光遺傳技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型中的應(yīng)用

周 瑞，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京100021)

綜述與專(zhuān)論

光遺傳技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型中的應(yīng)用

周 瑞，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京100021)

光遺傳技術(shù)是Boyden等科學(xué)家在2005發(fā)明的利用激光照射實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制神經(jīng)元活動(dòng)的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，該技術(shù)是基因工程，生物醫(yī)學(xué)工程等的完美結(jié)合。自發(fā)明以來(lái)被廣泛應(yīng)用于帕金森氏病、情感神經(jīng)環(huán)路等研究中。2011年，該技術(shù)入選NatureMethods雜志2010年度方法。本文對(duì)光遺傳技術(shù)的新進(jìn)展以及在疾病模型研究中的應(yīng)用做簡(jiǎn)要綜述。

光遺傳技術(shù)；神經(jīng)精神疾?。荒Ｐ?，動(dòng)物

帕金森氏病、抑郁癥、焦慮癥、阿茲海默癥等神經(jīng)精神類(lèi)疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康，并且導(dǎo)致沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。然而科學(xué)家對(duì)于此類(lèi)疾病的發(fā)病以及治療依然知之甚少。精準(zhǔn)調(diào)控神經(jīng)回路的技術(shù)，對(duì)于我們深入理解這類(lèi)疾病是有很大幫助的。光遺傳學(xué)手段是一種深入大腦內(nèi)部神經(jīng)回路層面的研究手段，用于探明大腦在神經(jīng)精神疾病病理生理的神經(jīng)回路基礎(chǔ)。這是傳統(tǒng)研究手段所不能達(dá)到的高度。

近年來(lái)，光遺傳技術(shù)發(fā)展迅速并且被廣泛引用于離體腦片或者清醒動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)精準(zhǔn)調(diào)控上。現(xiàn)對(duì)光遺傳技術(shù)在解析各種動(dòng)物神經(jīng)精神疾病模型的諸如恐懼、焦慮、抑郁、精神分裂等疾病的神經(jīng)回路基礎(chǔ)的應(yīng)用做簡(jiǎn)要綜述。

1 光遺傳技術(shù)新進(jìn)展

近年來(lái)研究者們?cè)谶\(yùn)用光遺傳技術(shù)過(guò)程中，不斷改進(jìn)發(fā)展新的光導(dǎo)入方法、光敏感蛋白靶向表達(dá)策略、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系等方面，使得使用該技術(shù)更加便利并且極大拓展了應(yīng)用范圍。

光遺傳技術(shù)與腦影像技術(shù)結(jié)合，使得傳統(tǒng)功能核磁與新技術(shù)相得益彰。現(xiàn)在，光遺傳融合功能核磁成像能進(jìn)一步解釋利用傳統(tǒng)腦功能核磁技術(shù)驗(yàn)證的假說(shuō)[1](局灶興奮性神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)導(dǎo)致BOLD信號(hào)升高)，更重要的是可以顯示光遺傳操縱的全腦效應(yīng)。鑒于眾多的神經(jīng)精神疾病的發(fā)病可能都有全腦效應(yīng)，光遺傳功能核磁聯(lián)合，對(duì)于發(fā)掘和確定光刺激特定細(xì)胞亞型導(dǎo)致的全腦效應(yīng)或者遠(yuǎn)端投射關(guān)系尤為重要。

目前，利用光遺傳刺激結(jié)合腦功能核磁成像技術(shù)，在大腦精細(xì)環(huán)路解析研究中,已經(jīng)取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[2, 3]。這些研究有助于解釋皮質(zhì)特定層在皮質(zhì)信息流傳遞的作用，并且可以描繪來(lái)源于不同皮質(zhì)層或者不同亞細(xì)胞定位的突觸傳遞網(wǎng)絡(luò)。這些豐富的信息為研究疾病狀態(tài)下大腦神經(jīng)回路或者大腦連接組的改變奠定了基礎(chǔ)。

1.1 光效應(yīng)工具-視蛋白的改進(jìn)

傳統(tǒng)的光遺傳工具蛋白,主要興奮神經(jīng)元視蛋白-紫紅質(zhì)通道蛋白2(ChR2)[4]，抑制神經(jīng)元通道蛋白鹽細(xì)菌視紫紅質(zhì)(NpHR)[5, 6]和光敏感質(zhì)子泵[5, 7]。除此之外，改進(jìn)型光遺傳工具蛋白不斷推出,包括超快速光敏感離子通道家族[8](ChETA family)，可以用于激發(fā)200 Hz以上的超快速神經(jīng)元發(fā)放行為。

盡管光遺傳技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)激光照射后特定經(jīng)元的動(dòng)作電位鎖時(shí)相發(fā)放，但是這對(duì)于解析神經(jīng)元編碼效應(yīng)是不夠的。視蛋白嵌合受體(OptoXRs)[9]在細(xì)胞內(nèi)可以參與到G蛋白偶聯(lián)受體通路的視蛋白，利用該光敏感受體蛋白可以實(shí)現(xiàn)對(duì)清醒動(dòng)物靶細(xì)胞的光誘發(fā)G蛋白偶聯(lián)級(jí)聯(lián)生化反應(yīng)?？梢詫?duì)神經(jīng)細(xì)胞的閾下電位進(jìn)行操控，并且不直接依賴(lài)動(dòng)作電位發(fā)放。另外，還有介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞興奮且抑制雙向效應(yīng)的視蛋白。

除了光誘發(fā)效應(yīng)不同，對(duì)不同波長(zhǎng)激光敏感的視蛋白也被開(kāi)發(fā)出來(lái)，例如，長(zhǎng)波長(zhǎng)激光敏感視蛋白家族(C1V1)[10]。這些新型的視蛋白的發(fā)明，極大的拓展了光遺傳應(yīng)用的范圍，以及提高光遺傳技術(shù)的易用性。

此外，光遺傳技術(shù)的特異性不僅局限于神經(jīng)元亞型，改進(jìn)的方法用基因技術(shù)限制視蛋白在細(xì)胞內(nèi)的空間位置，使其表達(dá)于胞體和附近的神經(jīng)元樹(shù)突上?？臻g限制視蛋白表達(dá)可以揭示那些胞體位于突觸后細(xì)胞的樹(shù)突附近的神經(jīng)元的突觸連接[11]。

1.2 光遺傳工具轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的創(chuàng)制

目前已經(jīng)有大量的針對(duì)不同神經(jīng)元亞型特異的Cre工具小鼠品系被開(kāi)發(fā)出來(lái)[12]。感染細(xì)胞并且用于表達(dá)光視蛋白的腺相關(guān)病毒(AAV)中有l(wèi)oxp組件。在這些Cre工具小鼠注射相應(yīng)腺相關(guān)病毒(AAV)后，視蛋白在腦中表達(dá)特異性與Cre的特異性一致。然而，目前仍缺少相應(yīng)的光遺傳Cre工具大鼠。鑒于，大鼠在行為學(xué)研究以及神經(jīng)電生理研究方面的便利性。加快光遺傳工具大鼠研發(fā)的進(jìn)展是非常有必要的。

2 光遺傳學(xué)技術(shù)行為學(xué)研究的應(yīng)用

光遺傳技術(shù)的出現(xiàn)使得傳統(tǒng)的動(dòng)物行為學(xué)研究方法發(fā)生了翻天覆地的變化?；谏窠?jīng)元胞體或者纖維投射特異性的光調(diào)控策略，包括調(diào)控時(shí)間窗選擇的便利，重新定義了動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。例如，相較于經(jīng)典的藥理學(xué)操控神經(jīng)細(xì)胞技術(shù)，光遺傳操控的可逆性極大的縮短給藥洗脫帶來(lái)的時(shí)間花費(fèi)，之前持續(xù)幾天的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在可以一次實(shí)驗(yàn)完成。高架迷宮配合光遺傳學(xué)操控，可以進(jìn)行自身對(duì)照試驗(yàn)(有光，無(wú)光)，極大的縮短實(shí)驗(yàn)周期和動(dòng)物用量[13]。類(lèi)似的，傳統(tǒng)的條件位置偏好實(shí)驗(yàn)通常需要3 d，包括習(xí)慣日、條件刺激日和測(cè)試日。傳統(tǒng)條件位置偏好實(shí)驗(yàn)，必須將動(dòng)物限制在一個(gè)隔間給予非條件刺激(藥物、或者電擊)，然后再限制在另一隔間給予對(duì)照刺激。只有在測(cè)試日才能有行為學(xué)位置偏好結(jié)果得出。光遺傳技術(shù)的出現(xiàn)極大簡(jiǎn)化了此實(shí)驗(yàn)的操作以及增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可分析性，從而得到更多的信息。在條件刺激日，把動(dòng)物放入位置偏好檢測(cè)箱，在動(dòng)物進(jìn)入指定隔間內(nèi)給予光刺激。這樣使得量化動(dòng)物的位置偏好性成為可能[14]。更進(jìn)一步的，光刺激的參數(shù)(占空比、刺激頻率、刺激周期、刺激強(qiáng)度)可以根據(jù)動(dòng)物位置而改變。這使得在一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)可以得到更優(yōu)化的刺激參數(shù)，這是傳統(tǒng)藥理學(xué)方法無(wú)法比擬的。由于光遺傳操控具有時(shí)間精確性，使得研究動(dòng)物行為學(xué)操作中關(guān)鍵時(shí)間窗腦區(qū)功能成為可能。例如，動(dòng)物進(jìn)行T字形迷宮時(shí),做出左右選擇的時(shí)間點(diǎn)。

圖1 載體光遺傳實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Fig.1 Flowchart of designing optogenetics experiments

雖然，光遺傳操控技術(shù)有以上的諸多優(yōu)點(diǎn)，但也有一些局限性及注意事項(xiàng)。首先，是光照熱效應(yīng)，當(dāng)使用高強(qiáng)光照射時(shí)，光纖末端的熱效應(yīng)是不可忽視的。這里產(chǎn)生的熱量不僅僅影響神經(jīng)元活性，甚至有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。應(yīng)用光遺傳技術(shù)必須經(jīng)常關(guān)注激光光源的穩(wěn)定性，以及光照射效應(yīng)區(qū)是否準(zhǔn)確，以及光照射范圍。

另一局限性是，長(zhǎng)期過(guò)高表達(dá)視蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。針對(duì)特定細(xì)胞，在細(xì)胞膜表面表達(dá)微生物視蛋白，不能超過(guò)細(xì)胞所能承受的極限。必須設(shè)置對(duì)照，檢查表達(dá)視蛋白的表達(dá)是否影響細(xì)胞狀態(tài)。影響細(xì)胞狀態(tài)的因素還包括光照射強(qiáng)度、病毒滴度、注射劑量、載體、感染細(xì)胞類(lèi)型、動(dòng)物種屬等。除此之外，設(shè)計(jì)光遺傳實(shí)驗(yàn),還必須將一過(guò)性影響細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡導(dǎo)致后延效應(yīng)考慮在內(nèi)。

2.1 在體光遺傳實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則

設(shè)計(jì)光遺傳實(shí)驗(yàn),探究疾病狀態(tài)下特定行為的神經(jīng)回路時(shí)，有一些基本規(guī)則參照(圖1)。選擇視蛋白時(shí)需要權(quán)衡不同蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)。例如，視蛋白的光敏感性與其開(kāi)閉動(dòng)力學(xué)呈現(xiàn)反比[8]。光效應(yīng)的體積越大，時(shí)間精確性越差等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇適的視蛋白是非常重要的。

另外，針對(duì)特異性細(xì)胞或者組織的靶向策略也非常重要。最為常用的策略是依賴(lài)于病毒注射位置的特異性，也就是說(shuō)視蛋白只表達(dá)于注射位置附近而病毒感染本身沒(méi)有選擇性。而某些具有順行感染能力病毒[12]，蛋白不僅可以表達(dá)在細(xì)胞胞體，還可能沿著神經(jīng)纖維到達(dá)纖維末端，從而實(shí)現(xiàn)光照射投射末端，操控細(xì)胞胞體。目前最為常用的病毒載體為慢病毒與腺相關(guān)病毒載體，并且也有多種針對(duì)野生型動(dòng)物的啟動(dòng)子供選擇[12]。新型的病毒載體包括人類(lèi)單純皰疹病毒載體,狂犬病毒載體以其逆行感染能力也同樣受到關(guān)注。逆行感染使得研究者可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)某一特定腦區(qū)結(jié)構(gòu)全部傳入端的光遺傳控制。但是，這些病毒載體由于其毒性較大，應(yīng)用受到限制。

由于某些啟動(dòng)子序列過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法包裝在病毒載體內(nèi)。依賴(lài)Cre重組酶技術(shù)的視蛋白特異表達(dá)策略被開(kāi)發(fā)出來(lái)。第一次利用成功應(yīng)用此策略的是酪氨酸脫羧酶特異性細(xì)胞表達(dá)重組酶Cre小鼠(TH::Cre)；小清蛋白特異性細(xì)胞表達(dá)重組酶Cre小鼠(PV::Cre)[15]。隨后越來(lái)越多的基于此種策略的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被創(chuàng)制出來(lái)[16]，甚至有腦內(nèi)特定亞群細(xì)胞內(nèi)預(yù)先表達(dá)視蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世。通過(guò)病毒識(shí)別細(xì)胞外表達(dá)受體來(lái)確定細(xì)胞特異性的策略也被開(kāi)發(fā)出來(lái)[17, 18]。

激光定點(diǎn)導(dǎo)入腦內(nèi)在整個(gè)光遺傳技術(shù)中也是非常重要的。包括急性光纖插入(光纖通過(guò)導(dǎo)向套管直接插入腦內(nèi))[19, 20]；慢性植入式光纖(光纖頭植入于腦內(nèi)，顱骨外保留一個(gè)接頭與光纖跳線(xiàn)相連接)[12]。急性插入式光纖的好處是可以在插入光纖位置給予藥物，但是由于光纖較脆有可能導(dǎo)致光纖斷裂在套管內(nèi)。慢性植入式光纖雖然不能配合藥理學(xué)操作,但是可以在腦內(nèi)保留多日，從而提供多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到更多的數(shù)據(jù)[12]。可采用的光源有激光二極管，以及發(fā)光二極管(LED),這兩種光源各有利弊。視蛋白開(kāi)始正常表達(dá)，并且光導(dǎo)入到腦內(nèi)目標(biāo)位置，光照參數(shù)就可以確定了。確定光照參數(shù)需要考慮到熱效應(yīng)、光散射和目標(biāo)細(xì)胞的電生理特性等。在解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果之前，要確認(rèn)進(jìn)行的光遺傳操控，對(duì)于細(xì)胞的效應(yīng)是確定而有效的，以排除由于技術(shù)本身帶來(lái)的不確定因素。

2.2 有關(guān)恐懼焦慮的神經(jīng)回路研究

據(jù)統(tǒng)計(jì)，焦慮性情緒障礙，包括焦慮病、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙和恐怖癥等的焦慮性情緒疾病的發(fā)病率是28%。盡管焦慮性情緒障礙發(fā)病很廣泛，但是針對(duì)這種精神類(lèi)疾病的治療手段卻很缺乏。

所謂焦慮情緒是對(duì)一個(gè)潛在危險(xiǎn)的過(guò)分擔(dān)心和恐懼[21]。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物利用光遺傳方法研究得到的結(jié)果顯示，杏仁核特定的突觸聯(lián)系可以快速并且可逆的調(diào)節(jié)清醒自由活動(dòng)動(dòng)物的基礎(chǔ)焦慮水平[13]。研究者將視蛋白表達(dá)于整個(gè)神經(jīng)細(xì)胞包括胞體以及軸突末端，在軸突末端給予光刺激即可導(dǎo)致軸突去極化。這個(gè)研究還利用傾斜的導(dǎo)管來(lái)實(shí)現(xiàn)光照只照射到從一個(gè)腦區(qū)到另一個(gè)腦區(qū)的軸突投射。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，選擇性激活由基底外側(cè)杏仁核到內(nèi)側(cè)杏仁核的興奮性投射導(dǎo)致抗焦慮效應(yīng)。這與非選擇性刺激基底外側(cè)杏仁核興奮性神經(jīng)元胞體導(dǎo)致的促焦慮效應(yīng)截然不同?？梢源_定的是，基底外側(cè)杏仁核神經(jīng)元的投射終點(diǎn)不僅有杏仁核的中央外側(cè)、中央內(nèi)側(cè)核團(tuán)還包括伏隔核、前額葉皮層、終紋床核等許多其他核團(tuán)，對(duì)于焦慮樣行為導(dǎo)致的效應(yīng)也不盡相同。因此，投射特異性光遺傳操控使得研究者有能力解析杏仁核內(nèi)部焦慮產(chǎn)生的精細(xì)通路。此外，光刺激表達(dá)有超極化基底外側(cè)核杏仁核到內(nèi)側(cè)杏仁核通路時(shí)，產(chǎn)生促焦慮效應(yīng)。也就是說(shuō)這個(gè)細(xì)胞投射通路對(duì)于焦慮樣情緒有雙向調(diào)制作用。

2.3 有關(guān)成癮回路的研究應(yīng)用

藥物成癮是以對(duì)某一種藥物強(qiáng)烈渴求，并且不計(jì)后果獲取該藥物為特點(diǎn)的一種慢性，頑固反復(fù)的神經(jīng)疾病[22]。研究人員推測(cè)藥物成癮是由于腦內(nèi)獎(jiǎng)賞通路被挾持導(dǎo)致，所以，對(duì)于獎(jiǎng)賞通路的深入理解是研究藥物成癮的關(guān)鍵[23, 24]。盡管我們已經(jīng)知道中腦多巴胺能系統(tǒng)和伏隔核在腦內(nèi)獎(jiǎng)賞過(guò)程以及其他成癮相關(guān)行為起著重要作用[25]。我們對(duì)于成癮的形成機(jī)制或者介導(dǎo)成癮行為的神經(jīng)編碼卻知之甚少。

靶向視蛋白基因表達(dá)策略的發(fā)明激發(fā)了研究者對(duì)于研究成癮機(jī)制探究的興趣。利用上文提到的依賴(lài)Cre重組酶技術(shù)的視蛋白特異表達(dá)策略，高度選擇性的重組酶Cre依賴(lài)的病毒載體被開(kāi)發(fā)出來(lái)[16]，視蛋白只表達(dá)于Cre陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)，并且重組酶Cre只在多巴胺能神經(jīng)元中表達(dá)。在這個(gè)研究中，陣發(fā)性非強(qiáng)直性刺激腹側(cè)被蓋核團(tuán)多巴胺能神經(jīng)元導(dǎo)致伏隔核的多巴胺能效應(yīng)足夠維持條件位置偏愛(ài)。光遺傳結(jié)合條件位置偏愛(ài)行為學(xué)測(cè)量使得研究者確定了伏隔核不同部分對(duì)于獎(jiǎng)賞依賴(lài)樣行為起到的不同作用。伏隔核中表達(dá)不同多巴胺能受體亞型神經(jīng)元的激活的對(duì)于可卡因位置偏愛(ài)行為的效應(yīng)是不同的。激活表達(dá)I型多巴胺能受體的神經(jīng)元易化可卡因位置偏愛(ài)、而激活表達(dá)II型受體的神經(jīng)元抑制可卡因位置偏愛(ài)[26]。除此之外，伏隔核中膽堿能神經(jīng)元在可卡因位置偏愛(ài)行為中也起到關(guān)鍵作用[27]，并且激活伏隔核神經(jīng)元內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體通路同樣促進(jìn)條件位置偏愛(ài)(CPP)。

進(jìn)一步研究獎(jiǎng)賞尋求相關(guān)行為，研究者開(kāi)展了一系列對(duì)大腦“獎(jiǎng)賞”編碼的研究，也就是說(shuō)光刺激特定腦區(qū)或者特定通路，觀察動(dòng)物有無(wú)尋求行為。這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以動(dòng)物的顱內(nèi)自刺激或者自給藥模型為基礎(chǔ)[28]。盡管，這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為“獎(jiǎng)賞”完全來(lái)自中樞提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，但是由于腦內(nèi)的神經(jīng)元的異質(zhì)性，人們對(duì)于維持自刺激行為特定神經(jīng)元亞型或者神經(jīng)投射的了解依然非常有限。最近，有研究結(jié)果顯示，介導(dǎo)維持自刺激行為的特定神經(jīng)元類(lèi)型。選擇性激活由基底外側(cè)杏仁核團(tuán)到伏隔核的興奮性投射，動(dòng)物出現(xiàn)強(qiáng)烈的自刺激行為，而激活神經(jīng)元胞體無(wú)此效應(yīng)[29]。此外，介導(dǎo)自刺激行為的基地外側(cè)杏仁核-伏隔核投射依賴(lài)于I型多巴胺能投射[29]。腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元同樣是光照自刺激的一個(gè)靶點(diǎn)?？偠灾?，這些研究揭示了維持對(duì)藥物依賴(lài)病理狀態(tài)過(guò)程中，特定神經(jīng)元或者特定投射的工作模式。

光遺傳學(xué)工具有望證明一些以往基于間接證據(jù)得到的假說(shuō)。例如，腹側(cè)被蓋區(qū)GABA能神經(jīng)元對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的抑制受到阿片類(lèi)藥物的干擾，從而成為研究成癮的新的目標(biāo)[30]。利用現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系，研究者可以直接操控腹側(cè)背蓋區(qū)GABA能神經(jīng)元并且同時(shí)觀察動(dòng)物享樂(lè)以及物質(zhì)尋求行為。以往的經(jīng)典電生理研究得到結(jié)果已經(jīng)粗略的勾勒出皮質(zhì)邊緣系統(tǒng)在獎(jiǎng)賞尋求相關(guān)的發(fā)生、位置、消退中起作用，這些結(jié)果恰恰為光遺傳研究其特定內(nèi)在因果性奠定基礎(chǔ)。

電生理研究成癮的工作基礎(chǔ)是藥理學(xué)操控特定回路的行為學(xué)效應(yīng)。因此，隨著光遺傳技術(shù)的成熟，包括神經(jīng)活動(dòng)狀態(tài)以及神經(jīng)化學(xué)信號(hào)的高速獲取、必將成癮行為研究帶入一個(gè)新的高度[31]。

2.4 光遺傳在腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病神經(jīng)回路研究中的應(yīng)用

一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病諸如帕金森疾病[32, 33]、癲癇[34, 35]、神經(jīng)源性致盲[36]、睡眠障礙[37]的基礎(chǔ)問(wèn)題,有望利用光遺傳技術(shù)得到解決。光遺傳技術(shù)使得人們對(duì)于腦內(nèi)運(yùn)動(dòng)通路的理解更為加深。基底節(jié)通過(guò)直接間接通路的平衡來(lái)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)，直接通路易化運(yùn)動(dòng)，間接通路抑制運(yùn)動(dòng)[38]。視蛋白特異性表達(dá)策略，使得選擇性激活兩種通路成為可能[32]，研究結(jié)果直接證明了帕金森直接間接通路假說(shuō)。

帕金森是一種以運(yùn)動(dòng)障礙為主要表現(xiàn),同時(shí)兼有情緒和認(rèn)知異常的退行性神經(jīng)疾患[39]。盡管膝下皮質(zhì)深部腦刺激治療抑郁癥[40]、刺激丘腦底核治療帕金森導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙[41],以及其他靶點(diǎn)的深部腦電刺激治療取得了一定療效。但是，其機(jī)制的并不完全明確。利用光遺傳技術(shù)，選擇性激活傳入丘腦底核STN的神經(jīng)纖維末梢,對(duì)于6-OHDA致大鼠帕金森模型有顯著治療作用[42]。這個(gè)證據(jù)都支持了深部腦刺激療法中，白質(zhì)纖維或者軸突通路是電流效應(yīng)的直接靶點(diǎn)。電極或者光極對(duì)于特定區(qū)域傳入纖維的效應(yīng),導(dǎo)致的較大面積的神經(jīng)元活動(dòng)是DBS方法調(diào)控神經(jīng)元的基礎(chǔ)。這個(gè)概念被進(jìn)一步引入到DBS治療抑郁癥領(lǐng)域。不僅如此，以軸突束為靶點(diǎn)的神經(jīng)調(diào)控改善帕金森癥狀，同樣提供了有關(guān)神經(jīng)疾病發(fā)病和維持的更多信息。值得注意的是，光遺傳同樣被應(yīng)用于干細(xì)胞干預(yù)帕金森疾病的研究當(dāng)中[43]。對(duì)于植入的干細(xì)胞來(lái)源的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行光遺傳刺激，異化了移植神經(jīng)元與受體神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)發(fā)生功能整合。光遺傳學(xué)技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究，包括機(jī)制研究和新型療法研究越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。下丘腦不同亞群的神經(jīng)元被發(fā)現(xiàn)參與攝食行為的調(diào)控。光遺傳刺激下丘腦腹正中神經(jīng)元誘發(fā)小鼠攻擊性行為[44]。另外，研究者可利用光遺傳技術(shù)激活視錐細(xì)胞重建視覺(jué)的，使得扭轉(zhuǎn)視網(wǎng)膜炎色素變性導(dǎo)致失明成為可能[45]，日前，該療法已經(jīng)在美國(guó)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

光遺傳也被應(yīng)用到阿爾茲海默癥地研究當(dāng)中，Tonegawa[46]實(shí)驗(yàn)室利用小鼠模型來(lái)證明失憶癥是記憶回想出現(xiàn)障礙。用蛋白合成抑制劑茴香霉素處理小鼠后，它似乎不記得足底電擊的痛苦記憶。不過(guò)利用光遺傳學(xué)激發(fā)認(rèn)知過(guò)程中激活的細(xì)胞，它又能回想起“丟失的”記憶，但這種影響只是暫時(shí)的，當(dāng)光關(guān)閉，失憶癥又出現(xiàn)。有研究團(tuán)隊(duì)證明。阿爾茲海默癥患者出現(xiàn)失憶癥狀也有類(lèi)似的機(jī)制[47]。

這里，我們總結(jié)了近期光遺傳技術(shù)在神經(jīng)精神相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的應(yīng)用。得益于光遺傳技術(shù)的精準(zhǔn)性，極大地拓展神經(jīng)回路研究的可能性以及可靠性。盡管，成功應(yīng)用光遺傳的研究工作已經(jīng)很多，但是諸如非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)光遺傳技術(shù)應(yīng)用仍然在初始階段，還有許多問(wèn)題沒(méi)有解決[48-50]。光遺傳的研究由工具研究轉(zhuǎn)化為科學(xué)問(wèn)題研究的速度越來(lái)越快，并且各種面向科研需求為的光遺傳方法學(xué)研究使得應(yīng)用光遺傳學(xué)更為便利和可靠。

雖然開(kāi)發(fā)不同功能與特性的視蛋白速度很快，但有些問(wèn)題仍然值得關(guān)注。例如，作為光敏感離子通道和光敏感離子泵的補(bǔ)充，新型視蛋白融合受體(OptoXR)家族有待開(kāi)發(fā)，光敏感結(jié)構(gòu)域有望加載在更多的受體或者胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白上，借此，光遺傳技術(shù)的應(yīng)用可以被拓展到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究領(lǐng)域[8]。

另外，光導(dǎo)入體內(nèi)的方法也需要進(jìn)一步改進(jìn)。目前的光導(dǎo)入方法光照射體積較小限制了光遺傳技術(shù)在大動(dòng)物例如非人靈長(zhǎng)類(lèi)的應(yīng)用。光導(dǎo)入的精確性以及光照頻率的時(shí)間分辨率也有待提高，只有解決了這些才能實(shí)現(xiàn)，針對(duì)單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的激活以及神經(jīng)編碼的模擬以及重現(xiàn)。

目前認(rèn)為，導(dǎo)致各種神經(jīng)精神類(lèi)疾病諸如焦慮癥、抑郁癥、成癮、精神分裂癥和自閉癥的原因都是神經(jīng)回路異常。鑒于神經(jīng)精神疾病癥狀的相似性以及不同神經(jīng)精神疾病在同一個(gè)體上共同發(fā)病的概率也較高，光遺傳提供了一種可以更為精確確定和解釋神經(jīng)回路的方法，實(shí)為研究神經(jīng)精神類(lèi)疾病的利器。

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Optogenetics and research progress in animal models of brain diseases

ZHOU Rui, QIN Chuan

(Comparative Medicine Center, Peking Union College (PUMC) & Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS),Beijing 100021,China)

Optogenetics is a technology invented by Boyden in 2005 that allows targeted, fast control of precisely defined events in neural system. It was widely used in Parkinson disease and emotional neural circuit studies. Optogenetics was selected by Nature Methods for method of the year 2010. This paper reviews on the research advances and applications of optogenetics.

Optogenetics; Neuropsychiatric diseases; Models, animal

中瑞國(guó)際科技合作項(xiàng)目(編號(hào)：2015DFG32230)。

周瑞(1988-)，博士后,研究方向：神經(jīng)退行性疾病的干預(yù)。E-mail： zhourui@cnilas.org。

秦川，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)病理學(xué)。E-mail： qinchuan@pumc.edu.cn。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0074-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.014

2016-10-31