利用重組大腸桿菌SOS法評(píng)價(jià)污水廠出水的遺傳毒性以及工藝去除效果

許燕，王明泉，逯南南，孫韶華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心， 濟(jì)南 250021

1997年，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization，ISO)將SOS/umu 試驗(yàn)確立為該標(biāo)準(zhǔn)體系中唯一用于監(jiān)測(cè)水環(huán)境遺傳毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法，德國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家也已將該試驗(yàn)作為水環(huán)境遺傳毒性檢測(cè)的方法[1]。目前國(guó)際上最常用的SOS/umu測(cè)試系統(tǒng)是在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium TA1535)中導(dǎo)入攜帶umuC'-LacZ嵌合體的質(zhì)粒pSK1002，構(gòu)建的細(xì)菌S.typhimurium TA1535/pSK1002。這個(gè)系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用時(shí)存在以下問題：1)對(duì)氯代有機(jī)物不敏感，特別是不適用于飲用水中消毒副產(chǎn)物的檢測(cè)[2]；2)鼠傷寒沙門菌為致病菌，易傳播，每年全世界有近億人感染，部分致死，對(duì)構(gòu)建的鼠傷寒沙門氏菌系統(tǒng)的操作存在微生物風(fēng)險(xiǎn)；3)對(duì)該系統(tǒng)的應(yīng)用步驟相對(duì)繁瑣，對(duì)β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)需要加入底物，如β-ONPG(鄰硝基苯β-D-半乳糖苷)，價(jià)格相對(duì)較貴。

本文采用基于重組大腸桿菌SOS效應(yīng)的水質(zhì)遺傳毒性檢測(cè)方法[2]，使用重組大腸桿菌代替常用的鼠傷寒沙門氏菌，將大腸桿菌umuDC啟動(dòng)基因序列與綠色熒光蛋白基因序列連接，與質(zhì)粒載體連接后導(dǎo)入大腸桿菌，重組的大腸桿菌遇到致DNA損傷物，啟動(dòng)綠色熒光蛋白基因表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生綠色熒光蛋白，通過檢測(cè)產(chǎn)生的熒光獲得污染物信息。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)某市4座主要污水處理廠出水進(jìn)行直接遺傳毒性效應(yīng)測(cè)定，并以污水一廠為例對(duì)遺傳毒性的季節(jié)變化規(guī)律以及不同的工藝對(duì)水中直接遺傳毒性效應(yīng)物質(zhì)的去除情況進(jìn)行了SOS效應(yīng)-遺傳毒性測(cè)定。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：熒光光譜儀(HITACHI F-2700)；超聲波細(xì)胞粉碎儀(SCIENTZ-IID)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海志成 ZHWY-200B)；臺(tái)式離心機(jī)(Thermo)；固相萃取儀(Reeko SPE-06C)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅)。

圖1 污水處理一廠工藝流程圖Fig. 1 Process flow diagram of the No.1 sewage plant

試劑：4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4-NQO，美國(guó)Sigma公司)；二氧化氯、正己烷、甲醇均為色譜純。

1.2 污水處理工藝流程及工藝參數(shù)

目前，4座污水處理廠均采用改良后的A/A/O(厭氧-缺氧-好氧法)處理工藝，選擇污水處理一廠進(jìn)行工藝段出水遺傳毒性檢測(cè)。污水處理一廠的主要處理工藝見圖1。

1.3 樣品采集和處理

采集5 L水樣經(jīng)0.45 μm玻璃纖維素膜過濾后再用HLB柱(500 mg，OASIS，USA)富集，富集前HLB柱使用5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL純水進(jìn)行活化，然后分別以5 mL正己烷/二氯甲烷(1:1，體積比)和10 mL甲醇/二氯甲烷(1:9，體積比)為淋洗劑洗脫。洗脫液吹干置換溶劑為DMSO，定容至0.5 mL，-20 ℃下保存，富集倍數(shù)為1萬倍。

1.4 重組大腸桿菌SOS效應(yīng)-熒光法試驗(yàn)方法

1.4.1 重組大腸桿菌貯藏物復(fù)蘇活化

將重組大腸桿菌貯藏物接入改良的LB培養(yǎng)液，加入氨芐霉素、葡萄糖，30 ℃、180 r·min-1的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)16～18 h。

1.4.2 大腸桿菌檢測(cè)液制備

將復(fù)蘇活化液按照1/100的比例接入新鮮的LB培養(yǎng)液，在37 ℃、200 r·min-1的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)2 h。

1.4.3 與受試樣品接觸

將受試樣品/大腸桿菌檢測(cè)液按照1/9的比例混勻(100 μL受試樣品:900 μL大腸桿菌檢測(cè)液)，在37 ℃、200 r·min-1的轉(zhuǎn)速下振蕩接觸1.5 h，設(shè)置3個(gè)平行組。設(shè)置不加檢測(cè)樣品，僅添加受試樣品溶劑的對(duì)照組；設(shè)置經(jīng)固相萃取前處理的純水樣品為程序空白組。

1.4.4 檢測(cè)液后處理

將與受試物接觸后的菌液及對(duì)照組的菌液通過離心收集菌體，以PBS緩沖液洗滌1次，利用超聲波破碎儀破碎菌體。

1.4.5 熒光檢測(cè)

將菌體破碎物高速離心，收集上清液，利用熒光光譜儀檢測(cè)發(fā)射熒光強(qiáng)度。采用激發(fā)波長(zhǎng)395 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為507 nm。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理與分析

R值=各濃度下的受試物熒光強(qiáng)度/相應(yīng)空白，若與空白比值大于1.5，則認(rèn)為該物質(zhì)具有致突變性(呈陽性)。

對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)毒性物質(zhì)4-NQO劑量效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出受試物的4-NQO毒性當(dāng)量(TEQ4-NQOmg·L-1)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及污水處理廠出水直接遺傳毒性測(cè)定

考慮到4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide, 4-NQO)是一種已由動(dòng)物暴露試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了的致癌物，也是一種不需要代謝活化直接引起遺傳物質(zhì)損傷的直接遺傳毒性物，在umu 測(cè)試中也已經(jīng)被廣泛用作陽性對(duì)照物進(jìn)行質(zhì)控[3]，因此在本研究中選擇4-NQO作為標(biāo)準(zhǔn)毒性物質(zhì)，對(duì)直接遺傳毒性進(jìn)行定量，程序空白組的R值為0.57。

使用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)為標(biāo)準(zhǔn)毒性物質(zhì)制作劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。對(duì)該市4座污水處理廠夏季出水重組大腸桿菌SOS效應(yīng)測(cè)試(結(jié)果見表1)，4座污水廠出水的R值均>1.5，表現(xiàn)出一定的直接遺傳毒性效應(yīng)，對(duì)應(yīng)的4-NQO當(dāng)量濃度0.018～0.514 mg·L-1。由于各污水處理廠收集的生活廢水、工業(yè)廢水來源復(fù)雜多樣，經(jīng)過常規(guī)污水處理工藝處理后，直接遺傳毒性效應(yīng)對(duì)應(yīng)4-NQO的當(dāng)量濃度也有所差異。目前，該市4座污水處理廠出水水質(zhì)達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918—2002)的一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)，但是經(jīng)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)仍然有較強(qiáng)的致突變性，這些經(jīng)過常規(guī)工藝處理過的污水直接排入城市河流，進(jìn)而污染自然水體。

圖2 4-NQO劑量-效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Dose-effect curve for 4-NQO

污水一廠TheNo.1sewageplant污水二廠TheNo.2sewageplant污水三廠TheNo.3sewageplant污水四廠TheNo.4sewageplantR值Ratiooffluorescence3.032.811.562.21TEQ4-NQO/(mg·L-1)0.5140.3110.0180.079

2.2 污水處理一廠不同季節(jié)進(jìn)出水直接遺傳毒性測(cè)定及去除率

取污水處理一廠不同季節(jié)(春、夏、秋、冬)進(jìn)出水樣品進(jìn)行重組大腸桿菌SOS效應(yīng)測(cè)試(結(jié)果見表2)，進(jìn)廠水的直接遺傳毒性當(dāng)量(TEQ4-NQO)為0.021～0.617 mg·L-1，出廠水的直接遺傳毒性當(dāng)量(TEQ4-NQO)為0.016～0.514 mg·L-1；夏季進(jìn)廠水直接遺傳毒性當(dāng)量明顯高于其他3季，可能原因是該市夏季降水量較大，地表徑流中面源污染物隨著降水進(jìn)入城市排水管道。夏季該污水廠直接遺傳毒性物質(zhì)去除率最低為16.69%，在春季最高達(dá)到53.97%。由此可見，目前的污水廠處理工藝對(duì)直接遺傳毒性物質(zhì)有一定的去除效果，但去除能力變化較大。

2.3 污水處理一廠工藝段出水直接遺傳毒性去除特征

取污水處理一廠主要工藝段出水樣品進(jìn)行重組大腸桿菌SOS效應(yīng)測(cè)試(結(jié)果見圖3)，污水處理一廠進(jìn)廠水為陽性，改良A/A/O工藝出水是陰性，二沉池出水及出廠水為陽性，直接遺傳毒性比進(jìn)廠水降低，出廠水較進(jìn)廠水直接遺傳毒性去除率為23.8%。其中，改良A/A/O工藝段對(duì)直接遺傳毒性去除效果最佳(達(dá)到33.33%)，整體工藝對(duì)直接遺傳毒性物質(zhì)有一定的去除效果。目前，國(guó)內(nèi)外已有許多報(bào)道應(yīng)用SOS/umu方法評(píng)價(jià)飲用水各個(gè)工藝段出水的遺傳毒性[4-6]，對(duì)于污水廠處理后的出水遺傳毒性效應(yīng)的監(jiān)測(cè)還未引起足夠的重視，遺傳毒性物質(zhì)的去除也應(yīng)納入污水廠工藝改進(jìn)的考慮因素之一。

圖3 污水處理一廠工藝出水TEQ4-NQO及去除率Fig. 3 TEQ4-NQO and removal rate of direct genetic toxicity of water from the No.1 sewage plant

春季Spring夏季Summer秋季Autumn冬季W(wǎng)inter進(jìn)廠水RawwaterTEQ4-NQO/(mg·L-1)0.3650.6170.0210.469出廠水TreatedwaterTEQ4-NQO/(mg·L-1)0.1680.5140.0160.272去除率/%Removalrate/%53.9716.6923.8142.00

3 討論(Discussion)

3.1 傳統(tǒng)SOS/umu測(cè)試方法和重組大腸桿菌SOS效應(yīng)-熒光法應(yīng)用于水質(zhì)遺傳毒性評(píng)價(jià)的相關(guān)研究

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多采用Oda等[7]于1985年建立起來的SOS/umu測(cè)試方法，或者根據(jù)該方法改進(jìn)優(yōu)化的SOS/umu測(cè)試方法。該方法被廣泛應(yīng)用于化合物和復(fù)雜樣品檢測(cè)的遺傳毒性檢測(cè)，國(guó)內(nèi)學(xué)者將其應(yīng)用于飲用水處理遺傳毒性評(píng)價(jià)也較多，見表3。

本研究應(yīng)用重組大腸桿菌SOS效應(yīng)-熒光法測(cè)試了某市4座污水處理廠排水的直接遺傳毒性，由于4座污水處理廠均采用改良后的A/A/O(厭氧-缺氧-好氧法)處理工藝，直接遺傳毒性效應(yīng)對(duì)應(yīng)的4-NQO濃度有所差異，這可能與4座處理廠的污水來源以及處理規(guī)模有關(guān)。傳統(tǒng)SOS/umu測(cè)試方法在污水或污泥樣本遺傳毒性測(cè)試的應(yīng)用則相對(duì)較少，倪瀟瀟等[12]對(duì)造紙廠污水進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)，得出目前該廠現(xiàn)行活性污泥廢水處理工藝，對(duì)遺傳毒性物質(zhì)(包括直接的和間接的)的去除作用不明顯，本研究測(cè)定的城市典型污水處理廠現(xiàn)行工藝對(duì)遺傳毒性物質(zhì)去除率為16.69%～53.97%，總體去除效果也不甚理想。倪瀟瀟[13]等某城市4個(gè)典型污水處理工藝進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)，4個(gè)典型的城市污水處理工藝總體上對(duì)遺傳毒性物質(zhì)都有一定的去除效果；其中A2/O處理工藝的去除效果最明顯；空氣曝氣活性污泥工藝對(duì)直接遺傳毒性物質(zhì)的去除效果較好，與本研究中污水處理廠改進(jìn)的A/A/O工藝對(duì)直接遺傳毒性物質(zhì)去除效果較明顯一致。李莉[14]等應(yīng)用該方法評(píng)價(jià)了北京市污水處理廠的生污泥樣品以及經(jīng)過不同處理工藝處理后的污泥樣品的遺傳毒性效應(yīng)，結(jié)果表明污水處理廠的污泥樣品的遺傳毒性都在控制范圍內(nèi)，在本文尚未涉及到污泥樣品遺傳毒性效應(yīng)的評(píng)價(jià)，這也將是以后研究的方向。

表3 SOS/umu 測(cè)試法應(yīng)用于飲用水處理的相關(guān)研究Table 3 Some research about the application of SOS/umu testing in water treatment

3.2 重組大腸桿菌SOS效應(yīng)-熒光法與傳統(tǒng)SOS/umu測(cè)試體系比較

本研究中實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)固相萃取前處理后，應(yīng)用重組大腸桿菌SOS效應(yīng)-熒光法測(cè)定水質(zhì)直接遺傳毒性，每組測(cè)試設(shè)置了3個(gè)平行組，熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差在7%～26%，精密度良好；測(cè)定4-NQO的檢測(cè)限為15.76 μg·L-1，對(duì)比Oda 等[15]使用傳統(tǒng)的SOS/umu測(cè)試體系測(cè)定4-NQO檢測(cè)限為28.5 μg·L-1，檢測(cè)限更低；菌液培養(yǎng)時(shí)間比傳統(tǒng)測(cè)試體系縮短了1 h，操作步驟更簡(jiǎn)便且易于操作。

綜上所述，本研究使用固相萃取前處理和重組大腸桿菌SOS效應(yīng)-熒光法測(cè)定水質(zhì)直接遺傳毒性，操作便利、檢測(cè)敏感性較高、操作危險(xiǎn)性較低，且使用4-硝基喹啉氧化物作為標(biāo)準(zhǔn)毒性當(dāng)量物質(zhì)，可以進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，行業(yè)推廣前景可期。

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