基于痛性相關(guān)神經(jīng)肽CGRP、SP及其受體NK-1探討腧穴電針防治急性發(fā)作期偏頭痛機制*

唐美霞 杜若桑 耿俊龍 沈詩彥 崔 海 郭彩霞 鄭淑美

（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

·研究報告·

基于痛性相關(guān)神經(jīng)肽CGRP、SP及其受體NK-1探討腧穴電針防治急性發(fā)作期偏頭痛機制*

唐美霞 杜若桑 耿俊龍 沈詩彥 崔 海 郭彩霞 鄭淑美△

（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

目的 觀察腧穴電針對發(fā)作期偏頭痛大鼠中腦P物質(zhì)（SP）、神經(jīng)激肽（NK-1）的分布與表達，及血漿降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）濃度的影響，探討腧穴電針防治發(fā)作期偏頭痛相關(guān)機制的可行性依據(jù)。方法（250±50）g健康Wistar雄性大鼠40只，按隨機數(shù)字表法分4組：空白對照組（A），模型對照組（B），模型+腧穴電針組（C），模型+偽電針組（D），每組10只。A組皮下注射0.9%氯化鈉注射液；B組皮下注射硝酸甘油制備偏頭痛大鼠模型；C、D組電針干預(yù)7 d后，皮下注射硝酸甘油制備偏頭痛大鼠模型，造模成功后30 min，對兩組進行相應(yīng)的電針干預(yù)治療。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定血漿中CGRP的含量及免疫組化檢測中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)SP、NK-1陽性細胞數(shù)。結(jié)果 CGRP、SP結(jié)果顯示：B組、D組均明顯高于A組、C組 （P＜0.05）；且A組與C組，B組與D組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。NK-1結(jié)果顯示：B、C、D組均明顯高于A組（P＜0.05），B、C、D組各組間有下降趨勢，但均無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論 腧穴電針通過下調(diào)發(fā)作期偏頭痛大鼠痛性相關(guān)神經(jīng)肽CGRP、SP表達量，發(fā)揮防治偏頭痛的作用。

電針 偏頭痛 CGRP SP NK-1

偏頭痛是一種常見致殘性神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］。近年，大量電針臨床應(yīng)用觀察發(fā)現(xiàn)電針能有效地預(yù)防治療急性發(fā)作期偏頭痛，減輕其疼痛程度及復(fù)發(fā)次數(shù)，且成本低、安全性高，但其作用機制尚不清楚［2］。隨著研究不斷精細化發(fā)展，大量實驗研究已表明偏頭痛發(fā)作與痛性神經(jīng)相關(guān)肽關(guān)系密切［3-4］。其中尤以痛性神經(jīng)相關(guān)肽P物質(zhì)（SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）作用越來越引起人們的關(guān)注。大量實驗研究顯示，CGRP作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，引起顱內(nèi)外血管擴張，神經(jīng)源性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致偏頭痛［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)CGRP、SP及其神經(jīng)激肽受體（NK-1）含量的變化，可引起偏頭痛發(fā)作［7］。本實驗以痛性相關(guān)神經(jīng)肽CGRP、SP及其受體NK-1為基礎(chǔ)，通過動物實驗探討電針是否通過調(diào)節(jié)CGRP、SP及其受體NK-1達到防治偏頭痛療效?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級雄性Wistar大鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量（250±50）g，購于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部（許可證AEEI-2015-077）。

1.2 分組與造模 按隨機數(shù)字表法分為空白對照組（A），模型對照組（B），模型+腧穴電針組（C），模型+偽電針組（D）4組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。除A組外，其余各組均參照文獻［10］偏頭痛大鼠模型備制方法，采用皮下注射硝酸甘油10 mg/kg（1 mL∶5 mg），復(fù)制其模型。A組皮下注射等體積0.9%氯化鈉注射液（2 mL/kg）。觀察造模后的行為學(xué)癥狀并記錄，以出現(xiàn)往返運動、撓頭、爬籠、咬尾次數(shù)增多，認為偏頭痛模型造模成功。

1.3 試劑與儀器 硝酸甘油 （北京益民藥業(yè)有限公司，20150702，規(guī)格1 mL∶5 mg）；降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）ELISA試劑盒 （美國Cloud-Clone Corp公司，CEA876Ra 96T Tests）；SP抗體 （博奧森，bs-0065R）；NK-1抗體（博奧森，bs-0064R）；二抗試劑盒（北京中杉金橋公司，PV-9001）；DAB染色液（北京中杉金橋公司，ZLI-9018）；一次性無菌針（中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，2140080）；華佗牌電針儀（中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，G-6805-2）；光學(xué)顯微鏡（北京銳馳恒業(yè)儀器有限公司，CX23）；Eclipse生物顯微鏡（Nikon，NIS-ElementsBasic Research圖像采集分析系統(tǒng)）；多功能酶標(biāo)儀 （美國Molecular Devices公司，SpectraMax M5）等。

1.4 干預(yù)方法 A、B組不做任何處理，正常飼養(yǎng)7 d；C、D組分別行腧穴電針與偽電針防治7 d，第8天兩組于造模成功后30 min，行電針干預(yù)治療，留針20 min。腧穴電針組參照針灸臨床治療偏頭痛經(jīng)驗穴，選取太陽、風(fēng)池為主穴；再根據(jù)針灸遠近配穴法選取太沖、足臨泣為配穴；本實驗沿用楊旭光等［8］、唐美霞等［9］實驗選擇4個非穴位點作為偽電針針刺點，非穴位點1：臂內(nèi)前緣三角肌與肱二頭肌交界處。非穴位點2：肱骨內(nèi)上髁與尺骨腕部的中點，尺側(cè)緣。非穴位點3：足三里水平旁開非穴位點，脛骨外側(cè)緣處。非穴位點4：肘內(nèi)側(cè)，肘尖與腋窩連線中點。腧穴電針組與偽電針組均依據(jù)華興邦等［9］制作的大鼠穴位圖譜進行定位。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 于第8天造模4 h后，麻醉后，打開胸腔，暴露心臟，取心尖血5～10 mL于抗凝劑為10%EDTA-Na2的采血管中，離心（4℃，3000 r/min，10 min），分離血漿，于低溫冰箱中-20℃儲存?zhèn)溆?。取血后，用剪刀剪開右心耳，從左心室插管用生理鹽水進行灌流，之后緩慢注入10%的甲醛100 mL固定，斷頭取腦。將完整的鼠腦放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水透明，低溫石蠟包埋切片。采用ELISA方法，按試劑盒說明要求，測定血漿CGRP濃度；采用免疫組織化學(xué)染色法，測定中腦切片SP、NK-1的陽性表達及分布。1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示；各組間差異性比較采用One-way ANOVA分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電針對偏頭痛大鼠血漿CGRP濃度的影響 見表1。如表示，與A組比較，B、D血漿CGRP濃度均明顯升高（P＜0.05），C組有降低趨勢（P＞0.05）；與B組比較，C組濃度明顯降低（P＜0.05），D組濃度有降低趨勢（P＞0.05）；與D組相比較，C組濃度明顯降低（P＜0.05）。提示腧穴電針能顯著降低急性發(fā)作期偏頭痛大鼠血漿中CGRP濃度，其療效明顯優(yōu)于偽電針治療。

表1 各組大鼠血漿CGRP濃度比較（±s）

表1 各組大鼠血漿CGRP濃度比較（±s）

與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05。下同。

組別 n 血漿CGRP A組 10 B組 10 C組 10 2.011±0.249 2.468±0.301*2.001±0.051△▲D組 102.449±0.052*

2.2 各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)SP及其受體NK-1陽性細胞數(shù) 見表2。SP陽性細胞數(shù)表達：與A組比較，B組、D組血漿CGRP濃度均明顯升高 （P＜0.05），C組有降低趨勢（P＞0.05）；與B組比較，C組濃度明顯降低 （P＜0.05），D組濃度有降低趨勢 （P＞0.05）；與D組相比較，C組濃度明顯降低 （P＜0.05）。NK-1陽性細胞數(shù)表達：與A組比較，B、C、D組均明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B、C、D 3組間各自比較均無明顯差異（P＞0.05）。提示，腧穴電針能顯著降低急性發(fā)作期偏頭痛大鼠中腦SP的陽性分布及表達，其療效明顯優(yōu)于偽電針治療；對于NK-1陽性表達及分布的影響有降低趨勢，但無明顯變化。

表2 各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)SP及其受體NK-1陽性細胞數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)SP及其受體NK-1陽性細胞數(shù)比較（±s）

組別 n SP NK-1 A組 10 B組 10 C組 10 1972.5±1076.6 1566±825.1 5318.6±2373.2*3060.8±494.6*3751.4±1430.4△▲2522.8±465.5*D組 101972.5±1076.6*2663.1±579.8*

3 討 論

偏頭痛的發(fā)病機制尚未明確，其主流三叉神經(jīng)血管學(xué)說逐漸成為大多學(xué)者的研究點。研究發(fā)現(xiàn)其疼痛機制多與血管神經(jīng)肽類物質(zhì)關(guān)系密切，且三叉神經(jīng)血管受到刺激后，可引起CGRP、SP及其他神經(jīng)肽釋放增加，尤以CGRP、SP作用最顯著［11］。CGRP是內(nèi)源性舒血管神經(jīng)肽，在三叉神經(jīng)-腦血管系統(tǒng)內(nèi)濃度較高，與脊髓水平的痛覺形成，疼痛刺激可引起脊髓背角神經(jīng)元興奮，傳遞痛覺信息，參生致痛作用［12］。研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛患者發(fā)作時，其血漿中的CGRP明顯升高，CGRP拮抗劑治療后疼痛程度得到緩解，檢測血中CGRP降低至正常水平［13］。SP主要分布于中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)，通過NK受體介導(dǎo)傳遞，主要有NK-1、NK-2、NK-3 3種，SP與其受體結(jié)合無特異選擇性，其中與NK-1結(jié)合能力最強［14］。SP是第一級傷害性神經(jīng)遞質(zhì)，通過其受體參與痛覺傳遞，與疼痛產(chǎn)生密切相關(guān)［15］。本實驗研究表明，偏頭痛大鼠血中CGRP含量明顯增高，說明偏頭痛發(fā)作與CGRP含量變化密切相關(guān)；偏頭痛大鼠中腦組織內(nèi)SP、NK-1陽性表達明顯增多，說明偏頭痛與SP、NK-1陽性表達關(guān)系密切。因此，測定CGRP濃度變化及SP陽性表達，對研究電針治療偏頭痛機制有重要意義。

針灸治療偏頭痛的療效得到了國內(nèi)、外廣大學(xué)者的認可。而電針結(jié)合了傳統(tǒng)針刺與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的新治療方法，在疾病治療方面也得到了中外大多數(shù)學(xué)者的認同，尤以對偏頭痛的治療效果顯著，以經(jīng)濟成本低、無副作用、對人體損傷性較小的優(yōu)勢，占據(jù)偏頭痛患者治療的臨床治療重要位置［16］。本實驗選取風(fēng)池、太陽、太沖、足臨泣為治療偏頭痛經(jīng)驗穴，通過疏泄肝膽、通經(jīng)止痛、祛風(fēng)等治法達到疏通腦絡(luò)，緩解疼痛。已有研究表明電針可通過影響神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)的釋放［17］，對偏頭痛有積極防治作用［18］。本實驗中，腧穴電針組與模型組相比較，其血漿中CGRP含量及大鼠中腦組織內(nèi)SP表達量均顯著降低，提示電針可通過下調(diào)CGRP及SP表達來實現(xiàn)對急性發(fā)作偏頭痛防治作用。

本實驗以痛性神經(jīng)相關(guān)肽CGRP、SP及其受體作為偏頭痛研究點，從蛋白水平及基因水平對電針治療偏頭痛機制進行探究。結(jié)果表明，偏頭痛大鼠痛性神經(jīng)相關(guān)肽CGRP濃度升高及SP、NK-1陽性表達增多，而電針治療后CGRP、SP均降低，NK-1在基因水平明顯降低，但在蛋白水平有降低趨勢，無明顯變化，說明電針對急性發(fā)作期偏頭痛的防治作用可通過下調(diào)痛性神經(jīng)相關(guān)肽CGRP、SP實現(xiàn)。但電針下調(diào)SP陽性表達是否通過NK-1受體介導(dǎo)及不同時期的NK-1的表達在偏頭痛過程中的作用，尚需進一步研究。

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Exploration on Application of Neuropeptides CGRP，SP and Receptor Neurokinin-1 to Explain the Mech-anism of Acupoint Electroacupuncture for Acute Migraine in Rats

TANG Meixia，DU Ruosang，GENG Junlong，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

Objective：To observe the effect of electroacupuncture（EA）on the expression of substance P（SP）and its receptor Neurokinin-1 in the Mesencephalon and plasma concentrations of CGRP in rats with acute migraine.Methods：40 adult male Wistar rats （250±50）g were equally randomized into 4 groups：the control group（group A），the model group（group B），acupoints electroacupuncture group（group C），and non-acupoints electroacupuncture group（group D）.In group A，rats were injected with isotonic saline.In group B，rats were injected subcutaneously with 10 mg/kg nitroglycerin to set up the model of migraine.The group C and D were treated by EA for seven days，then using nitroglycerin method to replicate experimental rat model with migraine，using EA treating these rats after modeled for 30 min.The expression of CGRP was detected with ELISA；SP and receptor Neurokinin-1（NK-1）were analyzed by immunohistochemical staining.Results：The expression of CGRP and SP in group B and D were higher than that in group A and C；there were statistically significant difference（0.05），while no significant difference was found between groups A and C，B and D（P＞0.05）.The expression of NK-1 increased in groups B，C and D，compared with the group A（P＜0.05），but there was no statistical difference between group B and C and D（P＞0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can efficiently prevent and treat acute migraine headache by down-regulating expression level of neuropeptides CGRP and SP.

Acupoint electroacupuncture；Migraine；CGRP；Substance P；NK-1

R245.9+7

A

1004-745X（2017）02-0216-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.009

2016-10-18）

首都中醫(yī)藥研究專項（15ZY21）

△通信作者（電子郵箱：shumei79@126.com）