飼料中精氨酸水平對雜交鱘幼魚腸道消化酶活性及形態(tài)結構的影響

王連生,吳俊光、2,徐奇友,王常安,李晉南,趙志剛,羅亮,都雪

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所,黑龍江哈爾濱150070;2.上海海洋大學水產與生命學院,上海201306)

飼料中精氨酸水平對雜交鱘幼魚腸道消化酶活性及形態(tài)結構的影響

王連生1,吳俊光1、2,徐奇友1,王常安1,李晉南1,趙志剛1,羅亮1,都雪1

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所,黑龍江哈爾濱150070;2.上海海洋大學水產與生命學院,上海201306)

為研究飼料中不同水平精氨酸 (arginine,Arg)對雜交鱘Acipenser schrenckii♀×Acipenser baeri♂幼魚腸道消化酶活性及形態(tài)結構的影響,以0.3%為梯度,配制精氨酸水平為1.74%～3.54%(干物質)的7種等氮、等能飼料,實際精氨酸水平分別為1.76%、2.05%、2.36%、2.64%、2.93%、3.24%和3.53%。選取初始體質量為 (3.63±0.08)g的健康雜交鱘幼魚630尾,隨機分成7組,每組設3個平行,每缸30尾魚,養(yǎng)殖周期為8周。結果表明:與1.76%精氨酸對照組相比,2.64%和2.93%精氨酸組雜交鱘前腸蛋白酶活力顯著提高 (P＜0.05),2.36%、2.64%、2.93%和3.24%精氨酸組前腸淀粉酶活力顯著提高 (P＜0.05),2.36%、2.64%和2.93%精氨酸組中腸蛋白酶活力顯著提高 (P＜0.05),各腸段中脂肪酶活力隨飼料中精氨酸水平的增加均表現(xiàn)出升高趨勢,但無顯著性差異 (P＞0.05);與1.76%精氨酸組相比, 2.36%、2.64%和2.93%精氨酸組前腸皺襞高度和肌層厚度顯著增加 (P＜0.05),2.93%精氨酸組前腸絨毛高度顯著增加 (P＜0.05),2.64%、2.93%和3.24%精氨酸組中腸皺襞高度顯著增加 (P＜0.05)。研究表明,飼料中添加適宜水平的精氨酸,對提高雜交鱘幼魚腸道內消化酶活性和促進腸道形態(tài)結構發(fā)育均具有積極作用,可提高營養(yǎng)物質在雜交鱘幼魚腸道內的消化和吸收,并促進其生長。

精氨酸;雜交鱘;消化酶;腸道形態(tài)

對多種魚類的研究已經證明,精氨酸是魚類10種必需氨基酸之一[1]。飼料中缺少任何一種必需氨基酸均會影響蛋白的合成,抑制魚類生長[2]。精氨酸作為魚類中功能性的必需氨基酸,在魚類的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。精氨酸是肌酸、多胺、一氧化氮 (NO)等活性物質合成的前體物,同時,它還參與尿素循環(huán)中的氮代謝,并能刺激生長激素和胰島素分泌[1,3]。在對硬骨魚類的研究中發(fā)現(xiàn),其體內存在完整的尿素循環(huán)體系[4],這表明硬骨魚類自身存在合成精氨酸的潛力[5]。

腸道中的消化酶分為蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶3種。腸道作為魚類消化和吸收營養(yǎng)物質的主要場所,其消化酶活性的高低和形態(tài)結構發(fā)育直接影響魚類的生長速度。近年來研究表明,精氨酸及代謝產物能提高腸道中消化酶的活性、促進腸道形態(tài)結構的發(fā)育,從而提高魚類的生長速度[6-8]。Zhou等[7]在對黑鯛Acauthopagrus schlegelii幼魚的研究中發(fā)現(xiàn),精氨酸可以促進魚體前腸胰蛋白酶和淀粉酶的活力,以及中腸胰蛋白酶活力。Cheng等[8]在對石首魚Sciaenops ocellatus的研究中發(fā)現(xiàn),飼料中添加1%精氨酸可以提高魚體前腸皺襞高度、上皮細胞高度和微絨毛高度,以及中腸皺襞高度和微絨毛高度。目前,關于精氨酸能提高腸道消化酶活性和促進腸道形態(tài)結構發(fā)育的研究,在哺乳動物和一些魚類中已經得到證明,但對鱘魚的研究尚未見報道。鱘魚是世界上最古老的硬骨魚類之一,全身是寶,味道鮮美,是一種非常珍貴的水產品,用其卵做成的魚籽醬更是世界名肴,鱘魚具有較高的營養(yǎng)價值。當前,鱘魚養(yǎng)殖總產量也在逐年上升。本研究中,以西伯利亞鱘和施氏鱘的雜交鱘Acipenser schrenckii♀×Acipenser baeri♂幼魚為研究對象,研究了飼料中不同水平精氨酸對魚體腸道消化酶活性及腸道形態(tài)結構的影響,以期為鱘魚人工飼料的科學配制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚購自北京房山鱘魚繁育中心,養(yǎng)殖于基地車間內可控溫水循環(huán)系統(tǒng)中。

精氨酸購自上海鼓臣生物技術有限公司,純度≥98%。組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸均購自北京惠康源生物科技有限公司,純度≥98%。所有氨基酸均為L-型氨基酸。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 飼料配方中蛋白源為進口魚粉、次粉、豆粕和玉米蛋白粉,主要脂肪源為魚油、大豆磷脂和豆油,用非必需氨基酸混合物來替代精氨酸,配制成7種粗蛋白質水平為40%、粗脂肪水平為10%的等氮、等能飼料。L-精氨酸的添加量分別為0(對照)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%和1.8%,測得7種飼料中精氨酸水平分別為 1.76% (對照)、2.05%、2.36%、2.64%、2.93%、3.24%和3.53%。試驗飼料配方組成見表1,營養(yǎng)成分見表2。先將飼料原料粉碎過80目篩,稱重,按照配方先將大料混合均勻,再加入小料混合,然后加入油脂混合均勻,最后加入適宜比例的水,混合均勻后用小型制粒機擠壓成顆粒飼料,風干后裝袋,于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗缸水容量為160 L,用增氧機增氧,保證溶解氧大于5 mg/L,保持自然光照,試驗期間水溫控制在 (22±1)℃。試驗前,先用3%鹽水對魚體消毒3～5 min,然后放入暫養(yǎng)池中馴化2周,從中挑選體表無傷、活力旺盛、平均體質量為 (3.63±0.08)g的雜交鱘幼魚630尾,隨機分成7組,每組設3個平行,每缸放30尾魚。每天人工飽食投喂4次,并記錄投喂量,每次投喂結束半小時后,吸取水體中的殘餌和糞便,以保持水質清澈,養(yǎng)殖試驗周期為2周。

表1 飼料配方 (干物質基礎)[9]Tab.1 Formulation of trial diets(dry matter basis)[9]w/%

表2 飼料營養(yǎng)成分 (風干基礎)Tab.2 Proximate composition of the trial diets(air dry basis) w/%

1.2.3 樣品的采集與處理 試驗結束后停止喂食24 h,從每缸隨機取3尾魚于冰盤上解剖,分離腸道 (前腸是胃和幽門盲囊與十二指腸連接處,呈“乙”狀彎曲,先從右往左拐,后又形成一個彎曲為中腸部分,中腸與前腸相比比較細且較短,腸管的最后一個彎曲處為中腸和后腸的分界點,十二指腸后面較粗的瓣腸部分即為后腸[9-11]),將樣品暫存于冰箱 (-20℃)中用于腸道消化酶活力的測定。另從每組取3尾魚分離腸段,并從各腸段中部取1 cm左右放入Bouin固定液中,制作腸道切片。

1.2.4 指標的測定

(1)腸道消化酶活性的測定。先將各腸道組織稱重,再加入9倍生理鹽水后用勻漿機磨成勻漿,之后用離心機分離上清液,即得待測樣品。

采用福林-酚 (Folin-phenol)法[12]測定蛋白酶活性。采用南京建成生物工程有限公司試劑盒測定淀粉酶和脂肪酶活性。在測定消化酶活性時,每個平行做一次重復以減少誤差。

(2)腸道切片的制作及形態(tài)結構觀察。將Bouin氏液中固定的腸道樣本依次通過石蠟包埋、切片機切片、H.E染色等步驟制成組織切片,再用Motic顯微圖像系統(tǒng) (Motic Images Plus 2.0軟件)觀察腸道形態(tài)結構變化[13](單位μm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0軟件進行單因素(ANOVA)方差分析,用Duncan's方法對組間差異進行多重比較,試驗結果以平均值±標準差(mean±S.D.)來表示。顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同精氨酸水平下雜交鱘幼魚腸道消化酶活力的變化

從表3可見:不同水平的精氨酸中,與1.76%精氨酸對照組相比,2.64%精氨酸組顯著提高了前腸蛋白酶活力 (P＜0.05),2.64%、2.93% 和3.24%精氨酸組顯著提高了前腸淀粉酶活力(P＜0.05);2.36%、2.64%和2.93%精氨酸組顯著提高了中腸蛋白酶活力 (P＜0.05);飼料中精氨酸水平對中腸淀粉酶活力、后腸蛋白酶活力和淀粉酶活力均無顯著性影響 (P＞0.05);各段腸道中脂肪酶活力隨飼料中精氨酸水平的增加均表現(xiàn)出升高的趨勢,但無顯著性差異 (P＞0.05)。

表3 飼料中精氨酸水平對雜交鱘幼魚腸道消化酶活力的影響 (n=9)Tab.3 Effects of dietary arginine levels on intestinal digestive enzyme activities of juvenile hybrid sturgeon U/g

2.2 不同精氨酸水平下雜交鱘幼魚腸道形態(tài)結構的變化

從表4可見:與1.76%精氨酸對照組相比, 2.36%、2.64%和2.93%精氨酸組顯著增加了雜交鱘幼魚前腸皺襞高度和肌層厚度 (P＜0.05), 2.64%精氨酸組顯著增加了前腸絨毛高度 (P＜0.05);2.64%、2.93%和3.24%精氨酸組顯著提高了中腸皺襞高度 (P＜0.05);飼料中不同水平的精氨酸對雜交鱘幼魚中腸絨毛高度、肌層厚度和后腸的形態(tài)結構均未有顯著影響 (P＞0.05)。

3 討論

3.1 精氨酸對雜交鱘幼魚腸道消化酶活力的影響

魚類消化食物和吸收營養(yǎng)物質的主要場所是腸道,機體正常的生長代謝和飼料中營養(yǎng)物質的消化與腸道中消化酶活性的高低關系密切[14]。相關研究也指出,動物機體生長與消化酶活性存在一定的正相關關系[15]。本研究表明,飼料中適宜的精氨酸水平顯著提高了雜交鱘幼魚前腸和中腸蛋白酶活力,以及前腸淀粉酶活力。Zhou等[7]對黑鯛幼魚的研究發(fā)現(xiàn),外源精氨酸能提高胃、前腸和中腸胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力,同時可以提高胃和前腸中淀粉酶的活力,進而提高飼料的消化和吸收率。Lin等[16]在對建鯉幼魚的研究中發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺可以促進魚體腸道中蛋白酶和脂肪酶的活性。本試驗結果與其相近,這說明飼料中適宜水平的精氨酸可以提高腸道內消化酶的活性,促進腸道對營養(yǎng)物質的消化吸收,進而促進魚體的生長。

表4 飼料中精氨酸水平對雜交鱘幼魚腸道形態(tài)結構的影響 (40×10倍光鏡)(n=9)Tab.4 Effects of dietary arginine levels on intestine morphology of juvenile hybrid sturgeon(40×10) μm

3.2 精氨酸對雜交鱘幼魚腸道形態(tài)結構的影響

魚體的生長狀況不僅僅取決于腸道內消化酶的活性,其腸道本身形態(tài)結構的發(fā)育也是至關重要的。腸道絨毛高度和皺襞高度越高,表明吸收養(yǎng)分的表面積越大,越有利于魚體的生長。因此,腸道的絨毛高度和皺襞高度是反映機體腸道發(fā)育狀況和吸收功能的重要指標[17]。

飼料中添加外源性精氨酸促進魚類的生長,一方面是由于精氨酸能提高胃和腸道中消化酶的活性,進而提高飼料的消化和吸收率,另一方面是由于精氨酸能夠改善魚腸道的形態(tài)結構。Cheng 等[18]對雜交條紋鱸的研究表明,添加1%外源精氨酸能提高腸道末端絨毛高度和腸上皮細胞高度,添加2%精氨酸能提高腸道中段和末端褶皺高度。葉沙舟等[19]對黃顙魚幼魚的研究表明,飼料中添加0.2%和0.4%的谷氨酰胺,魚體腸道絨毛高度和皺襞高度增加,但肌層厚度降低。在對美國紅魚的研究中發(fā)現(xiàn),1%精氨酸可提高魚體前腸皺襞高度、上皮細胞和微絨毛高度,以及中腸皺襞和微絨毛高度[8]。本研究表明,飼料中添加適宜水平的精氨酸能顯著提高雜交鱘幼魚中腸的皺襞高度和前腸的絨毛高度、皺襞高度和肌層厚度。已有研究表明,谷氨酰胺可以促進魚體的腸道發(fā)育,增加腸道的絨毛高度[13],而谷氨酰胺是精氨酸在體內分解代謝的產物,由此可知,精氨酸促進魚體腸道形態(tài)結構的發(fā)育與谷氨酰胺有關[20]。谷氨酰胺是腸道細胞發(fā)育的能量代謝底物,具有維持腸道免疫、防止腸絨毛萎縮、改善腸道健康和促進生長的作用[21-22]。腸黏膜需要谷氨酰胺來支持其代謝活動,從而維持小腸結構的完整性和功能的正常發(fā)揮[23-25]。在適宜范圍內,隨著飼料中精氨酸的增加,其代謝產生的谷氨酰胺含量也相應增加,從而增加腸黏膜的功能性表面積,提高營養(yǎng)物質的吸收率,促進魚類生長。

綜上所述,飼料中精氨酸水平為 2.36%、2.64%和2.93%時,對提高雜交鱘幼魚腸道消化酶活性和形態(tài)結構發(fā)育均有促進作用,且添加水平為2.64%時效果最佳。

[1] NRC.Nutrient Requirements of Fish and Shrimps[M].Washington,DC,USA:National Academy Press,2011:67-68.

[2] Masagounder K,Hayward R S,Firman J D.Comparison of dietary essential amino acid requirements determined from group-housed versus individually-housed juvenile bluegill,Lepomis macrochirus [J].Aquaculture Nutrition,2011,17(2):e559-e571.

[3] 萬軍利,麥康森,艾慶輝.魚類精氨酸營養(yǎng)生理研究進展[J].中國水產科學,2006,13(4):679-685.

[4] Huggins A K,Skutsch G,Baldwin E.Ornithine-urea cycle enzymes in teleostean fish[J].Comparative Biochemistry and Physiology,1969,28(2):587-602.

[5] Chiu Y N,Austic R E,Rumsey G L.Effect of feeding level and dietary electrolytes on the arginine requirement of rainbow trout (Salmo gairdneri)[J].Aquaculture,1988,69(1-2):79-91.

[6] 譚碧娥,李新國,孔祥峰,等.精氨酸對早期斷奶仔豬腸道生長、組織形態(tài)及IL-2基因表達水平的影響[J].中國農業(yè)科學,2008,41(9):2783-2788.

[7] Zhou F,Zhou J,Shao Q J,et al.Effects of arginine-deficient and replete diets on growth performance,digestive enzyme activities and genes expression of black sea bream,Acanthopagrus schlegelii,juveniles[J].Journal of the World Aquaculture Society,2012,43 (6):828-839.

[8] Cheng Z Y,Buentello A,Gatlin III D M G.Effects of dietary arginine and glutamine on growth performance,immune responses and intestinal structure of red drum,Sciaenops ocellatus[J].Aquaculture,2011,319(1-2):247-252.

[9] 張小谷,洪一江,汪洪.四種淡水魚類前腸的組織學比較研究[J].南昌大學學報:理科版,1999,23(4):339-342.

[10] 曲秋芝,華育平,曾朝輝,等.史氏鱘消化系統(tǒng)形態(tài)學與組織學觀察[J].水產學報,2003,27(1):1-6.

[11] 徐雪峰.中華鱘消化系統(tǒng)的發(fā)育及消化酶活性變化的研究[D].武漢:華中農業(yè)大學,2006.

[12] 中山大學生物系生化微生物學教研室.生化技術導論[M].北京:人民教育出版社,1979:53-54.

[13] 李晉南,徐奇友,王常安,等.谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道形態(tài)的影響[J].動物營養(yǎng)學報, 2014,26(5):1347-1352.

[14] Pinkus L M,Berkowitz J M.Utilization of glutamine by canine pancreas in vivo and acinar cells in vitro[J].Fed Proc,1980,39: 1902-1903.

[15] 葉元土,張勇,張宇,等.酶制劑EA-II和生物制劑BA-I對鯉腸道、肝胰臟的蛋白酶和淀粉酶活力的影響[J].大連水產學院學報,1993,8(1):79-82.

[16] Lin Y,Xiao Q Z.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture,2006,256(1-4):389-394.

[17] 王蕾,劉堅,侯永清,等.α-酮戊二酸對LPS慢性應激仔豬小腸黏膜形態(tài)與功能的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報,2010,41(1): 46-52.

[18] Cheng Z Y,Gatlin III D M,Buentello A.Dietary supplementation of arginine and/or glutamine influences growth performance,immune responses and intestinal morphology of hybrid striped bass (Morone chrysops×Morone saxatilis)[J].Aquaculture,2012, 362-363:39-43.

[19] 葉沙舟,張杰,陳海敏,等.谷氨酰胺對黃顙魚幼魚生長性能、腸道形態(tài)及非特異性免疫相關基因表達的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2016,28(2):468-476.

[20] 陳迪,王連生,徐奇友.α-酮戊二酸對雜交鱘腸道形態(tài)、消化酶活力和抗氧化能力的影響[J].大連海洋大學學報,2015, 30(4):363-368.

[21] 張軍民,高振川,王連娣,等.谷氨酰胺對飼喂生大豆的仔豬抗氧化能力和肝、腸組織中γ-谷氨酰轉肽酶活性的影響[J].中國農業(yè)科學,2003,36(5):567-572.

[22] 郭榮富.谷氨酰胺對隔離早期斷奶仔豬的營養(yǎng)生理效應研究[D].雅安:四川農業(yè)大學,2003.

[23] 于永祥,楊乃眾,王杉,等.胃腸道手術后腸內、腸外營養(yǎng)的療效對比[J].普外臨床,1995,10(2):87-89.

[24] 周玉香,張培松,盧德勛,等.谷氨酰胺對犢牛骨骼肌和小腸黏膜蛋白質及其DNA和RNA含量的影響[J].畜牧與獸醫(yī), 2010,42(1):17-20.

[25] Inoue Y,Grant J P,Snyder P J.Effect of glutamine-supplemented total parenteral nutrition on recovery of the small intestine after starvation atrophy[J].Journal of Parenteral and Enteral Nutrition,1993,17(2):165-170.

Effects of dietary arginine levels on intestinal digestive enzyme activity and morphology in juvenile hybrid sturgeon

WANG Lian-sheng1,WU Jun-guang1,2,XU Qi-you1,WANG Chang-an1,LI Jin-nan1, ZHAO Zhi-gang1,LUO Liang1,DU Xue1

(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

A total of 630 juvenile hybrid sturgeon Acipenser schrrenckii♀×A.baeri♂with an average initial body weight of(3.63±0.08)g were randomly divided into 7 groups with 3 replicates per group and 30 fish per replicate and fed seven isonitrogenous and isolipidic diets containing arginine levels ranging from 1.74%to 3.54%(dry matter)in approximately 0.3%increments,and actual dietary arginine levels of 1.76%,2.05%,2.36%, 2.64%,2.93%,3.24%and 3.53%for 8 weeks to study the effects of dietary arginine levels on intestinal digestive enzyme activities and morphology of juvenile hybrid sturgeon.The results showed that there was significantly higher activity of foregut protease in 2.64%and 2.93%groups than that in 1.76%group(P＜0.05),and that significantly higher activity of foregut amylase in 2.36%,2.64%,2.93%and 3.24%groups than that in 1.76% group(P＜0.05).The activity of midgut protease in 2.36%,2.64%and 2.93%groups was shown to be increased with increase in dietary arginine levels,without significant difference(P＞0.05).The hybrid sturgeon in 2.36%,2.64%and 2.93%groups had significantly higher fold height and muscular thickness of foregut than the hybrid sturgeon in 1.76%group(P＜0.05),with significantly higher villus width in foregut of the juveniles in 2.93%group(P＜0.05).The hybrid sturgeon in 2.64%,2.93%and 3.24%groups had significantly higher fold height in midgut than the juveniles in 1.76%group did(P＜0.05).In conclusion,appropriate dietary arginine level leads to improve the digestion and absorption of intestinal nutrients due to increase in intestinal digestive enemy activity and to improvement of intestinal morphology.

arginine;hybrid sturgeon;digestive enzyme;intestinal morphology

S963.7

:A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.009

2095-1388(2017)01-0051-05

2016-04-27

中國水產科學研究院黑龍江水產研究所基本科研業(yè)務費專項 (HSY201408);國家公益性行業(yè) (農業(yè))科研專項 (201003055)

王連生 (1984—),男,博士,助理研究員。E-mail:liansheng0429@163.com