楊梅素體外作用于人肝癌HepG—2細(xì)胞的研究

黃清玲++李宏偉

摘 要：目的：主要考察研究楊梅素（Myricetin）對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG-2增殖的影響。 方法：主要通過(guò)MTT比色法，觀察24 h，48 h，72 h不同濃度楊梅素作用HepG-2后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，確定最佳作用時(shí)間；通過(guò)MTT、SRB法觀察楊梅素作用于人肝癌HepG-2細(xì)胞72h后的影響，考察楊梅素對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：人肝癌細(xì)胞HepG-2經(jīng)楊梅素處理作用72h的生長(zhǎng)抑制最明顯，并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴(lài)效應(yīng)，其IC50值為207.99 μmol·L-1。GI50，TGI，LG50分別為146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。結(jié)論：結(jié)果表明楊梅素可抑制HepG-2細(xì)胞增殖，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：楊梅素；人肝癌細(xì)胞HepG-2；MTT；SRB

楊梅素（myricetin.Myr），是一種黃酮類(lèi)化合物，有報(bào)道表明楊梅素具有降低神經(jīng)毒性，影響淋巴細(xì)胞活化及增殖，拮抗血小板活化因子（PAF），降血糖，抗氧化和保肝護(hù)肝等多種生物學(xué)功能。Ching-Huai Ko等[1]人研究表明楊梅素對(duì)結(jié)腸直腸癌中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP）的表達(dá)和活性有抑制作用，通過(guò)影響蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化和c-Jun的表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞凋亡。對(duì)胰腺癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑PI3K/ATK有阻滯作用[2-4]。以上資料證明楊梅素是一種有效的致癌作用化學(xué)防治劑。本文以HepG-2細(xì)胞系為研究對(duì)象，利用SRB法和MTT比色法對(duì)供試藥物楊梅素行體外抑制活性考察，并用SPSS15.0對(duì)兩種篩選方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異性分析。以期探明抗楊梅素體外篩選中SRB法和MTT比色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相互驗(yàn)證作用，實(shí)現(xiàn)楊梅素體外篩選結(jié)果的準(zhǔn)確可靠[5-6]。

1.實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞（HepG-2）由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研工作站傳代保種。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞在含5%CO2的37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，每周傳代兩次。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1.MTT法測(cè)定楊梅素對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)步驟：

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后配制成濃度為5×104細(xì)胞/ml的細(xì)胞液；按5000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加100 μl，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h；次日加入含不同濃度藥物及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100 μl（DMSO終濃度<0.5%），每藥設(shè)6個(gè)劑量組，阿霉素（ADM）17 μmol·L-1作為陽(yáng)性對(duì)照組，每組6個(gè)平行孔。置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72h。棄上清，用培養(yǎng)液洗3次，以去除藥液。每孔加100 μl新鮮配制的含0.5 mg/ml MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄培養(yǎng)上清，每孔加200 μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻。用MK3型酶標(biāo)儀在參考波長(zhǎng)490 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm條件下測(cè)定光密度值（OD），以溶劑對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，用下面公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算IC50：

1.2.2.SRB法測(cè)定楊梅素對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的影響

基本原理：

Suforhodamine B（SRB）是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合，其顏色變化與活細(xì)胞蛋白呈正比。同時(shí)，其在515nm的OD值與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系，故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。

實(shí)驗(yàn)步驟：

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后配制成濃度為2×104細(xì)胞/ml的細(xì)胞液，按1000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加100 μl。培養(yǎng)24小時(shí)后加入待測(cè)藥物，同時(shí)測(cè)定此時(shí)細(xì)胞的OD515值（T0）。加藥72小時(shí)后進(jìn)行測(cè)定：每孔加預(yù)冷的50%三氯乙酸（TCA）液50 μl固定（TCA終濃度10%），靜置5分鐘，將96孔板移至4℃放置1小時(shí)；倒掉固定液，去離子水洗5遍，空氣干燥后，每孔加SRB液100 μl（用1%醋酸配成4mg/ml溶液），室溫放置10分鐘；1%醋酸洗5遍，空氣干燥后，加150 μl 10mmol/L非緩沖Tris堿液（pH10.5）溶解，穩(wěn)定10 min后測(cè)定OD515 nm值。按中效方程計(jì)算細(xì)胞50%生長(zhǎng)抑制所需的藥物濃度（GI50）；細(xì)胞完全生長(zhǎng)抑制所需的濃度（TGI）；殺死50%細(xì)胞所需藥物濃度（LC50）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K法。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果與討論

2.1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物（formazan）并沉積于細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在560 nm波長(zhǎng)處光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。用MTT法觀察了楊梅素對(duì)體外培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠看出人肝癌細(xì)胞HepG-2經(jīng)楊梅素處理24 h，48 h，72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，隨著給藥時(shí)間和給藥劑量的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸增大，72 h作用最明顯。說(shuō)明楊梅素對(duì)HepG-2細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并且具有良好的時(shí)間劑量依賴(lài)關(guān)系。各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。其IC50值為207.99 μmol·L-1。

2.2.SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)SRB法檢測(cè)，不同濃度楊梅素作用細(xì)胞72h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴(lài)效應(yīng)，各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。GI50，TGI，LG50分別為146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。

3.結(jié)論

3.1.MTT法結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)楊梅素處理24 h，48 h，72 h的人肝癌細(xì)胞HepG-2生長(zhǎng)受到抑制，隨著給藥時(shí)間和藥物濃度增加，抑制率均有升高的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)比較，人肝癌細(xì)胞HepG-2經(jīng)楊梅素處理作用72 h的生長(zhǎng)抑制最明顯，因此，將人肝癌細(xì)胞HepG-2作用時(shí)間定為72 h。

3.2.MTT法觀察了楊梅素對(duì)體外培養(yǎng)的HepG-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度楊梅素作用細(xì)胞72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴(lài)效應(yīng)，各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。其IC50值為207.99 μmol·L-1。

3.3.SRB法結(jié)果表明不同濃度楊梅素作用細(xì)胞72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，并且濃度與抑制率間呈現(xiàn)明顯的依賴(lài)效應(yīng)，各處理組間比較皆有顯著性差異（P<0.01）。GI50，TGI，LG50分別為146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。

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