一株鵝源鴨甲肝病毒1型的分離及A GP和RT-PCR鑒定

季艷菊，張偉，王林川

（1.惠州工程技術(shù)學(xué)校，廣東 惠州 516001；2.惠東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 惠東 516300；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

一株鵝源鴨甲肝病毒1型的分離及A GP和RT-PCR鑒定

季艷菊1，張偉2，王林川3*

（1.惠州工程技術(shù)學(xué)校，廣東 惠州 516001；2.惠東縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 惠東 516300；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

鴨甲肝病毒性肝炎是一種主要針對(duì)雛鴨感染的發(fā)病急、致死性高和傳播迅速的病毒病，以肝臟腫大、出血為主要病變特征。本文從一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的病死雛鵝肝脾臟中分離到1株病毒，進(jìn)行動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn)，使人工攻毒雛鵝發(fā)病復(fù)制出與自然發(fā)病雛鵝相似的角弓反張及肝臟腫大出血的主要病征，即證實(shí)該分離毒株為此次鵝自然發(fā)病的致病原。后利用AGP和RT-PCR方法均鑒定出該分離毒株為鴨甲肝病毒1型，從而進(jìn)一步佐證了國內(nèi)近些年來先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)可使雛鵝發(fā)生與雛鴨相似臨床癥狀和剖檢病理變化的鵝源鴨甲肝病毒性肝炎。啟示養(yǎng)鵝業(yè)以后也要注意鴨甲肝炎的防控，特別是在鴨鵝混養(yǎng)的地區(qū)。

鵝源；鴨甲肝病毒I型；分離；鑒定

鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是一種發(fā)病急、致死性高和傳播迅速的傳染病，為鴨主要傳染病之一。該病早先有3個(gè)血清型，即DHV-I、DHV-II和DHV-III。后DHV-II和DHV-III被歸為星狀病毒科成員[1]。而同屬于小RNA病毒科的DHV-I、臺(tái)灣和韓國發(fā)現(xiàn)的新型DHV分別被命名DHV-A、DHV-B和DHV-C，其中DHV-B僅臺(tái)灣有病例報(bào)告過，DHV-C目前僅在中國大陸與韓國報(bào)告過[2]。為了避免混淆，后又將DHV-A、DHV-B和DHV-C統(tǒng)稱鴨甲肝病毒，則又有A型鴨甲肝病毒、B型鴨甲肝病毒和C型鴨甲肝病毒之稱[3]。

根據(jù)2012年最新出版的國際病毒分類委員會(huì)第九次分類報(bào)告，將DHV-I、臺(tái)灣型鴨肝炎病毒、韓國型鴨肝炎病毒分別定名為鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)、鴨甲肝病毒2型(DHAV-2)和鴨甲肝病毒3型(DHAV-3)，它們同屬于微RNA病毒目微RNA病毒科禽肝炎病毒屬成員[4]。

鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)，即經(jīng)典的DHV-I，現(xiàn)仍呈世界性分布，主要侵害3周齡以內(nèi)雛鴨，傳播迅速，病鴨多呈“角弓反張”姿勢(shì)，以肝腫大且斑點(diǎn)狀出血為特征，死亡率達(dá)90%以上，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害極大。而國內(nèi)近些年來，也先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型還給同為水禽的鵝產(chǎn)業(yè)帶來不小的沖擊。它常發(fā)生于孵化季節(jié)，主要侵害 5～30日齡的雛鵝，且傳播迅速，成鵝不易感，主要病理特征是肝腫大，并有出血點(diǎn)[5-14]。

2016年4月份，廣東省粵東某縣的一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的一批19日齡雛鵝出現(xiàn)精神萎靡、不喜走動(dòng)，2～3d后大批出現(xiàn)“角弓反張”姿勢(shì)的陣發(fā)性抽搐并死亡，第5天達(dá)發(fā)病死亡高峰期，后統(tǒng)計(jì)到此發(fā)病率為31%，死亡率19%，對(duì)病死鵝剖檢病變?yōu)楦文[大、點(diǎn)狀出血，該場(chǎng)同時(shí)飼養(yǎng)有50多日齡和60多日齡番鴨各一批，雖未發(fā)病，但了解到場(chǎng)里有鴨甲肝病發(fā)病史。通過雛鵝發(fā)病的臨床癥狀及解剖病理變化等，初步懷疑雛鵝感染DHAV。本文作者通過采集1份疑似感染DHAV的病鵝肝臟，接種鴨胚，從致死胚中分離獲得1株病毒(暫命名為GHZ16)，并先后經(jīng)過AGP和 RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，確診造成鵝發(fā)病死亡的病原為鵝源鴨甲肝病毒I型。

1 材料

1.1 病料 病料取自廣東省粵東某縣的一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的疑似鴨甲肝典型臨床癥狀和病理變化的病死鵝的肝、脾臟組織。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 9日齡無DVH免疫番鴨胚，購自惠州惠東某種鴨場(chǎng)；1日齡無DVH母源抗體的雛鵝，購自惠州博羅某種鵝場(chǎng)。

1.3 DHAV-1兔高免血清 由廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室家禽病毒病研究分室提供。

1.4 試 劑 ViraPrepTM MammalKit： 購 自MaxyBio公司，Trizol Reagent購自 Invitrogen上海有限責(zé)任公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Tag DNA聚合酶購自 Fements公司，dNTP Mixture、DNA marker DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖為0XIOD公司產(chǎn)品，DEPC購自北京鼎國公司，磷酸緩沖鹽溶液、普通瓊脂平板等自行配制。

2 方法

2.1 病毒的分離 將采取的具有疑似DVH典型臨床癥狀和病理變化的病死鵝的肝、脾臟組織，按照 1:5～10（g/ml）比例加入無菌生理鹽水，充分剪碎研磨并反復(fù)凍融三次，后6000r/min離心10min，取上清，加入2000IU/ml雙抗（青、鏈霉素）處理，置于4℃冰箱過夜，通過尿囊腔接種9日齡無DVH免疫番鴨胚，0.2ml/枚，接種10枚，37℃恒溫傳代培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)無菌生理鹽水注射10枚番鴨胚對(duì)照組，每日照胚2次，棄去24h內(nèi)死亡的，將24h～96h內(nèi)死亡的放于4℃過夜，回收尿囊液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒的純化

2.2.1 病毒的傳代 將鴨胚尿囊液經(jīng)無菌處理，再次接種9日齡的健康番鴨胚(0.2ml/枚)，接種10枚，同時(shí)設(shè)立無菌生理鹽水對(duì)照組，盲傳 3代，將病毒進(jìn)行初步純化，收集死胚尿囊液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 濃縮、純化試劑處理 將傳代的初步純化病毒尿囊液以3000r/min，4℃離心30min，取上清液；再以10000r/min，4℃離心30min，取上清。后經(jīng)透析袋透析濃縮為原體積的1/4～1/5。

濃縮病毒液用ViraPrepTM Mammal Kit處理：將一定體積濃縮病毒液，加入等體積的BUFFER 1,反復(fù)顛倒混勻；再加入1/4原濃縮病毒液體積的VIRAFFINITY,反復(fù)顛倒混勻，于室溫放置5min。室溫1000r/min離心10min，棄上清；沉淀用原體積的BUFFER 1重懸，室溫1000r/min，重復(fù)操作兩次；加3倍原體積的BUFFER 2，若需要最小的稀釋，則用1倍原體積BUFFER 2，反復(fù)顛倒混勻，沉淀完全溶解后，用離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速離心10min，收集上清；此上清即為純化好的病毒液。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 病毒的鑒定

2.3.1 動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn) 選擇無鴨病毒性肝炎母源抗體的1日齡雛鵝 20只，分為2組，10只/組。A組將2.2.2獲得的純化病毒液采取腿部肌注進(jìn)行攻毒，攻毒量為0.5ml/只；B組為生理鹽水對(duì)照。兩組試驗(yàn)鴨分開隔離飼養(yǎng)。每日觀察記錄病死情況，并剖檢死鵝且記錄剖檢變化。

2.3.2 AGP鑒定 取普通瓊脂平板，中間孔加入

2.2.2濃縮、純化的病毒液，周圍孔加入依次 20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5稀釋的兔高免血清， 后先將瓊脂板正放入濕盒并 37℃作用 1h,再倒放于 37℃作用12～36h，觀察AGP結(jié)果。

2.3.3RT-PCR鑒定

2.3.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照馬秀麗[15]的方法由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成鑒定DHAV-1的引物，其擴(kuò)增長度為199bp。上游引物為：5'-CACCCATCACCATTCTATAAGC-3'；下游引物為：5'-GGGGAGACCAAACGACAA-3'。使用前,用DEPC水溶解成20pmol/μl溶液，小量分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3.2 病毒RNA提取 參照Trizol法提取。取病毒液200μl，加750μl的Trizol溶液充分振蕩，室溫作用 10min；后加 200μl氯仿抽提 1次，12, 000rpm離心5min，取上清液；加等體積異丙醇，于室溫作用 10min，12,000rpm離心 5min；沉淀用75%乙醇洗滌，12,000rpm離心5min，取沉淀物；加適量的DEPC水溶解沉淀，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3.3 RT-PCR反應(yīng) RT反應(yīng)體系 （20μl）按如下表1。置于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，M-MLV（5U/μl）1μl于42℃時(shí)加入；反應(yīng)程序：70℃ 5min，42℃ 30min，94℃ 2min。

表1 RT反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系（50μl）按如下表2。置于 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸7min；4℃保存。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠（0.5μg/ml EB）中電泳檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn) 攻毒A組，雛鵝于攻毒后第2天開始發(fā)病，病初表現(xiàn)精神不振，離群不愿走動(dòng)，食欲下降，排黃白或綠色稀糞；第3天出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，雙腳呈痙攣性劃動(dòng)或在地上翻滾、旋轉(zhuǎn)，臨死前多呈角弓反張姿勢(shì)（如圖1），數(shù)小時(shí)后急性死亡。第5天達(dá)發(fā)病死亡高峰期，最后統(tǒng)計(jì)到發(fā)病率為30%，死亡率20%，剖檢特征病變?yōu)楦闻K腫大，表面多有彌漫性出血點(diǎn)或出血斑（如圖 2）。對(duì)照B組，健康未發(fā)病。詳見表3。

圖1 角弓反張

圖2 肝臟腫大且有彌漫性出血點(diǎn)斑

表3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)鴨病死情況

攻毒A組發(fā)病的系列癥狀、剖檢變化與當(dāng)初采集病料時(shí)鵝的臨床發(fā)病及剖檢結(jié)果相似，說明該動(dòng)物攻毒回歸試驗(yàn)成功復(fù)制出鵝自然發(fā)病病例，即分離毒株為鵝自然發(fā)病病例的致病原。

3.2 病毒分離 將病料接種10日齡番鴨胚96h后，番鴨胚全部死亡，陰性對(duì)照未死亡。病料接種死亡番鴨胚體的病變表現(xiàn)為：全身出血與水腫，肝臟腫大且明顯出血點(diǎn)（如圖3）。凍存的胚液繼續(xù)盲傳2代，第3代對(duì)番鴨胚的致死率均為100%。確定了該鵝場(chǎng)的致病原是病毒。

圖3 病毒分離試驗(yàn)對(duì)照?qǐng)D

3.3 病毒的鑒定

3.3.1 AGP鑒定結(jié)果 取瓊脂板，中間孔加入疑似DHV尿囊液，周圍孔加入依次20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5稀釋的兔高免血清，后37℃作用,觀察AGP結(jié)果，說明疑似DHV為DHAV-1。分離毒株的AGP結(jié)果如下圖4。

圖4 AGP結(jié)果

3.3.2 RT-PCR鑒定結(jié)果 利用馬秀麗鑒定DHAV-1的特異引物，對(duì)疑似DHAV毒株進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，結(jié)果能擴(kuò)增到與預(yù)期相符的199bp特異性目的片段（圖5）。說明疑似DHAV為DHAV-1。

圖5 疑似DHAV毒株RT-PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果

4 討論

1950年，由Levine與Fabricant首次分離出鴨甲肝病毒（DHAV）[16]，之后鴨甲肝病毒在許多國家和地區(qū)相繼分離出來。近些年來，鴨甲肝病毒性肝炎的流行病學(xué)特征及其病毒的基因型等發(fā)生了一定的改變，在我國大陸及臺(tái)灣地區(qū)，一些養(yǎng)鴨場(chǎng)有用經(jīng)典的DHAV-I弱毒疫苗或用其高免卵黃抗體免疫注射鴨群后仍發(fā)生典型鴨肝炎的報(bào)道。于是，研究學(xué)者們從臺(tái)灣和韓國病死鴨中分別分離到鴨甲肝病毒 2型 (DHAV-2)和鴨甲肝病毒 3型(DHAV-3)[2]，鴨甲肝病毒2型(DHAV-2)、鴨甲肝病毒3型 (DHAV-3)與經(jīng)典的鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)現(xiàn)同屬于微RNA病毒目微RNA病毒科禽肝炎病毒屬成員，為3個(gè)鴨甲肝病毒不同的基因型[4]。

鴨甲肝炎一般常見發(fā)生于雛鴨，成年種鴨即使在污染的圈舍中也無臨床癥狀，產(chǎn)蛋正常。而國內(nèi)近些年來，也先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)還可使雛鵝發(fā)生與雛鴨相似臨床癥狀和剖檢病理變化的鵝源鴨甲肝炎[5-14]。

本文利用AGP和RT-PCR檢測(cè)方法，從疑似發(fā)生鵝源病毒性肝炎的病死鵝肝脾臟組織中檢測(cè)到DHAV-1型病毒，用鴨胚分離純化得到鴨甲肝炎病毒GHZ16株(DHAV-1型)，及GHZ16株病毒人工感染雛鵝能復(fù)制出與臨床自然病例相似的病例，由此可確診：2016年 4月份，廣東省粵東某縣的一個(gè)鵝鴨混養(yǎng)場(chǎng)的一批19日齡雛鵝暴發(fā)的疾病由DHAV-1型感染所致。

本文證實(shí)鴨甲肝炎病毒1型能自然感染雛鵝發(fā)病，從而進(jìn)一步佐證了國內(nèi)近些年來先后報(bào)道鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)可使雛鵝發(fā)生與雛鴨相似臨床癥狀和剖檢病理變化的鵝源鴨甲肝病毒性肝炎，也導(dǎo)致雛鵝較高的發(fā)病率和死亡率。因此，在雛鵝養(yǎng)殖過程，除加強(qiáng)小鵝瘟等疾病的防控外，也不可忽視鴨甲肝炎病毒感染的危害，特別是在有鴨鵝混養(yǎng)的地區(qū)，以給養(yǎng)鵝業(yè)帶來重要啟示。

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Solation and Identification of Duck Hepatitis Virus A type 1 with Goose-origin

JI Yan-ju1，ZHANG Wei2，WANG Lin-chuan3
(1.Huizhou Engineering and Technology School，Huizhou 516000，China；2.HuidongAnimal Disease Control Center，Huidong 516300，China；3.South China Agricultural University，Guangzhou，510642，China)

Duck hepatitis virus A hepatitis is a major disease in ducks infected with acute and lethal and viral disease spread rapidly, with the enlargement of the liver, bleeding as the main pathological syndrome. In this paper, isolated from a goose and duck polyculture field in the spleen of the dead young goose 1 virus strains were inoculated,animal regression test,the artificial inoculation of gosling incidence to replicate the majorsymp to mssimilarto natural incidence of gosling opposthotonis and enlargement of the liver hemorrhage, which confirmed the pathogen strains for the natural occurrence of goose the.After using AGP and RT-PCR methods were identified in the isolate of duck hepatitis virus Atype 1. Further evidence of China in recent years has reported duck hepatitis virusA type 1(DHAV-1)can make the occurrence of gosling goose duck hepatitis virus hepatitis and ducklings similar clinical symptoms and pathological pathological changes.After the revelation of goose industry should also pay attention to the prevention and control of duck hepatitis A, especially in the area of polyculture duck goose.

goose-origin；Duck Hepatitis Virus A type 1；isolation；identification

S858.332.65

B

1673-1085（2017）02-0030-05

2017-01-14

季艷菊（1980-），女，畜牧獸醫(yī)講師，在讀在職獸醫(yī)專業(yè)博士，從事獸醫(yī)教學(xué)和科技研究工作。研究方向：動(dòng)物傳染病研究，郵箱：weiran809@163.com。

*通訊作者：王林川（1965-），男，教授，博士，研究方向：畜禽疫病病原及其防控研究。