飼料中霉菌毒素檢測(cè)新方法研究

（1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心河北唐山063000；2.中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司北京100012）

飼料中霉菌毒素檢測(cè)新方法研究

蒙君麗1，張志云2

（1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心河北唐山063000；2.中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司北京100012）

近年來隨著國家糧庫糧食的過飽和，老舊糧庫儲(chǔ)存條件差，雨水過多等因素，導(dǎo)致飼料原料霉菌毒素污染嚴(yán)重，因其對(duì)動(dòng)物的危害明顯，使得檢測(cè)量與日俱增。而霉菌毒素的高毒性特點(diǎn)又使得檢測(cè)人員唯恐避之不及，常年接觸高毒性、易揮發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)品是危害檢測(cè)人員安全的重要因素，尋找一種安全、快速、準(zhǔn)確的霉菌毒素檢測(cè)方法迫在眉睫。論文就霉菌毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行了歸納分析，為今后健全霉菌毒素檢測(cè)方法，減輕霉菌毒素對(duì)畜牧業(yè)的危害提供參考依據(jù)。

霉菌毒素；危害；檢測(cè)方法

1 霉菌毒素的危害

霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的高毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前已發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素多達(dá)300～400種。以黃曲霉毒素B1為例，其毒性是砒霜的68倍；玉米赤霉烯酮有很強(qiáng)的雌性激素作用；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇可以引起動(dòng)物的嘔吐；而近年來的研究表明，在多種霉菌毒素的作用下，對(duì)動(dòng)物的傷害是成指數(shù)上升的，嚴(yán)重威脅著人畜健康。

2 霉菌毒素的檢測(cè)方法

為了控制霉菌毒素對(duì)人畜的威脅，各國均出臺(tái)了各種對(duì)霉菌毒素的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)限量。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（Thin layer chromatography,TLC）[1]，該方法的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、對(duì)設(shè)備和檢測(cè)人員要求不高。缺點(diǎn)是精確度低、操作過程復(fù)雜、分析結(jié)果的可重復(fù)性和再現(xiàn)性差，因此TLC方法近年來使用頻率越來越少。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

最具有代表的免疫分析檢測(cè)方法就是酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）。該方法具有檢測(cè)樣本量大，時(shí)間短，效率高等優(yōu)點(diǎn)，但該方法存在重現(xiàn)性較等很多干擾因素[2-3]，因此該方法多用于樣本的快速檢測(cè)或篩查。

2.3 高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）[4]是目前定量檢測(cè)的主要方法。其優(yōu)點(diǎn)是集液相色譜的高分離度和質(zhì)譜檢測(cè)的通用性、可以提供分子結(jié)構(gòu)信息、靈敏度高、選擇性好，為同時(shí)檢測(cè)多種霉菌毒素提供了新的方向。

2.4 膠體金法

免疫膠體金技術(shù)（Immune Colloidal Gold Technique）是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于樣品中待分析物檢測(cè)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，可用于樣品中待檢測(cè)物質(zhì)的快速定性或定量檢測(cè)，是一種穩(wěn)定、靈敏的檢測(cè)方法。

3 膠體金定量檢測(cè)法的優(yōu)勢(shì)

目前，我國國標(biāo)的檢測(cè)方法都是采用免疫親和柱和凈化柱和高壓液相色譜的方法對(duì)霉菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，具有高靈敏度，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但是國標(biāo)方法作為霉菌毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，需要大型設(shè)備，需要購買相應(yīng)的免疫親和柱，前處理過程復(fù)雜，需要配需專業(yè)人員，檢測(cè)成本高，過程復(fù)雜，且檢測(cè)過程中需要接觸高毒性的標(biāo)準(zhǔn)品，不適合常年做大量實(shí)驗(yàn)的監(jiān)督檢測(cè)。

近年來，國際上推出了霉菌毒素定量檢測(cè)條，配合專用的讀數(shù)儀，可以在十幾分鐘內(nèi)完成霉菌毒素的快速定量檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)儀器方法具有較高的吻合度。不僅能夠準(zhǔn)確地提供所檢測(cè)樣品被霉菌毒素污染的程度，也為樣品今后的處置提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，在國際上得到了廣泛的應(yīng)用[5]。

3.1 高效液相色譜法與膠體金定量檢測(cè)法的前處理對(duì)比

以嘔吐毒素為例，高效液相色譜法前處理過程[6]：

1）提?。悍Q取粉碎試樣約50 g（精確到0.1 g）置于250 mL具塞錐形瓶中，加入10 g聚乙二醇及200 mL水，高速均質(zhì)2 min，或振蕩器振蕩60 min。靜置，通過快速定性濾紙過濾，利用玻璃纖維濾紙進(jìn)行1～2次過濾，使濾液澄清，隨即通過免疫親和柱進(jìn)行凈化。

2）凈化：把免疫親和柱與10 mL玻璃定量管進(jìn)行連接。向玻璃定量管中加入1 mL澄清提取液，連接玻璃定量管與空氣壓力泵，調(diào)節(jié)壓力，使溶液以1.8 mL/min的流速通過免疫親和柱，至一部分空氣通過柱體。以5 mL水對(duì)免疫親和柱進(jìn)行1次清洗，棄全部流出液；使5 mL空氣通過免疫親和柱。向柱中加入1 mL甲醇進(jìn)行洗脫，流速為0.8 mL/min，在玻璃試管中收集洗脫液，在45℃條件下用氮吹儀50℃進(jìn)行吹干。用0.5 mL流動(dòng)相對(duì)殘?jiān)M(jìn)行溶解，渦旋混勻，過0.45um濾膜，供液相色譜測(cè)定。

膠體金快速定量法前處理過程[7]：準(zhǔn)確稱量10.00 g試樣于200 mL具塞錐形瓶中，加入50.0 mL水，密閉，用渦旋振蕩器振蕩1～2 min，靜置后用濾紙過濾，貨取1.0～1.5 mL混合液于離心管中，用離心機(jī)（4 000r/min）離心1 min。取濾液或離心后上清液100 uL于另一離心管中，加入1.0 mL稀釋緩沖液（試劑盒自帶），充分混勻待測(cè)。

3.2 高效液相色譜法與膠體金定量檢測(cè)法的檢測(cè)步驟對(duì)比

高效液相色譜法檢測(cè)步驟

1）選定液相色譜測(cè)定條件（全英文操作界面）：①色譜柱：C18柱，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，填料直徑5 um或相當(dāng)者；②流動(dòng)相：量取100 mL乙腈至1 000 mL的容量瓶中，加入水定容至1 000 mL?；旌暇鶆虿⑼ㄟ^0.45 um濾膜；③流速：0.8 mL/min；④檢測(cè)波長：218 nm；⑤進(jìn)樣量：20 uL；⑥柱溫：室溫。

2）色譜測(cè)定：分別取試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作液各20 ul（或相同體積）注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積積分值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以保留時(shí)間定性，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)試樣進(jìn)行定量。

膠體金定量檢測(cè)條檢測(cè)步驟：

1）將膠體金檢測(cè)條從冷藏狀態(tài)（2℃～8℃）取出放置至室溫。將孵育器預(yù)熱至45℃。將檢測(cè)條平放在孵育器凹槽中，打開加樣孔。

2）準(zhǔn)確移取300 uL待測(cè)溶液，加入檢測(cè)條加樣孔中，關(guān)閉加樣孔及孵育器蓋。

3）孵育5min后，取出檢測(cè)條觀察C線（質(zhì)控線）T線（檢測(cè)線）顯色情況。若出現(xiàn)：①C線不出現(xiàn)；②C線出現(xiàn)，但彌散或嚴(yán)重不均勻；③C線出現(xiàn)，但T1或T2線彌散或嚴(yán)重不均勻等情況視為無效檢測(cè)。

4）選擇讀數(shù)儀的嘔吐毒素檢測(cè)頻道，開始樣品測(cè)定，測(cè)定大概需要5 s完成，顯示定量結(jié)果。

4 膠體金定量檢測(cè)法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

4.1 參試產(chǎn)品信息

4.1.1 儀器類型 ①ROSA孵育器（編號(hào)：LF-INC4-5-45D）、ROSA-M 讀 數(shù) 儀 （編 號(hào) ：LF-ROSAREADER-M-NB）；②定量檢測(cè)條類型：黃曲霉毒素快速定量檢測(cè)條（0-150ppb）、嘔吐毒素快速定量檢測(cè)條（0-6ppm）、玉米赤霉烯酮快速定量檢測(cè)條（0-1400ppb）；③生產(chǎn)企業(yè)：美國Charm公司；④生產(chǎn)地：美國馬薩諸塞州。

4.1.2 目標(biāo)分析物和基質(zhì)提議①檢測(cè)項(xiàng)目：黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮；②基質(zhì)：玉米、玉米粒、豆粕、豆粕粒、麩皮、粗麩、粉碎玉米、參考物質(zhì)。

4.1.3 評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)用到的儀器設(shè)備高效液相色譜（型號(hào)：安捷倫1200）。

4.1.4 檢測(cè)所用定量試劑條批號(hào)①黃曲霉毒素快速定 量 檢 測(cè) 條 ：B002003S-03、B002003S-07、B002003S-09；②嘔吐毒素定量檢測(cè)條：B006010A-04、B006010A-06、B006010A-08；③玉米赤霉烯酮定量檢測(cè)條：B001002T-22、B001002T-25、B001002T-27。

4.2 樣品說明

選取經(jīng)過確認(rèn)無污染的玉米（5份）、玉米粒（3份）、豆粕（5份）、粗麩（4份）、粉碎玉米（3份）共計(jì)20份作為陰性樣品；采集玉米、玉米粒、豆粕、豆粕粒、麩皮、粗麩、粉碎玉米為自然樣品，自然樣品還選取了Charm公司的玉米質(zhì)參考物質(zhì)。

4.3 實(shí)驗(yàn)過程

檢測(cè)過程：定量檢測(cè)條按照檢測(cè)條說明書進(jìn)行，參考方法選用GB18979-2003、GB-T5009-209-2008、GB-T23503-2009。

4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.4.1 黃曲霉毒素B1

1）檢測(cè)限和定量限：取20個(gè)無污染樣品的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行計(jì)算，檢測(cè)限（LOD）是結(jié)果平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量值（LOQ）是結(jié)果平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)試結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1的LOD是2ppb，LOQ是5 ppb。

2）線性范圍：將ROSA快速定量檢測(cè)條的結(jié)果作為縱坐標(biāo)，將高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)法的檢測(cè)結(jié)果作為橫坐標(biāo)，對(duì)線性范圍進(jìn)行計(jì)算：5～150ppb（5點(diǎn)）；回歸方程：y=x-639；相關(guān)系數(shù)r為0.9993（如圖1）

圖1 黃曲霉毒素B1線性范圍

3）與參考方法參考值比較：通過高效液相色譜法與ROSA檢測(cè)條方法，分別檢測(cè)9組陽性樣品，通過配對(duì)t檢驗(yàn)法，對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異進(jìn)行比較。經(jīng)計(jì)算，tD=0.41，查t分布表，t0.05,8=2.31，tD=0.41＜t0.05,8=2.31,說明液相色譜參考值與ROSA測(cè)定值之間無顯著差異。

4）以高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果為認(rèn)定值，將ROSA快讀定量檢測(cè)條的測(cè)定結(jié)果與之進(jìn)行比較，按正確度（%）=檢測(cè)值/認(rèn)定值x100計(jì)算。正確度范圍在75.3%～120%之間，平均為99%。

5）選擇6個(gè)參與測(cè)試人員，按照同一種方法，在同一間實(shí)驗(yàn)室中，采用不同設(shè)備，對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)在15.5%～20.4%，平均變異系數(shù)為16.9%。

4.4.2 嘔吐毒素

1）檢測(cè)限和定量限：取20個(gè)無污染樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，以測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢測(cè)限（LOD），以測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為定量值（LOQ）。測(cè)試結(jié)果表明，嘔吐毒素的LOD是118ppb，LOQ是316ppb。

2）線性范圍：將ROSA快速定量試劑條的檢測(cè)結(jié)果作為縱坐標(biāo)，將高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果作為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性范圍：500～5 000ppb（5點(diǎn)）；回歸方程：y=1.16x-5.49;相關(guān)系數(shù)r為0.9987（如圖2）

圖2 嘔吐毒素線性范圍

3）與參考方法參考值比較：選擇ROSA檢測(cè)條與高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)方法，分別檢測(cè)11組陽性樣品，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法，對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異進(jìn)行。經(jīng)計(jì)算，tD=1.6，查t分布表，t0.05,10=2.23，tD=1.6＜t0.05,10=2.23,說明液相色譜參考值與ROSA測(cè)定值之間并無顯著差異。

4）將高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果作為認(rèn)定值，將ROSA快讀定量檢測(cè)條的檢測(cè)結(jié)果與認(rèn)定值進(jìn)行比較，按正確度（%）=檢測(cè)值/認(rèn)定值x100計(jì)算。正確度范圍在90.3%～133.9%之間，平均為106%。

5）選擇6個(gè)參與測(cè)試人員，按照同一種方法，在同一間實(shí)驗(yàn)室中，采用不同設(shè)備，對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)在4.7%～19.6%，平均變異系數(shù)為11.8%。

4.4.3 玉米赤霉烯酮

1）檢測(cè)限和定量限：取20個(gè)無污染樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，以測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢測(cè)限（LOD），以測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為定量值（LOQ）。測(cè)試結(jié)果表明，嘔吐毒素的LOD是5ppb，LOQ是14ppb。

2）線性范圍：將ROSA快速定量試劑條的檢測(cè)結(jié)果作為縱坐標(biāo)，將高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果作為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性范圍：30～1 000ppb（7點(diǎn)）；回歸方程：y=0.84x+35.1；相關(guān)系數(shù)r為0.998（如圖3）

圖3 玉米赤霉烯酮線性范圍

3）與參考方法參考值比較：選擇ROSA檢測(cè)條，與高效液相色譜法，分別對(duì)14組陽性樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法，對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異進(jìn)行比較。經(jīng)計(jì)算，tD=0.3，查t分布表，t0.05,13=2.16，tD=0.3＜t0.05,13=2.16,說明液相色譜參考值與ROSA測(cè)定值之間無顯著差異。

4）把高效液相色譜法的測(cè)定結(jié)果作為認(rèn)定值，將ROSA快讀定量檢測(cè)條的測(cè)定結(jié)果與認(rèn)定值進(jìn)行比較，按正確度（%）=檢測(cè)值/認(rèn)定值x100計(jì)算。正確度范圍在86.3%～133.9%之間，平均為117%。

5）6個(gè)參與測(cè)試人員在相同實(shí)驗(yàn)室，按照統(tǒng)一方法，采用不同設(shè)備，檢測(cè)相同樣品，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定的變異系數(shù)在8.4%～22.6%，平均變異系數(shù)為17.3%。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

該膠體金檢測(cè)系統(tǒng)能夠定量檢測(cè)飼料主要組成成分玉米、豆粕、麩皮、粗麩等飼料中黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等霉菌毒素，可以滿足飼料中霉菌毒素的快速定量檢測(cè)需要。該系統(tǒng)照傳統(tǒng)方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于：安全（無需接觸標(biāo)準(zhǔn)品）、簡單（前處理及檢測(cè)步驟簡單易學(xué)，無需專業(yè)人員）、快速（十幾分鐘即可得到定量結(jié)果）、準(zhǔn)確（與高效液相色譜法結(jié)果高度吻合）、成本低等等?？梢宰鳛轱暳现袡z測(cè)霉菌毒素的主要方法?！?/p>

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A New Method for the Detection Mycotoxins in Feed

Meng Junli1,Zhang Zhiyun2
（1.Tangshan city animal husbandry and aquatic products quality monitoring center，TangShan HeBei，063000；2.The ring in the check trade biological technology(Beijing)co.,LTD，BeiJing，100012）

in recent years as the country of grain supersaturated,poor old grain storage conditions,factors such as,too much rain in feed ingredients mycotoxin pollution is serious,because of its harm to animals,increasing the flow detection.And high toxicity and makes detection of mycotoxin lest shun,perennial exposed,highly toxic volatile criterion is an important factor,which endanger the safety of the inspectors to find a safe,rapid and accurate mycotoxin detection method is imminent.Paper has carried on the induction analysis of mycotoxin detection methods,improve the mycotoxin detection method for the future,reduce the mycotoxin provides reference to the harm of animal husbandry.

Mycotoxins;Harm;Detection method

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.041