0#柴油和流花原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)幼體的急性毒性效應(yīng)

張喆，陳海剛，溫為庚,3，張林寶，黃南建,2，胡瑩，賈曉平，蔡文貴,

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300 2. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，海南熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，三亞 572018

近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，對(duì)石油產(chǎn)品的需求量呈逐年上升的趨勢(shì)。2014年，我國(guó)進(jìn)口原油達(dá)到3.1億噸，基本均是通過(guò)船舶運(yùn)輸進(jìn)入我國(guó)。石油類(lèi)污染物成為我國(guó)近海海洋環(huán)境的主要污染物之一，給海洋生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的影響。據(jù)2015年中國(guó)海洋環(huán)境狀況公報(bào)數(shù)據(jù)顯示，僅2015年就有近5.9萬(wàn)噸石油類(lèi)物質(zhì)隨河流排入海洋[1]，與此同時(shí)，船舶運(yùn)輸造成的泄漏和海浪海潮運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的溢油遷移均會(huì)影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡[2]。國(guó)內(nèi)外諸多研究表明，原油和燃料油可影響海洋藻類(lèi)[3]、浮游生物[4]、貝類(lèi)[5]和魚(yú)類(lèi)[6]的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致海洋生物的多樣性和海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因此，研究溢油污染對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)，對(duì)評(píng)價(jià)溢油污染的毒性，保護(hù)海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康具有重要意義。

我國(guó)學(xué)者相繼開(kāi)展了燃料油和原油對(duì)不同種類(lèi)對(duì)蝦的毒性試驗(yàn)。唐峰華等[7]分析了8種油品對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)的急性毒性，獲得不同油品對(duì)上述對(duì)蝦的急性毒性數(shù)據(jù)。沈新強(qiáng)等[8]的研究表明，平湖原油對(duì)脊尾白蝦(Palaemon carincauda)的毒性存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，上述研究對(duì)深入探討不同種類(lèi)油品對(duì)海洋蝦類(lèi)的毒性效應(yīng)具有重要意義。然而，目前有關(guān)南海原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)，尤其是其不同發(fā)育階段幼體毒性效應(yīng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。斑節(jié)對(duì)蝦廣泛分布于西太平洋和印度洋沿岸區(qū)域，在我國(guó)浙江、福建、廣東、海南和廣西沿岸均有分布，是世界三大養(yǎng)殖蝦類(lèi)品種之一，廣東斑節(jié)對(duì)蝦產(chǎn)量占到全國(guó)總產(chǎn)量的55%[9]。本文以斑節(jié)對(duì)蝦為研究對(duì)象，分析0#柴油和LH原油分散劑乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的急性毒性，旨在為評(píng)價(jià)石油類(lèi)污染對(duì)海洋生物毒性效應(yīng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為評(píng)估溢油和石油類(lèi)污染對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體(N1/N2，體長(zhǎng)(0.32±0.01) mm)、蚤狀幼體(Z1，體長(zhǎng)(1.05±0.01) mm)、糠蝦(M1，體長(zhǎng)(3.81±0.08) mm)和仔蝦(P2，體長(zhǎng)(0.92±0.11) mm)取自南海水產(chǎn)研究所海南熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，實(shí)驗(yàn)時(shí)選用規(guī)格、發(fā)育階段一致的健康幼體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。實(shí)驗(yàn)用海水取自南海水產(chǎn)研究所海南熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心，為經(jīng)活性碳過(guò)濾凈化和消毒的自然海水，水溫(29.2 ± 0.8) ℃，鹽度30‰ ± 1‰，pH值7.2 ± 0.1，溶解氧飽和度不低于87.64%，每12 h更換海水1次，并及時(shí)吸出死亡個(gè)體。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)用0#柴油購(gòu)自深圳市大鵬鎮(zhèn)中石化南澳加油站，原油取自中國(guó)南海流花油田，溢油分散劑購(gòu)自廣州富肯環(huán)保科技有限公司(富肯-3號(hào)溢油分散劑)，其他實(shí)驗(yàn)用分析試劑均為分析純，購(gòu)自廣東國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 0#柴油和南海LH原油分散劑乳化液母液制備

將溢油分散劑分別與LH原油、0#柴油按1:1(V:V)混合于50 mL小燒杯中，置于超聲波洗滌器中超聲5 min，后將該超聲后的混合液以1:10(V:V)的比例加入過(guò)濾海水中，于超聲波洗滌器中連續(xù)超聲3 h后分液漏斗靜置3 h，取下層水相液保存于棕色瓶中，即為0#柴油和LH原油乳化液母液。制備后的0#柴油和LH原油乳化液母液參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行總石油烴(total petroleum hydrocarbon, THP)含量的測(cè)定。

1.2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

斑節(jié)對(duì)蝦由受精卵發(fā)育到仔蝦共經(jīng)歷無(wú)節(jié)幼體、蚤狀幼體、糠蝦和仔蝦等幾個(gè)階段，其中無(wú)節(jié)幼體變態(tài)到蚤狀幼體大約需要35 h左右，蚤狀幼體變態(tài)到糠蝦大概需要96 h，糠蝦發(fā)育到仔蝦大約96～120 h[11]。本實(shí)驗(yàn)考慮到斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段對(duì)餌料、氧氣的需求以及實(shí)驗(yàn)體系的需要，將無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為48 h，糠蝦和仔蝦設(shè)置為96 h。

以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用以10為底的等對(duì)數(shù)間距設(shè)置不同石油烴濃度的0#柴油和LH原油乳化液作用于斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體(表1)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(control group, CG)和分散劑對(duì)照組(dispersant control group, DCG)。其中，分散劑對(duì)照組中分散劑濃度與實(shí)驗(yàn)組最高濃度組所添加的分散劑濃度一致，并通過(guò)向低濃度實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)充分散劑的形式保證各實(shí)驗(yàn)組分散劑濃度一致。配制實(shí)驗(yàn)液前用UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津儀器有限公司)測(cè)定母液總石油烴濃度。

無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別設(shè)置10個(gè)濃度組、1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)分散劑對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行48 h。正式實(shí)驗(yàn)于100 mL燒杯中進(jìn)行，每個(gè)燒杯加入50 mL海水，每個(gè)濃度組3個(gè)平行，每個(gè)平行大約200～300個(gè)個(gè)體。分別于24 h和48 h使用膠頭滴管隨機(jī)取樣于實(shí)體解剖鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體以在解剖鏡下針尖碰觸后無(wú)反應(yīng)作為死亡標(biāo)準(zhǔn)，分別于實(shí)驗(yàn)36 h和48 h記錄無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率。正式實(shí)驗(yàn)期間每12 h更換全部試液1次，溶解氧飽和度為92.37% ± 2.59%，脅迫期間不投喂。

表1 0#柴油和南海LH原油乳化液實(shí)驗(yàn)濃度Table 1 Experimental solutions of No. 0 diesel and LH crude oil

注：同一實(shí)驗(yàn)組0#柴油與南海LH原油濃度梯度設(shè)置相同。

Note: Same TPH concentrations of No. 0 diesel and LH crude oil were set according to same experimental groups.

糠蝦和仔蝦則分別設(shè)置5個(gè)濃度組、1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)分散劑對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行96 h。正式實(shí)驗(yàn)于2 L燒杯中進(jìn)行，每個(gè)濃度組3個(gè)平行，每個(gè)燒杯加入1.2 L砂濾海水和40～50個(gè)對(duì)蝦個(gè)體，每12 h換水1次，分別于24 h、48 h、72 h和96 h記錄對(duì)蝦死亡情況。糠蝦和仔蝦以軀干彎曲、僵硬、玻璃棒碰觸無(wú)反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間不投喂，溶解氧飽和度為95.57% ± 1.25%。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan’s法對(duì)均值進(jìn)行多重比較，顯著水平為P < 0.05。實(shí)驗(yàn)中用存活率和變態(tài)率來(lái)反映0#柴油和LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)和變態(tài)發(fā)育的影響，存活率(%)= 實(shí)驗(yàn)期間存活個(gè)體數(shù)/實(shí)驗(yàn)個(gè)體總數(shù)×100%，變態(tài)率(%)= 變態(tài)個(gè)體數(shù)/存活個(gè)體總數(shù)×100%[12]。采用直線內(nèi)插法分別計(jì)算48 h和96 h 0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的半致死濃度，計(jì)算斑節(jié)對(duì)蝦幼體存活安全濃度。其中，針對(duì)無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體，安全濃度=48 h-LC50× 0.1[13]；針對(duì)糠蝦和仔蝦，安全濃度=96 h-LC50× 0.1[14]。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體中毒癥狀

前期實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)所用富肯-3號(hào)溢油分散劑在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)生物并無(wú)顯著的影響，表明其對(duì)試驗(yàn)生物的毒性較小，適于作為助溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[15]。

空白對(duì)照組和分散劑對(duì)照組無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體剛毛、附肢、尾棘直，粗壯，游泳迅速，趨光性強(qiáng)；暴露于0#柴油和LH原油乳化液后，無(wú)節(jié)幼體附肢和剛毛彎曲可折斷，蚤狀幼體軀干嚴(yán)重彎曲，兩者游泳能力和趨光性均較弱，導(dǎo)致多個(gè)個(gè)體聚集成群。無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體死亡時(shí)軀體變?yōu)榘咨?，聚集沉于水底。糠蝦和仔蝦暴露于0#柴油和LH原油初期，低濃度組與對(duì)照組沒(méi)有顯著的行為差異，而高濃度組則表現(xiàn)出一定的興奮效應(yīng)，在燒杯內(nèi)快速游動(dòng)。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和暴露濃度的增加，其活力逐漸下降，匍匐于燒杯底部，活動(dòng)較少，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍直至死亡。死亡糠蝦和仔蝦側(cè)躺彎曲，死亡糠蝦通體呈現(xiàn)白色，而仔蝦則通體為暗紅色。

2.2 0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的劑量-效應(yīng)關(guān)系

圖1所示為0#柴油和LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體死亡率和變態(tài)率的影響。由圖中可知，分散劑對(duì)照組無(wú)節(jié)幼體死亡率和變態(tài)率與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P > 0.05)，而0#柴油和LH原油乳化液均對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體具有較大毒性，0.1 mg·L-1暴露24 h即可導(dǎo)致無(wú)節(jié)幼體的死亡，而高濃度暴露24 h后實(shí)驗(yàn)生物死亡率可達(dá)到96%左右。0#柴油乳化液可以影響斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率(圖1)。3.59 mg·L-10#柴油作用36 h后，無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率下降為93.67%，與對(duì)照組存在顯著差異(P < 0.05)；當(dāng)暴露濃度為10.0 mg·L-1時(shí)，無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率下降到最低，為76.33%；暴露濃度低于2.15 mg·L-1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率差異不顯著(P > 0.05)。0#柴油脅迫48 h后，3.59 mg·L-1、5.99 mg·L-1和10.00 mg·L-1濃度組無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率分別為93.98%、90.85%和86.88%，仍然顯著低于對(duì)照組(P < 0.05)。

圖1 0#柴油(a)和LH原油(b)乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體濃度-劑量效應(yīng)注：*代表無(wú)節(jié)幼體36 h和48 h變態(tài)率與空白組存在顯著差異(P < 0.05)；CG和DCG分別代表空白對(duì)照組和分散劑對(duì)照組，其總石油烴濃度均為0.00 mg·L-1。Fig. 1 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to naupliusNote: * represents significant difference of nauplius’ metamorphosis rate between control and experimental groups after 36 and 48 hours (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

LH原油同樣可以影響無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率，低濃度時(shí)無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率差異不顯著，而隨著暴露濃度的增加變態(tài)率逐漸下降，脅迫36 h后當(dāng)濃度僅為0.77 mg·L-1時(shí)，變態(tài)率即與空白對(duì)照組存在顯著差異(P < 0.05)。3.59 mg·L-1、5.99 mg·L-1和10.0 mg·L-1濃度組無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率分別為90.45%、83.33%和69.68%，均顯著低于對(duì)照組(P < 0.05)。脅迫48 h后，高濃度組無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率略有升高，3.59 mg·L-1、5.99 mg·L-1和10.0 mg·L-1濃度組無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率分別為92.95%、90.78%和83.52%。

0#柴油和LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦蚤狀幼體劑量-效應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖2。0.10 mg·L-10#柴油和LH原油暴露24 h后，斑節(jié)對(duì)蝦蚤狀幼體即開(kāi)始出現(xiàn)死亡，0.77 mg·L-10#柴油乳化液暴露24 h后蚤狀幼體死亡率達(dá)到51.67%，48 h后死亡率達(dá)到63.3%；10

mg·L-10#柴油乳化液作用24 h，蚤狀幼體即全部死亡。LH原油乳化液毒性較之0#柴油乳化液略小。當(dāng)LH原油暴露濃度為0.77 mg·L-1時(shí)，蚤狀幼體24 h和48 h死亡率分別為46.67%和58.30%。隨著暴露濃度的增加，蚤狀幼體死亡率逐漸上升，10 mg·L-1濃度組在24 h和48 h死亡率分別達(dá)到96.67%和100%。當(dāng)石油烴含量高于0.17 mg·L-1時(shí)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)蚤狀幼體死亡率均顯著高于空白組(P < 0.05)。

圖2 0#柴油和LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦蚤狀幼體濃度-劑量效應(yīng)注： *代表該濃度組各時(shí)間點(diǎn)蚤狀幼體死亡率均與空白組存在顯著差異(P < 0.05)；CG和DCG分別代表空白對(duì)照組和分散劑對(duì)照組，其總石油烴濃度均為0.00 mg·L-1。Fig. 2 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to protozoeaNote: *represents significant difference of protozoea mortality between control and experimental groups at different times (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

圖3 0#柴油(a)和LH原油(b)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦糠蝦的濃度-劑量效應(yīng)注：*代表該濃度組各時(shí)間點(diǎn)糠蝦死亡率均與空白組存在顯著差異(P < 0.05)；CG和DCG分別代表空白對(duì)照組和分散劑對(duì)照組，其總石油烴濃度均為0.00 mg·L-1。Fig. 3 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to mysisNote: *represents significant difference of mysis mortality between control and experimental groups at different times (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

圖3和圖4所示分別為0#柴油和LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦糠蝦和仔蝦的劑量-效應(yīng)關(guān)系。0.5 mg·L-10#柴油和LH原油乳化液作用24 h后，斑節(jié)對(duì)蝦糠蝦均未出現(xiàn)死亡，48 h后死亡率則分別為10%和8.33%。1.58 mg·L-10#柴油乳化液作用后的72 h和96 h，糠蝦死亡率分別達(dá)到55.00%和66.67%，而相同濃度LH原油組的死亡率則分別為48.33%和60.00%。當(dāng)斑節(jié)對(duì)蝦糠蝦暴露于最高濃度(5 mg·L-1)96 h后，0#柴油和LH原油實(shí)驗(yàn)組的死亡率均達(dá)到95.00%，且當(dāng)石油烴含量高于0.89 mg·L-1時(shí)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)糠蝦死亡率均顯著高于空白組(P < 0.05)。較之糠蝦，仔蝦對(duì)0#柴油和LH原油的耐受力較高。當(dāng)暴露濃度為3.16 mg·L-1和7.95 mg·L-1時(shí)，0#柴油組仔蝦96 h死亡率分別為81.67%和96.67%，而LH原油組則分別為71.67%和91.67%。當(dāng)濃度升高到20 mg·L-1時(shí)，0#柴油和LH原油暴露72 h后仔蝦的死亡率分別為98.33%和93.33%，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組96 h的死亡率則均達(dá)到100%。當(dāng)石油烴含量高于1.26 mg·L-1時(shí)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)仔蝦死亡率均顯著高于空白組(P < 0.05)。

2.3 0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的半致死濃度和安全濃度

如表2所示，0#柴油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體的48 h-LC50分別為0.55 mg·L-1(0.45～0.65 mg·L-1)和0.42 mg·L-1(0.34～0.50 mg·L-1)，LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體的48 h-LC50分別為0.62 mg·L-1(0.51～0.75 mg·L-1)和0.51 mg·L-1(0.42～0.61 mg·L-1)，蚤狀幼體對(duì)0#柴油和LH原油乳化液的耐受能力大于無(wú)節(jié)幼體。0#柴油和LH原油對(duì)糠蝦的96 h-LC50分別為0.95 mg·L-1(0.78～1.13 mg·L-1)和1.05 mg·L-1(0.86～1.25 mg·L-1)，對(duì)仔蝦的96 h-LC50分別為1.09 mg·L-1(0.85～1.35 mg·L-1)和1.42 mg·L-1(1.11～1.71 mg·L-1)，糠蝦和仔蝦對(duì)0#柴油和LH原油的耐受能力順序均為仔蝦 > 糠蝦，2種油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的毒性大小順序均為0#柴油乳化液 > LH原油乳化液。0#柴油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體、蚤狀幼體、糠蝦和仔蝦的安全濃度分別為0.05 mg·L-1、0.04 mg·L-1、0.10 mg·L-1和0.11mg·L-1，LH原油對(duì)無(wú)節(jié)幼體、蚤狀幼體、糠蝦和仔蝦的安全濃度分別為0.06 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.11 mg·L-1和0.14mg·L-1。

圖4 0#柴油(a)和LH原油(b)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦仔蝦的劑量-效應(yīng)注：*代表該濃度組各時(shí)間點(diǎn)仔蝦死亡率均與空白組存在顯著差異(P < 0.05)；CG和DCG分別代表空白對(duì)照組和分散劑對(duì)照組，其總石油烴濃度均為0.00 mg·L-1。Fig. 4 Dose-response of No. 0 diesel emulsion (a) and LH crude oil emulsion (b) to post-larvaeNote: *represents significant difference of post-larvae mortality between control and experimental groups at different times (P < 0.05); CG and DCG represent control and dispersant control groups respectively, in which the concentration of THP are both 0.00 mg·L-1.

3 討論(Discussion)

3.1 0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率的影響

溢油污染可以對(duì)多種生物的早期生長(zhǎng)發(fā)育造成影響[6, 16]。吳彰寬和陳民山[17]分析勝利油田對(duì)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)無(wú)節(jié)幼體影響的最低濃度為3.2 mg·L-1，油濃度為10 mg·L-1時(shí)，幼體變態(tài)率開(kāi)始迅速下降，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率僅為35%左右。楊柏林等[18]和呂福榮等[19]在分析石油烴對(duì)海膽胚胎的發(fā)育毒性時(shí)也發(fā)現(xiàn)，0#柴油分散液對(duì)海膽胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期具有不同程度的延遲效應(yīng)，120#燃料油可以顯著延長(zhǎng)海膽胚胎發(fā)育的時(shí)間，分散劑的加入使得該延遲效應(yīng)更加明顯[20]。本研究結(jié)果表明0#柴油和LH原油可以影響斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體的變態(tài)率，3.59 mg·L-10#柴油和0.77 mg·L-1原油即可影響斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體的發(fā)育。由36 h和48 h無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率可知，LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體發(fā)育的影響要大于0#柴油，這可能是在原油蒸餾為柴油的過(guò)程中，失去的部分化合物可能會(huì)對(duì)對(duì)蝦發(fā)育產(chǎn)生較大影響。隨著暴露濃度的升高，斑節(jié)對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體變態(tài)率逐漸下降，而暴露48 h后，高濃度組變態(tài)率略有升高，說(shuō)明與之前的研究結(jié)果相似，一定濃度0#柴油和LH原油乳化液顯著延長(zhǎng)了無(wú)節(jié)幼體發(fā)育到蚤狀幼體的時(shí)間。鑒于試驗(yàn)設(shè)置時(shí)間較短，在試驗(yàn)期內(nèi)僅觀察到無(wú)節(jié)幼體的變態(tài)發(fā)育，有關(guān)0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦其他發(fā)育階段幼體變態(tài)率的影響仍需要進(jìn)一步的研究。

3.2 斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體對(duì)0#柴油和LH原油的耐受性差異

我國(guó)學(xué)者圍繞溢油污染對(duì)海洋生物幼體的急性毒性積累了大量數(shù)據(jù)，這些結(jié)果因油品、試驗(yàn)生物個(gè)體大小及種間差異而不同。唐峰華等[7]研究發(fā)現(xiàn)，不同油品分散液對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦的LC50分別為0.60～754.87 mg·L-1和0.002～7.62 mg·L-1，可見(jiàn)不同油品之間以及不同的試驗(yàn)物種之間差別較大。Hemmer等[21]的研究結(jié)果顯示LSC原油乳化液對(duì)糠蝦(Americamysis bahia)的LC50介于0.39～9.7 mg·L-1之間，其對(duì)糠蝦的毒性因使用的分散劑不同而存在差異。另有研究表明，原油和0#柴油乳化液對(duì)3月齡幼參的96 h-LC50分別為246.09 mg·L-1和125.89 mg·L-1[14]；0#柴油分散液對(duì)馬糞海膽浮游幼蟲(chóng)48 h和72 h的EC50分別為3.39 mg·L-1和1.87 mg·L-1[22]；溢油分散劑處理的平湖原油對(duì)脊尾白蝦幼體的96 h-LC50為1.20 mg·L-1[8]；原油乳化液對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus Vannamei)成體的48 h-LC50則為631.46 mg·L-1[23]。綜合以上的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，溢油污染對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼體的LC50大多介于0.39～246.09 mg·L-1之間，遠(yuǎn)低于其對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物成體的LC50。本研究結(jié)果表明，0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的LC50分別介于0.42～1.09 mg·L-1和0.51～1.42 mg·L-1之間。根據(jù)魚(yú)類(lèi)毒性等級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[24]，0#柴油和LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體毒性均為劇毒(LC50< 1 mg·L-1)。與以往的研究結(jié)果相比，本次獲得的LC50數(shù)值較低可能存在以下原因：第一，本文采用斑節(jié)對(duì)蝦早期發(fā)育階段幼體，其對(duì)溢油污染的耐受力較之成體要差；第二，本研究結(jié)果為0#柴油和原油乳化液結(jié)果，分散劑的加入可能使柴油和原油的毒性增加；第三，本次試驗(yàn)水溫較高，平均水溫在29 ℃左右，水溫較高時(shí)實(shí)驗(yàn)生物的耐受性會(huì)有所下降[25]。

表2 0#柴油和南海LH原油乳化液對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的48 h/96 h-LC50Table 2 48 h/96 h-LC50 and 95% confidence interval of No. 0 diesel oil and LH crude oil emulsion to different development stages of P. monodon

注：*無(wú)節(jié)幼體和蚤狀幼體為48 h-LC50，糠蝦和仔蝦為96 h-LC50。

Note: 48 h-LC50of nauplius and protozoea were calculated, and 96 h-LC50of mysis and post-larvae were calculated.

生物不同發(fā)育階段幼體對(duì)污染物的敏感度存在顯著差異。黃逸君等[4]分析了原油乳化液對(duì)10種海洋橈足類(lèi)的急性毒性，其對(duì)海洋橈足類(lèi)的急性毒性介于82.33～856.64 mg·L-1之間，且毒性隨著物種個(gè)體的增大而減弱。然而對(duì)蝦對(duì)污染物的耐受力卻并不一定隨著其個(gè)體的增長(zhǎng)而增加。吳彰寬和陳民山[17]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體對(duì)石油的耐受能力依次為受精卵 > 仔蝦 > 無(wú)節(jié)幼體 > 糠蝦 > 蚤狀幼體，認(rèn)為在評(píng)價(jià)石油污染對(duì)對(duì)蝦的影響時(shí)，應(yīng)首先考慮其對(duì)蚤狀幼體的影響。溫為庚等[26]分析了復(fù)方三氯異氰尿酸對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦幼體的毒性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)試驗(yàn)藥物的耐受力依次為仔蝦 > 無(wú)節(jié)幼體 > 糠蝦 > 蚤狀幼體。本研究也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象，斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體對(duì)0#柴油和原油的耐受能力依次為仔蝦 > 糠蝦 > 無(wú)節(jié)幼體 > 蚤狀幼體。雖然無(wú)節(jié)幼體個(gè)體較蚤狀幼體小、發(fā)育階段較早，但其對(duì)0#柴油和LH原油的耐受能力較蚤狀幼體強(qiáng)，可能是因?yàn)闊o(wú)節(jié)幼體主要依靠卵黃營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)尚未攝食，而蚤狀幼體處于變態(tài)階段，對(duì)外源污染物更為敏感[27]。

3.3 0#柴油和LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦幼體的毒性差異

不同油品之間存在毒性差異，LH原油對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段幼體的毒性均小于0#柴油，這一結(jié)果在以往的研究中被屢次證實(shí)。唐峰華等[28]研究了4種原油和4種成品油對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦仔蝦的急性毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)成品油F180和F120對(duì)仔蝦的毒性最大，原油TJ016對(duì)仔蝦的毒性最小。原油由飽和烴、芳香烴、瀝青質(zhì)和樹(shù)脂等有機(jī)物組成，這些有機(jī)物中大約有75%的烴類(lèi)物質(zhì)[29]，而在0#柴油分散液中，苯、萘、菲等芳烴及其取代物占22.1%，烷烴占50%左右。不論是原油還是0#柴油，芳香烴均被認(rèn)為是其毒性最大的成分[2,30]，其毒性往往大于烷烴類(lèi)化合物[22]。研究顯示，相比總石油烴含量而言，2～4環(huán)的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAH)含量更能準(zhǔn)確反映原油對(duì)生物體的毒性[31]。Anderson等[32]的研究表明，Corexit 9500A分散劑的使用，顯著增加了原油對(duì)Rhithropanopeus harrisii幼體的毒性，認(rèn)為是由于分散劑的加入，使得乳化液中PAH的濃度增加，顯著增加了原油乳化液的毒性。Cohen等[33]發(fā)現(xiàn)，MC-252原油水溶液和乳化液對(duì)夏唇角水蚤的48 h-LC50分別為61 μg·L-1和255 μg·L-1，而此時(shí)二者的總PAH含量非常接近，分別為70.8 μg·L-1和74.3 μg·L-1，分散劑的加入，使得PAH形成了不利于被橈足類(lèi)攝食的較大的液滴，因此從總石油烴含量來(lái)看，分散劑的加入降低了原油的毒性。鑒于此，在今后的研究中，除測(cè)定總石油烴含量外，建議應(yīng)增加PAH相關(guān)含量的檢測(cè)，以使得研究結(jié)果更加準(zhǔn)確。

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