血清miRNA檢測(cè)對(duì)直腸癌患者新輔助放化療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值

鞠芳，盧琳，李緒彤，趙清葉，李娜，袁海成

(青島市中心醫(yī)院，山東青島266042)

血清miRNA檢測(cè)對(duì)直腸癌患者新輔助放化療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值

鞠芳，盧琳，李緒彤，趙清葉，李娜，袁海成

(青島市中心醫(yī)院，山東青島266042)

目的 探討血清微小RNA(miRNA)has-let-7a、-7e及-7g檢測(cè)對(duì)直腸癌患者新輔助放化療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法 選擇中低位直腸癌患者43例，均采用奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱方案(XELOX)化療及放療5周。治療后根據(jù)Mandard腫瘤消退分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為消退良好組18例，無明顯消退組25例。治療前采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表達(dá)；用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g對(duì)直腸癌放化療后腫瘤病理消退程度的預(yù)測(cè)價(jià)值，對(duì)比三者ROC曲線下面積(AUC)。結(jié)果 治療前消退良好組血清miRNA has-let-7e相對(duì)表達(dá)量低于無明顯消退組(P<0.05)；兩組血清hsa-let-7a和has-let-7e表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。miRNA has-let-7e預(yù)測(cè)新輔助放化療效果的AUC大于has-let-7a、has-let-7g的AUC(P均<0.05)。結(jié)論 血清miRNA has-let-7e可作為預(yù)測(cè)直腸癌新輔助放化療療效的血清標(biāo)志物。

直腸腫瘤；微小RNA；新輔助化療；放射治療

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的重要原因之一，其中約30%為直腸癌[1]。多數(shù)直腸癌患者就診時(shí)已處于中晚期。近年來，新輔助放化療聯(lián)合手術(shù)治療已經(jīng)成為中晚期直腸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療手段。但由于患者個(gè)體差異較大，新輔助放化療療效也存在差異[2]。通過對(duì)放化療療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)療效較差患者盡早給予手術(shù)治療，可避免無效治療[3]。目前臨床、代謝指標(biāo)及影像學(xué)手段對(duì)療效的預(yù)測(cè)并不理想[4～6]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，能夠通過剪切或翻譯抑制對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)調(diào)控[7,8]。目前探討miRNAs是否可作為直腸癌新輔助化療療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的研究較少[9～11]。本研究對(duì)miRNA has-let-7a、-7e及-7g在直腸癌新輔助化療療效預(yù)測(cè)中的價(jià)值進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2013年3月本院收治的中低位直腸癌患者43例，均經(jīng)腸鏡活檢確診，經(jīng)盆腔CT或MRI檢查確定腫瘤分期，經(jīng)輔助檢查排除肝或肺等遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移，可耐受放化療。其中男32例、女11例，年齡32～78歲，TNM分期Ⅱ期4例、Ⅲ期39例，Karnofsky評(píng)分>60分。患者均簽署知情同意書，并接受隨訪。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 患者均接受奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱方案(XELOX)化療及放療。放療方法：直線加速器X線照射靶區(qū)(直腸原發(fā)灶和淋巴引流區(qū)域)，用等中心三野照射法，后野∶左側(cè)野∶右側(cè)野=2∶1∶1，放射總劑量為50 Gy，2.0 Gy/次，1次/d，每周照射5 d。化療方法：奧沙利鉑每次50 mg/m2，加入50 g/L葡萄糖注射液250 mL靜滴2 h，1次/周；卡培他濱每次800 mg/m2口服，2次/d，每周5 d。放化療同步進(jìn)行，均連續(xù)治療5周。在新輔助放化療期間定期檢查患者血常規(guī)和肝腎功能，同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行積極對(duì)癥支持治療和營(yíng)養(yǎng)治療。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 治療結(jié)束后用腫瘤病理消退程度來評(píng)價(jià)新輔助放化療治療效果。術(shù)后標(biāo)本送病理科進(jìn)行病理分析，采用Mandard腫瘤消退分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(TRG)對(duì)直腸癌病理消退情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，TRG1級(jí)：腫瘤完全消退，完全無殘留癌細(xì)胞；TRG2級(jí)：腫瘤消退良好，少量殘留癌細(xì)胞；TRG3級(jí)：腫瘤中度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，纖維化占26%～50%；TRG4級(jí)：腫瘤輕度消退，腫瘤組織中伴明顯纖維化，但不超過腫瘤的25%；TRG5級(jí)：腫瘤無消退，腫瘤細(xì)胞無變化，無纖維組織。TRG1、2級(jí)視為腫瘤病理消退良好，TRG3、4、5級(jí)視為腫瘤無明顯消退[12]。

1.4 血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(qRT-PCR)。治療前采集患者清晨空腹靜脈血，置于含枸櫞酸鈉的抗凝管中，經(jīng)低溫、超速和離心獲得血清，存放于-80 ℃冰箱備用。用miRNA提取試劑盒提取RNA，并檢測(cè)RNA質(zhì)量(A260/A280 為1.8～2.1)。通過Taqman miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA獲得cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書，以cDNA為反應(yīng)模板，依次加入上下游引物、2×SYBR green PCR Master Mix以及無RNase雙蒸水，配置成反應(yīng)體系。在ABI公司7300 PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)2次。采用2-ΔΔct法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同消退程度患者治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g表達(dá)比較 43例患者經(jīng)治療后TRG1級(jí)9例、2級(jí)9例、3級(jí)17例、4級(jí)6例、5級(jí)2例；消退良好組18例，無明顯消退組25例。患者治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 兩組治療前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相對(duì)表達(dá)量比較

注：與無明顯消退組比較，*P<0.05。

2.2 miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g對(duì)放化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制ROC曲線，見圖1。miRNA has-let-7e的AUC(0.760)大于miRNA has-let-7a(0.551)、miRNA has-let-7g(0.560)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，miRNA has-let-7a與miRNA has-let-7g的AUC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

圖1 miRNA has-let-7a、-7e及-7g預(yù)測(cè)直腸癌

3 討論

新輔助治療可以視為腫瘤患者腫瘤細(xì)胞的減量治療，包括術(shù)前化療或者術(shù)前化療與放療相結(jié)合，其能夠減小患者的腫瘤負(fù)荷，提高腫瘤患者手術(shù)完全切除率。XELOX已經(jīng)成為直腸癌化療一線治療方案的首選，是進(jìn)展期直腸癌患者一種新的輔助治療手段。與術(shù)后放化療比較發(fā)現(xiàn)，新輔助放化療可以減少放化療毒副反應(yīng)、改進(jìn)直腸癌局部控制、增加保肛率并且延長(zhǎng)患者的無進(jìn)展生存時(shí)間。但由于患者個(gè)體差異較大，新輔助放化療的治療效果差異也比較大。個(gè)體的遺傳因素是導(dǎo)致個(gè)體治療敏感性的重要因素[13]。研究表明，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)為腫瘤信號(hào)通路異常。通過檢測(cè)分析患者腫瘤信號(hào)通路基因的表達(dá)水平，可以獲得腫瘤放化療耐受或敏感的分子標(biāo)志物，利用這些分子標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)新輔助放化療的治療敏感性，加強(qiáng)患者的個(gè)體化治療[14]。同時(shí)研究也表明，腫瘤患者血漿中游離的DNA、RNA及某些基因突變與腫瘤組織保持著高度的一致性，因此外周血腫瘤標(biāo)志物的篩選是目前腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。基于腫瘤分子標(biāo)志物可以優(yōu)化患者的個(gè)體治療，也是目前腫瘤治療的趨勢(shì)[15]。miRNA是高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。miRNA非常穩(wěn)定，在劇烈條件下，如高溫、驟冷、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，都很難發(fā)生降解，同時(shí)期可以抵御由于RNA酶導(dǎo)致的降解。因此miRNA作為新的分子標(biāo)志物將為腫瘤患者的早期診療提供全新的手段。

目前僅有少量研究探討循環(huán)miRNA在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌新輔助放化療療效的預(yù)測(cè)作用。miRNA has-let-7a、-7e、-7g可能為預(yù)測(cè)直腸癌新輔助放化療效果的因子[16,17]，但研究樣本量有限。在本研究中，我們納入43例直腸癌患者，檢測(cè)新輔助放化療前血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA has-let-7e表達(dá)水平與療效相關(guān)，miRNA has-let-7e高表達(dá)的直腸癌患者，新輔助放化療效果差；ROC曲線也顯示其對(duì)療效預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度較高。未來需要更多前瞻性研究就miRNA has-let-7e對(duì)直腸癌新輔助放化療的預(yù)測(cè)作用進(jìn)行驗(yàn)證。

[1] Siegel R, Desantis C, Jemal A. Colorectal cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014,64(2):104-117.

[2] Sauer R, Becker H, Hohenberger W, et al. Preoperative versus postoperative chemoradiotherapy for rectal cancer[J]. N Engl J Med, 2004,351(17):1731-1740.

[3] Maas M, Nelemans PJ, Valentini V, et al. Long-term outcome in patients with a pathological complete response after chemoradiation for rectal cancer: a pooled analysis of individual patient data[J]. Lancet Oncol, 2010,11(9):835-844.

[4] Crotti S, Enzo MV, Bedin C, et al. Clinical predictive circulating peptides in rectal cancer patients treated with neoadjuvant chemoradiotherapy[J]. J Cell Physiol, 2015,230(8):1822-1828.

[5] Gearhart SL, Frassica D, Rosen R, et al. Improved staging with pretreatment positron emission tomography/computed tomography in low rectal cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2006,13(3):397-404.

[6] Molinari C, Casadio V, Foca F, et al. Gene methylation in rectal cancer: predictive marker of response to chemoradiotherapy[J]. J Cell Physiol, 2013,228(12):2343-2349.

[7] D′Angelo E, Vicentini C, Agostini M, et al. MicroRNAs as tools and effectors for patient treatment in gastrointestinal carcinogenesis[J]. Curr Drug Targets, 2015,16(4):383-392.

[8] Vandenboom Li TG, Li Y, Philip PA, et al. MicroRNA and Cancer: tiny molecules with major implications[J]. Curr Genomics, 2008,9(2):97-109.

[9] D′Angelo E, Fassan M, Maretto I, et al. Serum miR-125b is a non-invasive predictive biomarker of the pre-operative chemoradiotherapy responsiveness in patients with rectal adenocarcinoma[J]. Oncotarget, 2016,7(19):28647-28657.

[10] Perilli L, Vicentini C, Agostini M, et al. Circulating miR-182 is a biomarker of colorectal adenocarcinoma progression[J]. Oncotarget, 2014,5(16):6611-6619.

[11] Vicentini C, Fassan M, D′Angelo E, et al. Clinical application of microRNA testing in neuroendocrine tumors of the gastrointestinal tract[J]. Molecules, 2014,19(2):2458-2468.

[12] Mandard AM, Dalibard F, Mandard JC, et al. Pathologic assessment of tumor regression after preoperative chemoradiotherapy of esophageal carcinoma. Clinicopathologic correlations[J]. Cancer, 1994,73(11):2680-2686.

[13] Roh MS, Colangelo LH, O′Connell MJ, et al. Preoperative multimodality therapy improves disease-free survival in patients with carcinoma of the rectum: NSABP R-03[J]. J Clin Oncol, 2009,27(31):5124-5130.

[14] Saif MW, Chu E. Biology of colorectal cancer[J]. Cancer J, 2010,16(3):196-201.

[15] Fleischhacker M, Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer--a survey[J]. Biochim Biophys Acta, 2007,1775(1):181-232.

[16] Salendo J, Spitzner M, Kramer F, et al. Identification of a microRNA expression signature for chemoradiosensitivity of colorectal cancer cells, involving miRNAs-320a, -224, -132 and let7g[J]. Radiother Oncol, 2013,108(3):451-457.

[17] Hotchi M, Shimada M, Kurita N, et al. microRNA expression is able to predict response to chemoradiotherapy in rectal cancer[J]. Mol Clin Oncol, 2013,1(1):137-142.

袁海成(E-mail:yuanhaicheng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.030

R735.37

B

1002-266X(2017)05-0089-03

2016-11-14)