPP)的分子結構式和理化性質與賽庚啶相似(圖2～圖3)，且二苯拉林并不存在于自然環(huán)境中，因此在目前尚未合成賽庚啶同位素化合物的情況下可以作為檢測賽庚啶的良好的內標物質[12]。

圖2 賽庚啶和二苯拉林分子結構式

圖3 可樂定和可樂定-D4分子結構式

3.2 基質效應的考察 本研究通過基質效應實驗進一步探索二苯拉林作為賽庚啶內標的適宜性。將豬肉、豬肝、豬腎空白樣品按1.2.3項所述前處

理步驟進行前處理，得到相應的空白基質溶液，用此基質溶液添加標準溶液及內標溶液，配置為含鹽酸二苯拉林的濃度和鹽酸可樂定-D4的濃度分別為5 ng/mL和50 ng/mL，可樂定和賽庚啶濃度范圍為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL的基質標準溶液，進樣后得到基質標準曲線線性相關系數如表5，可知選擇鹽酸二苯拉林和鹽酸可樂定-D4作為賽庚啶和可樂定的內標物質，基質效應影響效果趨勢一致，因此可以充分達到校正基質效應校準結果的目的。

表5 基質標準曲線線性相關系數

3.3 QuEChERS方法的優(yōu)化 QuEChERS技術因高通量、快速、成本低的特點，近年由農藥殘留檢測領域逐步被引入到獸藥殘留檢測領域，并發(fā)表了大量的相關研究文章[13-15]。本研究在比較固相萃取與QuEChERS方法后，選擇了QuEChERS方法作為前處理方法開發(fā)的主要方向，基于市售QuEChERS方法對除水劑、凈化吸附劑進行了優(yōu)化。根據豬肉、豬肝、豬腎樣品不同的含水量及基質特點，在含水量較高的豬腎和豬肝樣品前處理中選擇了無水硫酸鎂和氯化鈉作為除水劑，分別比較了不同量的無水硫酸鎂和氯化鈉對實驗結果的影響(表6～表7)，結果發(fā)現當無水硫酸鎂為3.0 g、氯化鈉為2.0 g時，除水效果和回收率情況最理想。在含水量較少的豬肉前處理過程中僅選擇了C18粉作為吸附劑，C18可有效去除脂類、糖類等親脂型雜質，但過量的C18吸附劑也會吸附目標化合物而使回收率降低，經比較發(fā)現，0.5 g C18已經能滿足檢測靈敏度、凈化效果和回收率的要求，同時可達到簡化前處理步驟的效果。

表6 無水硫酸鎂加入量對回收率的影響

表7 氯化鈉加入量對回收率的影響

本方法應用優(yōu)化的QuEChERS技術結合超高效液相色譜-串聯質譜建立了豬肉、豬肝和豬腎中可樂定和賽庚啶的殘留檢測方法。與現有的檢測方法相比，采用QuEChERS凈化技術，可實現更好的基質凈化效果，操作簡便，提升了檢測效率。該方法對豬肉、豬肝和豬腎中賽庚啶和可樂定在1～50 μg/kg添加濃度范圍內，回收率分別為62%～112%和106%～121%，相對標準偏差均<10%，方法檢出限達到0.5 μg/kg，能夠滿足對豬可食組織豬肉、豬肝、豬腎中可樂定和賽庚啶殘留量的測定。

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(編輯：侯向輝)

Simulaneous Determination of Cyproheptadine and Clonidine in Pig Issues by QuEChERS and Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LI Dan-ni1, YAN Feng1, ZHOU Yue-rong1, SHEN Wei-qiang2, TAO Jun3, ZHANG Jing1(1.ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China；2．ShanghaiSongjiangAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201620,China；3.ShanghaiJiadingAgriculturalTechnologyExtensionServiceCenter，Shanghai201800,China)

A method has been developed for the simultaneous determination of the cyproheptadine and clonidine residuals in pig issues using QuEChERS method coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The drugs were extracted with sufficiently acidic acetonitrile. Anhydrous magnesium sulfate and anhydrous sodium chloride were used for the salting-out process. C18 powder was used for the clean-up process. The drugs were analyzed by UPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode via electrospray ionization. Cyproheptadine and clonidine were quantified by internal standard method. The calibration curves of the drugs were linear in the range of 0.5～100 ng/mL with the correlation coefficients more than 0.99. The LOD of cyproheptadine and clonidine in pig issues were 0.5 μg/kg. Add in the blank pig issues 1～50 μg/kg level, an average recovery of 62%～112% for cyproheptadine, and 106%～121% for clonidine with the relative standard deviation was <10%. The method is simple, rapid and high recovery and good reproducibility for quantitative and confirmatory analysis in cyproheptadine and clonidine residues.

cyproheptadine; clonidine; LC/MS/MS; pig issues

2016-08-26

A

1002-1280 (2017) 02-0029-06

S859.84

上海市科技興農重點攻關項目 [滬農科攻字(2014)第3-3號]；國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203023)

李丹妮，高級畜牧師，從事獸藥殘留檢測與方法開發(fā)。E-mail: yure@yeah.net