小麥品種抗病相關分子標記檢測研究

彭振英++崔海燕++李娜娜++張斌++丁漢鳳

摘要：利用分子標記選育抗病小麥新品種已經成為一種快速有效的育種方法。本研究用29對抗病分子標記對354個小麥品種進行檢測，分析這些標記在小麥品種中的分布情況。結果顯示，檢測到多個小麥品種同時含有多個標記，如黑麥AR132同時含有抗白粉病、葉銹病、紋枯病標記；淮麥0607、SN086218、石新733、徐30、濰74987、周麥28、中麥1219、連05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同時含有抗白粉病、葉銹病、赤霉病標記。本研究為小麥聚合育種提供了一定依據(jù)。

關鍵詞：小麥；抗病性；分子標記檢測；分子標記輔助育種；聚合育種

中圖分類號：S512.103.53文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0001-09

DNA 分子標記技術產生于20世紀70年代，是一種理想的、基于DNA 變異的新型遺傳標記，它能反映生物個體或種群基因組中的差異特征[1]。分子標記突破了表達基因的范圍而不受基因表達的影響，可在任何組織、任何發(fā)育階段進行檢測。DNA 分子標記的開發(fā)和應用為建立分子標記輔助選擇的農作物育種體系打開一扇新大門。目前，分子標記輔助育種技術（marker-assisted selection，MAS）在作物遺傳育種上的應用越來越廣泛，分子標記聚合育種得到很大發(fā)展，尤其是分子標記技術與常規(guī)育種的緊密結合，為作物育種技術帶來一場新的變革。

小麥是我國重要的糧食作物，利用MAS選育高抗小麥品種也已如火如荼地開展起來。到目前為止，已經發(fā)現(xiàn)了58個小麥抗白粉病基因[2，3]、90個抗葉銹病基因[4]、100多個抗條銹病基因[5]、52個赤霉病抗性相關QTL[6]、15個抗紋枯病分子標記[7]、1個抗黃矮病基因Bdv2[8]。董建力等[9]通過聚合雜交將3個小麥抗白粉病標記Pm4b、Pm13和Pm21聚合在一起，從F3代群體中篩選出同時含有2～3個標記的株系。王心宇等[10]采用早代進行抗性鑒定結合MAS策略，篩選到14株Pm4a+Pm21的植株，16株Pm2+Pm4a的植株，6株Pm8+Pm21的植株，其后代的抗病性明顯提高。曾祥艷等[11]利用MAS選育出兼抗黃矮病、白粉病和條銹病的小麥新種質。這些研究為培育持久、廣譜抗病小麥品種奠定了基礎。

然而迄今為止，研究者們對中國小麥品種遺傳背景的了解仍不全面，每個小麥品種中含有多少個抗性分子標記，至今未做大規(guī)模系統(tǒng)調查。本研究檢測了354份常規(guī)小麥品種的抗病相關分子標記，旨在為抗性小麥品種選育提供一定參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

本實驗室共計保存近600份小麥品種資源，選取其中的354份常規(guī)小麥品種進行抗病相關分子標記檢測。

1.2試驗方法

1.2.1取材每個小麥品種隨機取10粒種子進行萌發(fā)，萌發(fā)10天時，每株取頂葉混合研磨用于提取基因組DNA。

1.2.2基因組DNA提取采用CTAB法提取各材料基因組DNA[12]。用核酸儀測定DNA濃度，并稀釋到50～60 ng/μL用于PCR擴增。

1.2.3引物合成根據(jù)文獻報道的小麥抗病基因引物序列（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成。

1.2.4PCR擴增PCR反應體系：總體積20.0 μL，其中含有2×PCR Mix（百泰克）10.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。

PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1.0 min，退火0.5 min（退火溫度根據(jù)各引物退火溫度而定），72℃延伸0.5～1.0 min（根據(jù)各引物擴增片段長度而定），共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴增產物用相應濃度聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，紫外凝膠成像儀觀察、拍照。

2結果與分析

2.1抗白粉病分子標記檢測結果

利用13對抗白粉病分子標記對354個小麥品種進行檢測，結果如表2所示。其中引物Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR（圖1A）、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R、Xgwm337F/Xgwm337R檢測的小麥品種較多，其檢出數(shù)量分別占所檢品種總數(shù)的51.1%、50.3%、40.7%、40.7%。并且這些標記之間具有一定的關聯(lián)，83個小麥品種均同時含有這四個標記；142個品種同時含有標記Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、Xgwm337F/Xgwm337R；99個品種同時含有標記Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR、Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR、LAG95+1F/LAG95+2R；177個品種同時含有標記Xcfd81-5DF/Xcfd81-5DR和Xgwm159-5BF/Xgwm159-5BR。

Pm4bF/Pm4bR能夠在38個小麥品種中擴增出目的條帶（475 bp）（圖1B），占所有檢查品種的10.7%。C1F/R1R能夠在44個小麥品種中檢測出目的條帶（470 bp）（圖1C），占所有檢查品種的 12.4%。BCD135-1F/BCD135-1R、BCD135-2F/BCD135-2R二對引物未在任何品種中檢測出目的條帶。

3討論與結論

隨著分子生物學的發(fā)展，利用MAS將是未來抗性小麥品種培育的方向。因此全面了解各個小麥品種至少是小麥核心種質分子水平的遺傳背景是必不可少的，因為只有這樣才能做到有的放矢地配制多種雜交組合，將多個抗性基因聚合到一起，培育多抗小麥品種。但是目前國內有關這方面的研究報道還不多。本研究用13對抗白粉病分子標記、7對抗葉銹病分子標記、2對抗條銹病分子標記、4對抗赤霉病分子標記、2對抗紋枯病分子標記、1對抗黃矮病分子標記對354個小麥品種的抗性背景在分子層面進行檢測，檢測到多個小麥品種同時含有多個標記，如黑麥AR132同時含有抗白粉病、葉銹病、紋枯病基因；淮麥0607、SN086218、石新733、徐30、濰74987、周麥28、中麥1219、連05167、淮05155、Jagger、CP02-62-1-2-2-2-1、中育01089同時含有抗白粉病、葉銹病、赤霉病基因。

孫果忠[43]用Pm4a/bF/Pm4a/bR檢測了75個小麥品種，其中4個品種含有此標記，占5%。本試驗檢出4%的小麥品種含有此標記，二者基本相符。胡娜[44]用Pm2、Pm4、Pm13、Pm21、Pm30、Pm34分子標記對260份小麥育種親本材料進行多態(tài)性檢測，其中149份材料含有Pm2單基因（占57.31%），這與本研究結論相符（51.1%），可見Pm2標記在小麥中廣泛存在。魏新燕等[36]對150個小麥品種的抗葉銹基因Lr35進行分子檢測，檢測出 8 個小麥品種（6068、白蚰包、中麥9、早洋、碧瑪1號、小偃7631、東方紅3號和 Madsen）含有Lr35標記，檢出率較低，本研究在354個小麥品種中僅檢出周麥20含有該標記，檢出率也相當?shù)汀?/p>

利用分子標記選育小麥新品種具有諸多優(yōu)勢，但是隨著時間的推移，一些生理小種出現(xiàn)了變異導致部分標記失效。孫果忠[43]對101個分子標記的實用性進行了評價，發(fā)現(xiàn)可用于MAS的標記有51個，占供試標記的50.5%，此類標記可直接用于MAS育種；28個標記喪失了有效性，不能再用于MAS育種。雷秀玉[45]對145個主推小麥品種進行了苗期白粉病抗性鑒定以及小麥抗白粉病基因分子標記的實用性評價，結果表明，Pm8基因在145個供試品種（系）中的分布頻率為52.4%，但對白粉病菌群體已喪失抗性；Pm2、Pm4、Pm6、Pm12、Pm13、Pm16、Pm17、Pm21和Pm24基因對白粉病菌群體抗性好，但在145個供試品種中的分布頻率較低，介于0～9.7%。研究表明，將多個抗病基因聚合在一起可以顯著提高品種抗病性。董建力等[9]通過復合雜交將抗小麥白粉病基因Pm4b、Pm13、Pm21聚合到推廣品種。王心宇發(fā)現(xiàn)聚合Pm2+Pm4a、Pm4a+Pm21、Pm8+Pm21的后代植株抗性增強[10]。全面系統(tǒng)地調查不同小麥品種中含有的抗病分子標記，對于小麥聚合育種具有重大意義。

參考文獻：

[1]周延清. DNA 分子標記技術在植物研究中的應用[M]. 北京：化學工業(yè)出版社， 2005：61-87.

[2]宋偉. 分子標記輔助選擇小麥抗白粉病兼抗赤霉病聚合體[D]. 雅安：四川農業(yè)大學， 2010.

[3]王心宇. 分子標記技術在小麥抗白粉病育種及指紋圖譜分析中的應用研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學，2000.

[4]周悅. 中國小麥品種中抗葉銹病基因的基因定位和等位檢測[D]. 保定：河北農業(yè)大學，2012.

[5]路妍. 三個小麥種質抗條銹病基因的遺傳分析和HTAP抗病性基因Yr62的分子作圖[D]. 楊凌：西北農林科技大學， 2014.

[6]Buerstmayr H， Ban T， Anderson J A. QTL mapping and marker-assisted selection for Fusarium head blight resistance in wheat： a review[J]. Plant Breeding， 2009， 28（1）：1-26.

[7]姚金保， 姚國才， 楊學明， 等. 中國小麥抗紋枯病育種研究進展[J]. 江蘇農業(yè)學報， 2007， 23（3）：248-251.

[8]高蘭英. 小麥外源抗黃矮病基因Bdv2的標記開發(fā)及對突變體的鑒定[D]. 呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學， 2009.

[9]董建力， 張增艷， 王敬東， 等. 3 種小麥抗白粉病基因聚合體的 STS 和 SCAR 標記[J]. 西北農業(yè)學報， 2007， 16（3）： 64-67.

[10]王心宇， 陳佩度， 張守忠. 小麥白粉病抗性基因的聚合及其分子標記輔助選擇[J]. 遺傳學報， 2001， 28（7）：640-646.

[11]曾祥艷， 張增艷， 杜麗璞， 等. 分子標記輔助選育兼抗白粉病、條銹病、黃矮病小麥新種質[J].中國農業(yè)科學， 2005， 38（12）：2380-2386.

[12]王敏， 那冬晨， 姬虎太， 等. 快速小量提取小麥葉片DNA的一種簡易方法[J]. 農業(yè)科學與技術（英文版），2009， 37（5）：34-35.

[13]Qiu Y C， Sun X L， Zhou R H， et al. Identification of microsatellite markers linked to powdery mildew resistance gene Pm2 in wheat[J]. Cereal Rersearch Communications， 2006， 34（6）：1267-1273.

[14]陳松柏， 蔡林， 周采平， 等. 小麥抗白粉病基因Pm4的STS標記[J]. 西南農業(yè)大學學報， 2002， 24（3）：231-234.

[15]Ma Z Q， Wei J B， Cheng S H. PCR-based markers for the powdery mildew resistance gene Pm4a in wheat[J]. TAG， 2004， 109：140-145.

[16]Ji J H， Qin B， Wang H Y， et al. STS markers for powdery mildew resistance gene fmd in wheat[J]. Euphytica， 2008， 163：159-165.

[17]Song W， Xie H， Liu Q， et al. Molecular identification of Pm12-carrying introgression lines in wheat using genomic and EST-SSR markers[J]. Euphytica， 2007， 158：95-102.

[18]Cenci A， D′Ovidio R， Tanzarella O A， et al. Identification of molecular markers linked to Pm13， an Aegilops longissima gene conferring resistance to powdery mildew in wheat[J]. TAG， 1999， 98：448-454.

[19]Chen X M， Luo Y H， Xia X C， et al. Chromosomal location of powdery mildew resistance gene Pm16 in wheat using SSR marker analysis[J]. Plant Breeding， 2005， 124：225-228.

[20]Mohler V， Hsaml L K， Zeller F J， et al. An STS marker distinguishing the rye-derived powdery mildew resistance alleles at the Pm8/Pm17 locus of common wheat[J]. Plant Breeding， 2001， 120：448-450.

[21]Liu Z Y， Sun Q X， Ni Z F， et al. Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferring resistance to powdery mildew in common wheat[J]. Plant Breeding， 1999， 118：215-219.

[22]Huang X Q， Hsam S L K， Zeller F J， et al. Molecular mapping of the wheat powdery mildew resistance gene Pm24 and marker validation for molecular breeding[J]. TAG， 2000， 101：407-414.

[23]Peng J H， Fahima T， Roeder M S， et al. High-density molecular map of chromosome region harboring stripe-rust resistance genes YrH52 and Yr15 derived from wild emmer wheat， Triticum dicoccoides[J]. Genetica， 2000， 109（3）：199-210.

[24]Wang C M， Zhang Y， Han D J， et al. SSR and STS markers for wheat stripe rust resistance gene Yr26[J]. Euphytica， 2008， 159（3）：359-366.

[25]Prins R， Groenewald J Z， Marais G F， et al. AFLP and STS tagging of Lr19， a gene conferring resistance to leaf rust in wheat[J]. TAG， 2001，103：618-624.

[26]楊文香. Lr37、Lr44的AFLP分子標記及124個小麥品種（系）抗葉銹基因鑒定[D]. 保定：河北農業(yè)大學， 2003.

[27]陳云芳， 劉莉， 楊文香， 等. 33個小麥品種（系）抗葉銹基因Lr19分子檢測[J]. 分子植物育種， 2008， 6（5）：1015-1018.

[28]Dedryver F， Jubier M F， Thouverin J， et al. Molecular markers linked to leaf rust resistance gene Lr24 in different wheat cultivars[J]. Genome， 1996， 39：830-835.

[29]Schachermayr G， Messmer M M， Feuillet C， et al. Identification of molecular markers linked to the Agropyron elongatum-derived leaf rust resistance gene Lr24 in wheat[J]. TAG， 1995， 90：982-990.

[30]張娜， 陳玉碎， 李亞卞， 等. 小麥抗葉銹病基因Lr24的一個新STS標記[J]. 作物學報， 2008， 34（2）：212-216.

[31]楊文雄， 楊芳萍， 梁丹， 等. 中國小麥育成品種和農家種中慢銹基因Lr34/Yr18的分子檢測[J]. 作物學報， 2008，34（7）：1109-1113.

[32]Lagudah E S， McFadden H， Singh R P， et al. Molecular genetic characterization of the Lr34/Yr18 slow rusting resistance gene region in wheat[J]. TAG， 2006， 114：21-30.

[33]Bossolini E， Krattinger S G， Keller B. Development of simple sequence repeat markers specific for the Lr34 resistance region of wheat using sequence information from rice and Aegilops tauschii[J]. TAG， 2006， 113：1049-1062.

[34]Seyfarth R， Feuillet C， Schachermayr G. et al. Development of a molecular marker for the adult plant leaf rust resistance gene Lr35 in wheat[J]. TAG， 1999， 99：554-560.

[35]Gold J J， Harder D E， Townley-Smith T F， et al. Development of a molecular marker for rust resistance genes Lr39 and Lr35 in wheat breeding lines[J]. Electronic Journal of Biotechnology， 1999， 2（1）：35-40.

[36]魏新燕， 楊文香， 劉大群， 等. 150個小麥品種（系）抗葉銹基因Lr35分子檢測[J]. 中國農業(yè)科學， 2004， 37（12）：1951-1954.

[37]Mago R， Speilmeyer W， Lawrence G J， et al. Identification and mapping of molecular markers linked to rust resistance genes located on chromosome IRS of rye using wheat rye translocation lines[J]. TAG， 2002， 104：1317-1324.

[38]Cuthbert P A， Somers D J， Thomas J， et al. Fine mapping Fhbl， a major gene controlling Fusarium head blight resistance in bread wheat （Triticum aestivum L.） [J] . TAG， 2006， 112：1465-1472.

[39]郎淑平， 王海燕， 胥紅研， 等. 小麥抗赤霉病、優(yōu)質高分子量麥谷蛋白亞基聚合體的分子標記輔助選育[J]. 麥類作物學報， 2008， 28（3）：415-418.

[40]Liu S， Anderson J A. Marker assisted evaluation of Fusarium head blight resistant wheat germplasm[J]. Crop Sci.， 2003， 43：760-766.

[41]蔡士賓， 任麗娟， 顏偉， 等. 小麥抗紋枯病種質創(chuàng)新及QTL定位的初步研究[J]. 中國農業(yè)科學， 2006， 39（5）：928-934.

[42]Zhang X， Zhou M， Ren L J， et al. Molecular characterization of Fusarium head blight resistance from wheat variety Wangshuibai[J]. Euphytica， 2004， 139：59-64.

[43]孫果忠. 小麥重要基因的分子標記實用性評價[D]. 北京：中國農業(yè)科學院， 2011.

[44]胡娜. 小麥抗白粉病基因的分子標記檢測及其抗性評價[D]. 合肥：安徽農業(yè)大學， 2010.

[45]雷秀玉. 小麥抗白粉病基因分子標記的實用性評價[D]. 秦皇島：河北科技師范學院， 2013.山 東 農 業(yè) 科 學2017，49（2）：10～14Shandong Agricultural Sciences山 東 農 業(yè) 科 學第49卷第2期李巧云，等：大白菜抗TuMV分子標記輔助選擇技術研究DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.02.002