不同免疫程序?qū)ωi瘟活疫苗免疫效果的研究

衛(wèi)選智，張付華，王新平，歐陽紅生，郭昌明,*(.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 006；.九江市畜牧獸醫(yī)局，江西九江000；.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 006)

不同免疫程序?qū)ωi瘟活疫苗免疫效果的研究

衛(wèi)選智1，張付華2，王新平3，歐陽紅生1，郭昌明1,3*
(1.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130061；2.九江市畜牧獸醫(yī)局，江西九江332000；3.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130061)

為了解規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟疫苗免疫情況和豬瘟病毒感染情況，采用商業(yè)化ELISA試劑盒，對(duì)大慶市某規(guī)?；i場(chǎng)530份血清樣品分別進(jìn)行豬瘟抗體水平和豬瘟病毒抗原檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)過二次免疫的豬群，豬瘟抗體陽性率為95.0%(115/121)，比一次免疫的抗體陽性率66.1%(74/112)提高了28.9%，而且抗體水平整齊度較一次免疫顯著提高。在530份受檢豬只中，利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的豬瘟抗原，陽性檢出率為0%，表明該豬場(chǎng)豬瘟病毒感染風(fēng)險(xiǎn)較低，對(duì)18份可疑樣品用RT-PCR檢測(cè)，沒有檢測(cè)出豬瘟病毒。研究表明，對(duì)當(dāng)前的豬場(chǎng)僅僅實(shí)施一次免疫是不夠的，只有實(shí)施二次免疫，才能獲得較高的免疫抗體水平，有效地防控豬瘟疫病的發(fā)生。

豬瘟病毒;豬瘟病毒活疫苗;豬瘟抗原;豬瘟抗體;免疫程序

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種高度傳染性疫病，以急性、熱性以及高度接觸性為特征[1]。豬瘟曾在世界各國(guó)廣泛流行，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須通報(bào)A類傳染病[2-4]。在我國(guó)臨床診斷中，豬瘟的發(fā)生率平均可占門診總量的30%，有時(shí)可高達(dá)50%，是影響?zhàn)B豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。歷史上，豬瘟給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。1954年后，我國(guó)采用豬瘟活疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫接種，有效地控制了豬瘟的流行，但是目前仍有零星病例的發(fā)生[5]。近些年出現(xiàn)的非典型溫和型豬瘟與傳統(tǒng)豬瘟相比，在病原學(xué)、流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)諸多方面均發(fā)生變化，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和本病防控都帶來了諸多困難[5-6]。應(yīng)用ELISA方法定期對(duì)疫苗免疫豬群豬瘟抗體進(jìn)行檢測(cè)來評(píng)估豬瘟活疫苗對(duì)豬群免疫效果[7]，可為生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)證據(jù)，能有效地指導(dǎo)豬瘟的防控。

1 材 料

1.1 疫苗 豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)，批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥生字(2013)060131084，生產(chǎn)批號(hào)：201426，有效期二年，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用，由某生物股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)豬 來自黑龍江省大慶市某規(guī)?；i場(chǎng)。臨床健康仔豬在產(chǎn)房哺乳至25～35日齡斷奶，進(jìn)行第一次接種免疫，于頸后部肌肉注射豬瘟活疫苗每只2頭份/只。然后母豬轉(zhuǎn)到種母舍飼養(yǎng)，仔豬轉(zhuǎn)入保育舍，在育仔欄中飼養(yǎng)至70日齡，每個(gè)育仔欄飼養(yǎng)仔豬約30～40頭，在60～70日齡時(shí)進(jìn)行第二次免疫，免疫間隔期為35 d，于頸后部肌肉注射豬瘟活疫苗2頭份/只，然后轉(zhuǎn)入育肥舍。從 71日齡入舍分別在育肥舍飼養(yǎng)至180日齡出欄。初進(jìn)豬圈的豬可劃分15～20頭為一個(gè)單元，飼養(yǎng)后期可根據(jù)生長(zhǎng)情況逐漸分欄，每欄可飼養(yǎng)5～6頭至出欄。各組試驗(yàn)豬，在免疫分組前均精神狀態(tài)良好、飲食欲正常，抽查體溫?zé)o明顯升高，無明顯腹瀉、拉稀狀態(tài)。

1.3 血清樣品 來自上述試驗(yàn)豬，用一次性無菌采血器以無菌方式前腔靜脈采血，3000 r/min 離心10 min，取上清保存于無菌的1.5 mL離心管中，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。共收集有效血清530份。

1.4 試劑盒 豬瘟抗原ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)IDEXX公司, 批號(hào): C841)；豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)IDEXX公司, 批號(hào): D631)；豬瘟病毒通用型RT-PCR 檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CSF20150812P)，購(gòu)于北京世紀(jì)元享動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.5 主要儀器與試劑 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀M200 PRO，瑞士TECAN公司；37 ℃恒溫箱，10 μL、50 μL、200 μL及1000 μL的單道移液器，200 μL和300 μL的8道移液器，分析天平、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、DEPC處理的無菌1.5 mL離心管、吸頭及濕盒等，購(gòu)自長(zhǎng)春市美迪斯達(dá)醫(yī)療器械有限公司。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)A組：隨機(jī)選取臨床健康豬只145頭豬，分別于25～35日齡進(jìn)行豬瘟活疫苗的第一次免疫接種(簡(jiǎn)稱“一免(A1組)”)和60～70日齡，免疫間隔期為35 d，進(jìn)行豬瘟活疫苗第二次免疫接種(簡(jiǎn)稱“二免(A2組)”)，一、二次免疫均為每頭豬于頸后部肌肉注射豬瘟活疫苗2頭份；B、C、D組則為與A組不同時(shí)間同年內(nèi)不同批次的仔豬，免疫方法同上，每組150頭左右。A組采集一免后和二免后血清樣品，B、C、D組則采集二免后血清樣品，所有樣品均為免疫后第28天，以無菌方式前腔靜脈采血分離的血清進(jìn)行抗體水平檢測(cè)。

2.2 樣品檢測(cè)方法

2.2.1 血清中豬瘟抗體水平的ELISA檢測(cè)方法 按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定：以阻斷率為標(biāo)準(zhǔn)，阻斷率=(陰性對(duì)照孔平均OD值-樣品孔平均OD值)/陰性對(duì)照孔平均OD值×100%。若陰性對(duì)照均值>0.500且陽性對(duì)照的阻斷率>50%，則說明結(jié)果有效，可對(duì)樣品進(jìn)行判定；樣品阻斷率≥40%判定為陽性，即有CSFV抗體存在；樣品阻斷率≤30%判定為陰性，即無CSFV抗體存在；樣品阻斷率在30%～40%之間，判定為可疑。

2.2.2 血清中豬瘟抗原水平的ELISA檢測(cè)方法 按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定：陽性對(duì)照孔OD的平均值為P，陰性對(duì)照OD的平均值為N，樣品的OD平均值為S；僅當(dāng)P-N≥0.15且N≤0.25時(shí)說明結(jié)果有效，可對(duì)樣品進(jìn)行判定。S-N>0.300時(shí)，判為豬瘟病毒抗原陽性；S-N≤0.100時(shí)，判為豬瘟病毒抗原陰性；0.100

2.2.3 豬瘟病毒RT-PCR 檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]及試劑盒使用建議，對(duì)前述ELISA法檢測(cè)的豬瘟抗原中18份可疑血清樣品及隨機(jī)選取的3份檢測(cè)陰性樣品，選擇商品化試劑盒按其使用說明書進(jìn)行豬瘟病毒RT-PCR 檢測(cè)。

2.2.3.1 樣品采集與處理 對(duì)采集的每份樣品和陽性對(duì)照、陰性對(duì)照分別處理后，各取100 μL，置1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2.3.2 病毒RNA 的提取 取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入裂解液600 μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5 min。將液體吸入吸附柱中，13000 r/min離心30 s。棄去收集管中液體，加入600 μL 洗液，13000 r/min離心30 s。收集管中液體，加入600 μL 洗液，13000 r/min離心30 s。棄去收集管中液體，13000 r/min空柱離心2 min，以除去殘留的洗滌液。將吸附柱移入新的1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min，13000 r/min離心30 s，離心管中液體即為模板RNA。

2.2.3.3 RT-PCR 擴(kuò)增 每份總體積20 μL，含16.8 μL RT-PCR反應(yīng)液(用前混勻)，1.2 μL酶混合液，2 μL模板RNA。擴(kuò)增程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；循環(huán)：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共35 次；最后72 ℃延伸10 min。

2.2.3.4 電泳 2%瓊脂糖凝膠上樣電泳后觀察結(jié)果。

2.2.3.5 結(jié)果判定 陽性對(duì)照出現(xiàn)235 bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)235 bp擴(kuò)增帶為豬瘟病毒陽性，否則為陰性。

3 結(jié) 果

3.1 同一組豬一免和二免后血清抗體水平的比較 從A組145頭試驗(yàn)豬中采得有效血清112份，受檢豬只豬瘟抗體陽性檢出率為66.1%(74/112)，陰性為16.1%(18/112)，可疑為17.9%(20/112)；陽性抗體平均阻斷率為61.3%，集中在30%～80%之間相對(duì)均勻分布。二免后抗體陽性率為95.0%(115/121)，較一免提高了28.9%，一二免間抗體陽性率差異顯著(P≤0.01)；同時(shí)阻斷率平均值二免(76.6%±15.1%)較一免(61.3%±13.0%)也提高了15.3%；陰性率比例由16.1%(18/112)下降到了3.3%(4/121)；可疑樣品的平均阻斷率雖然變化不大，但比例由一免的17.9%(20/112)下降到二免的1.7%(4/112)，見表1和圖1。一免和二免抗體水平差異顯著(P≤0.01)。

表1 第一次和第二次免疫豬瘟抗體阻斷率分析

第一次免疫組為A1組，第二次免疫組為A2組

3.2 不同組豬二免后血清抗體水平的分析 為了進(jìn)一步分析第二次免疫后豬只血清的抗體水平，選擇了同年內(nèi)不同批次的飼養(yǎng)豬A2、B、C、D組共418份分血清樣品，進(jìn)行抗體水平的分析。其中檢出抗體陽性382份，占受檢豬只的91.4%(382/418)，符合國(guó)家農(nóng)業(yè)部要求的70%陽性標(biāo)準(zhǔn)；抗體阻斷率水平相對(duì)較高，主要分布在50%～100%之間，尤其是分布在60%～90%之間的樣品占總檢測(cè)樣品的56.7%(表2、圖2)。僅有16份樣品抗體水平為陰性，占受檢豬只的3.8%(16/418)；20份為可疑，占受檢豬只的4.8%(20/418)。

圖1 第一次和第二次免疫豬瘟抗體阻斷率分析

表2 不同組二次免疫后各組豬瘟抗體水平分析

A2組為A組試驗(yàn)豬第二次免疫血清樣品

圖2 二免后阻斷率區(qū)間分布

3.3 豬瘟病毒抗原檢測(cè)結(jié)果 在530份受檢豬只中，血清中豬瘟抗原陽性檢出率為0，可疑檢出率為3.4%(18/530)，陰性檢出率為96.60%(512/530)，表明該豬場(chǎng)豬瘟病毒感染風(fēng)險(xiǎn)較低(表3)。對(duì)抗原檢測(cè)結(jié)果為可疑的18份樣品及隨機(jī)選擇的3份檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品采用RT-PCR方進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，21份樣品均為陰性。對(duì)抗原檢測(cè)為可疑的樣品進(jìn)行分析，抗體阻斷率集中在30%～40%和40%～90%兩個(gè)區(qū)間范圍內(nèi)(圖3、表4)。

表3 豬血清樣品豬瘟抗原水平統(tǒng)計(jì)

1-18：ELISA檢測(cè)可疑樣品；19-21:ELISA檢測(cè)陰性樣品；M：DNA MarkerDL2000；“-”：陰性對(duì)照；“+”：陽性對(duì)照?qǐng)D3 豬血清CSFV RT-PCR結(jié)果

表4 豬瘟抗原檢測(cè)為可疑的18份血清樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

+ 陽性；- 陰性；± 可疑，其中1-18號(hào)為ELISA抗原檢測(cè)可疑樣品；19-21號(hào)為ELISA抗原檢測(cè)陰性對(duì)照樣品

圖4 阻斷ELISA法豬瘟病毒抗原檢測(cè)可疑樣品豬瘟抗體阻斷率分布

4 小結(jié)與討論

本研究利用了市場(chǎng)上使用較多的ELISA試劑盒，通過采集某規(guī)?；i場(chǎng)同年內(nèi)不同時(shí)間、不同批次的豬只血清樣品，研究豬瘟活疫苗一免和二免對(duì)血清抗體水平的影響，以對(duì)當(dāng)前豬瘟活疫苗的免疫程序進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)中共檢測(cè)血清樣品530份，其中A1組112份與A2組121份的血清抗體檢測(cè)結(jié)果比較表明，二免后血清抗體的陽性率(95.0%)較一免后血清抗體的陽性率(66.1%)提高了28.9%，抗體平均阻斷率二免(76.6%±15.1%)較一免(61.3%±13.0%)也提高了15.3%。表明只有一次免疫豬只抗體水平相對(duì)較低，未達(dá)到農(nóng)業(yè)部《2013 年國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》中規(guī)定的抗體合格率在70%以上的要求[10]，而二次免疫后與一次免疫相比，免疫效果有了顯著的提高(P≤0.01,差異極顯著)。隨后對(duì)同年內(nèi)不同批次的A2、B、C、D四組豬只二免后的血清進(jìn)行了檢測(cè)，在418份試驗(yàn)樣品中，91.4%的血清樣本(382/418)檢出豬瘟抗體陽性，免疫陽性率水平遠(yuǎn)高于農(nóng)業(yè)部《2013年國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》規(guī)定的抗體合格率在70%以上的要求[10]，而且抗體阻斷率集中在60%～90%之間的占總檢測(cè)樣品的56.7%，表明有很高的抗體整齊度。在RT-PCR試驗(yàn)的所有樣品中均未檢測(cè)到抗原陽性的樣品，也說明該豬場(chǎng)豬瘟病毒感染率為0%，豬瘟疾病控制水平比較穩(wěn)定。以上分析與王娟萍等[11]曾根據(jù)ELISA方法對(duì)規(guī)模化豬場(chǎng)的豬瘟疫苗免疫效果評(píng)估的結(jié)論相一致。

本次研究表明，對(duì)當(dāng)前的豬場(chǎng)僅僅實(shí)施一次免疫是不夠的，只有實(shí)施二次免疫，才能使豬瘟活疫苗免疫豬群獲得較高和整齊的免疫抗體水平，有效地防控豬瘟疫病的發(fā)生。

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(編輯：李文平)

Research about Different Immunization Procedures on the Immune Effect of CSFV Live Vaccine

WEI Xuan-zhi1, ZHANG Fu-hua2, WANG Xin-ping3，OUYANG Hong-sheng1，GUO Chang-ming1，3*
(1.CollegeofAnimalScience，JilinUniversity，Changchun130061，China；2.JiujiangAnimalHusbandryandVeterinaryBureau，Jiujiang，Jiangxi332000，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun130061，China)

To get better understanding of the immunization and infection status of CSFV，a total of 530 serum samples from a industrialized pig farm were collected，and ELISA method was used to detect carry out the CSFV antibody and antigen serology survey，respectively. The result showed that the positive rate of CSFV antibody after twice inoculation reached 95.0%(115/121)，which was 28.9% higher than it after the first inoculation. And high uniformity was found in twice inoculation than in one inoculation. No positive serum for CSFV antigen were detected (0/530)，indicating that the risk of CSFV remained low in this farm. Eighteen ambiguous samples were also analyzed，and no CSFV antigen was found by RT-PCR. The result indicated that one time of vaccination is not sufficient，and only the implementation of twice inoculation induced higher titre antibodies，which could effectively prevent and control the occurrence of swine plague.

CSFV；CSFV live vaccine; CSFV antigen; CSFV antibody; immune procedure

衛(wèi)選智，在讀碩士，從事豬病毒與宿主相互作用研究。

郭昌明。E-mail:guochm1980@163.com

2017-01-03

A

1002-1280 (2017) 02-0007-06

S852.651