廣西巴馬小型豬PERV-env基因克隆及其組織表達(dá)譜分析

鐘 華，潘漢世，馬 玲，龍 寒，陳鳳蓮，廖艷娟，唐海波，吳健敏

(1. 廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，南寧，廣西 530006; 2. 廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧，廣西 530001)

研究報(bào)告

廣西巴馬小型豬PERV-env基因克隆及其組織表達(dá)譜分析

鐘 華1，潘漢世2，馬 玲2，龍 寒1，陳鳳蓮2，廖艷娟1，唐海波2，吳健敏2

(1. 廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，南寧，廣西 530006; 2. 廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧，廣西 530001)

目的 克隆廣西巴馬小型豬PERV-env部分基因，并研究其在不同組織中的表達(dá)差異。方法 利用RT-PCR方法從巴馬小型豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增PERV-env基因，并與部分國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的PERV-env 基因序列進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析。以擴(kuò)增獲得的廣西巴馬小型豬PERV-env基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，利用半定量RT-PCR的方法對(duì)廣西巴馬小型豬不同組織中PERV mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果 在所檢測(cè)的9個(gè)組織樣品中PERV mRNA相對(duì)表達(dá)水平存在差異，腎及外周血淋巴細(xì)胞中PERV mRNA豐度最高，肺、心、肝、脾、胸腺、卵巢次之，且表達(dá)豐度差異不顯著(P>0.05)，胰腺PERV mRNA表達(dá)豐度最低。結(jié)論 以巴馬小型豬胰島細(xì)胞進(jìn)行異種移植發(fā)生PERV感染的潛在危險(xiǎn)性可能要低于其它器官，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

巴馬小型豬；PERV-env基因；半定量RT-PCR；組織表達(dá)譜

廣西巴馬小型豬具有遺傳性能穩(wěn)定，遺傳相似性及近交系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)家重點(diǎn)扶持發(fā)展的小型豬種之一。目前在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)方面的應(yīng)用涉及到腫瘤、心血管病、糖尿病、皮膚燒傷、血液病、遺傳病、營(yíng)養(yǎng)代謝病、新藥評(píng)價(jià)等等。它不僅是發(fā)展高級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)用豬的優(yōu)良品系，同時(shí)也有望成為異種移植的最佳供體之一。

自從豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus，PERV)被認(rèn)為在豬—人異種移植中存在潛在危險(xiǎn)以來(lái)，有關(guān)PERV病原安全性問(wèn)題成為研究的熱點(diǎn)[1]。PERV基因組結(jié)構(gòu)由5′、3′非編碼區(qū)及gag、pol、env 3個(gè)編碼基因組成，它能夠以前病毒DNA形式整合進(jìn)豬細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制。PERV-env基因編碼病毒的囊膜蛋白(Env蛋白), 由貫穿病毒囊膜的穿膜(transmembrane，TM)蛋白及暴露于囊膜表面的表面蛋白(surface glycoprotein，SU)組成。SU有許多糖基化位點(diǎn)，不但具有受體結(jié)合的功能，與PERV A、B、C亞型的分類、細(xì)胞的嗜性、宿主感染范圍等相關(guān)，還具有誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的作用，同時(shí)還非常容易變異[2]。而TM蛋白則相對(duì)保守，參與感染過(guò)程中病毒與宿主細(xì)胞膜的融合，因此Env蛋白一直是PERV研究的重點(diǎn)。

本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)從巴馬小型豬外周血淋巴細(xì)胞中克隆PERV-env基因，并以巴馬小型豬PERV-env基因中TM蛋白編碼區(qū)為模板設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用半定量RT-PCR方法對(duì)巴馬小型豬各個(gè)組織中PERV-env基因的mRNA豐度進(jìn)行檢測(cè)，以了解廣西巴馬小型豬各組織器官中PERV的表達(dá)情況，為臨床異種移植選擇低拷貝負(fù)載的豬器官、組織或細(xì)胞提供依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步開(kāi)展異種移植的安全性評(píng)估打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 檢測(cè)樣品

6月齡的巴馬小型豬3頭，由廣西大學(xué)巴馬小型豬封閉養(yǎng)殖場(chǎng)提供[SCXK桂2013-0003]。實(shí)驗(yàn)在廣西麗原生物股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心內(nèi)進(jìn)行[SYXK桂2012-0002]，所有的操作必須遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的規(guī)章制度和操作規(guī)程(SOP)進(jìn)行。豬宰殺后迅速采集肺、心、肝、腎、脾、胰、胸腺、卵巢、外周血，液氮速凍，-80℃冰箱保存，用于總RNA的提取。

1.2 工具酶及試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Pyrobest Taq DNA聚合酶、pGEM-T載體、瓊脂糖等購(gòu)自Promega公司，Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品，BioredTM全血基因組DNA小量純化試劑盒、DNA marker DL2000購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)，E.coliDH 5α為本室保存。

1.3 基因的選擇及引物設(shè)計(jì)

根據(jù) Genbank已發(fā)表的PERV核苷酸序列(登錄號(hào)：AJ133817)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增PERV-env全基因。此外，由于PERV有A、B、C三種亞型，其分型主要由Env蛋白中的SU蛋白的差異來(lái)決定[2]，因此本試驗(yàn)以擴(kuò)增獲得的巴馬小型豬PERV-env基因?yàn)槟０?，選擇避開(kāi)SU蛋白編碼區(qū)，以相對(duì)保守的TM蛋白編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增PERV-env部分基因作為檢測(cè)PERV表達(dá)譜的待測(cè)目的基因。同時(shí)以管家基因(house-keeping genes)β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因。β-actin是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白，在不同物種之間高度保守。因此在進(jìn)行半定量RT-PCR時(shí)，選擇管家基因可以通過(guò)計(jì)算目的基因和內(nèi)參的比值，得到基因表達(dá)的相對(duì)濃度。根據(jù)Genebank已發(fā)表的β-actin基因序列(登錄號(hào)：U07786)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PERV-env基因和β-actin基因引物序列

1.4 RNA的制備及含量測(cè)定

總RNA的制備：按Trizol 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取巴馬小型豬各種組織及外周血白細(xì)胞的總RNA，取5 μL按一定的倍數(shù)稀釋，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度并進(jìn)行RNA含量的測(cè)定。總RNA含量計(jì)算方法：(A260× 核酸稀釋倍數(shù) × 40)/1000，單位為 μg/μL。提取的總RNA儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 cDNA的合成

分別取巴馬小型豬各個(gè)組織提取的總RNA 2 μg，分別加到1.5 mL EP管中，然后各加1 μL的Olige(dT)17(50 pmol/μL)混勻，再加無(wú)RNA酶水至15 μL，于PCR儀中70℃ 變性5 min后，迅速冰浴2 min。短暫離心后再加入5× buffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、RNasin 0.5 μL、M-MULV 0.5 μL。于PCR儀中42℃作用 1 h 后，70℃15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。再加入1μL RNase H (2U/μL) 37℃消化20 min，立即使用或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR擴(kuò)增

1.6.1 PERV-env全基因擴(kuò)增及分析： 參照文獻(xiàn)[3]的方法，利用PERV-env全基因引物，從巴馬小型豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增PERV-env全基因。具體擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min，94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 2 min循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆后送北京奧科生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登錄GenBank并與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的PERV-env 全基因序列進(jìn)行同源性及遺傳進(jìn)化分析。

1.6.2 PERV-env部分基因及β-actin基因的擴(kuò)增：

1.6.2.1 PCR反應(yīng)條件：PERV-env部分基因與β-actin基因PCR反應(yīng)條件為: 0.5 μL cDNA模板，0.25 μL Taq酶，上、下游引物各0.25 μL(50 pmol)，dNTP (2.5 mmol/L each) 1 μL，10× PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL，最后加無(wú)RNA酶水至25 μL。將上述各成分置PCR 管混勻后于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s，退火溫度45 s(溫度待定)，72℃ 30 s；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6.2.2 最佳Mg2+濃度的確定:在其它條件相同的情況下，觀察Mg2 +終濃度在1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mmol/L 的情況下，PCR擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)其亮度和特異性，確定適宜的MgCl2濃度。

1.6.2.3 PCR擴(kuò)增最佳循環(huán)數(shù)的確定:循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。在其它條件相同的情況下，觀察PERV-env部分基因在循環(huán)數(shù)為：26、28、30、32、34；β-actin基因在循環(huán)數(shù)為22、24、26、28、30時(shí)PCR 擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)其亮度確定適宜的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

1.7 電泳圖片的獲得和定量分析

將PCR產(chǎn)物按常規(guī)方法電泳，經(jīng)凝膠成像儀拍照后，用定量分析軟件UN-SCAN-IT分別測(cè)定目的基因片段OD值和內(nèi)參β-actin基因片段A值。以待測(cè)目的基因片段實(shí)測(cè)A值/β-actin基因片段實(shí)測(cè)A值的比值，代表目的基因片段mRNA的相對(duì)含量。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，然后用SAS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

目的基因mRNA相對(duì)含量=

2 結(jié)果

2.1 PERV-env全基因擴(kuò)增及分析結(jié)果

通過(guò)RT-PCR從巴馬小型豬外周血白細(xì)胞中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約2 000 bp的片段，將該片段克隆、測(cè)序，結(jié)果獲得的廣西巴馬小型豬PERV-env全長(zhǎng)基因大小為1 983 bp，編碼660 aa，GenBank登錄號(hào)為：EU086225。將該毒株序列與國(guó)外AF417232(美國(guó))、AY534306(德國(guó))、EU789636(俄國(guó))、LC03396(日本)、HQ540591(韓國(guó))、AJ288588(法國(guó))、AF014162(英國(guó))及國(guó)內(nèi)AY751803(中國(guó)版納小型豬)、AF507940(中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬)、AY850198(中國(guó)五指山小型豬)進(jìn)行同源性比較，結(jié)果同源性在75.7-99.3之間，與法國(guó)毒株同源性最低，與中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬及韓國(guó)毒株同源性最高，與國(guó)內(nèi)五指山豬PERV及版納豬PERV的同源性分別為96.2和95.4。遺傳進(jìn)化分析亦可看出巴馬小型豬PERV與中國(guó)實(shí)驗(yàn)小型豬及韓國(guó)毒株位于同一簇(圖1)。由此看出要想較準(zhǔn)確的測(cè)定廣西巴馬小型豬PERV組織表達(dá)譜，應(yīng)該選用來(lái)自廣西巴馬小型豬PERV-env基因序列設(shè)計(jì)引物。

2.2 半定量RT-PCR反應(yīng)條件的篩選

2.2.1 內(nèi)參基因β-actin及目的基因PERV-env退火溫度的確定 :β-actin基因擴(kuò)增片段大小為447 bp，經(jīng)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增得到的基因序列與參考序列同源性為99%。按方法1.6.2.1，選擇了58℃、60℃、62℃、64℃等4個(gè)退火溫度，經(jīng)PCR反應(yīng)后，通過(guò)測(cè)定目的片段的凈灰度，確定其最佳退火溫度為64℃(圖2A)。按同樣的方法，PERV-env部分基因PCR擴(kuò)增片段大小約265 bp，通過(guò)測(cè)定目的片段的凈灰度，確定其最佳退火溫度為58℃(圖2B)。

2.2.2 Mg2+濃度對(duì)PERV-env部分基因和β-actin擴(kuò)增效率的影響 :擴(kuò)增結(jié)果顯示：PERV-env部分基因和β-actin基因在Mg2+濃度為1.0、1.25、1.5和2.0 mmol/L時(shí)PCR擴(kuò)增效率均過(guò)低，只有在1.75 mmol/L 時(shí)PCR的特異性和擴(kuò)增效率良好(圖3 A；B)。

2.2.3 PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)PERV-env部分基因和β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的影響:試驗(yàn)結(jié)果顯示目的基因PERV-env和內(nèi)參β-actin PCR產(chǎn)物量均隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加而增強(qiáng)(圖4A，B)，說(shuō)明PCR反應(yīng)均未達(dá)到反應(yīng)的平臺(tái)期。為避免平臺(tái)效應(yīng)的影響，選擇擴(kuò)增反應(yīng)在到達(dá)平臺(tái)期前的線性范圍內(nèi)且電泳條帶清晰的相應(yīng)循環(huán)數(shù)作為PCR反應(yīng)最佳循環(huán)數(shù)。

圖1 巴馬小型豬PERV-env基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Phylogentic analysis of PERV-env genes in the Bama minipigs

A：β-actin基因； B： PERV-env部分基因圖A泳道：1. 58℃；2. 60℃；3. 62℃；4. 64℃；M. DL-2000 DNA marker圖B泳道：M. DL-2000 DNA marker；1. 54℃；2. 56℃；3. 58℃；4. 60℃；5. 62℃，6. 64℃圖2 不同退火溫度下β-actin基因及PERV-env部分基因擴(kuò)增結(jié)果A：β-actin：1. 58℃；2. 60℃；3. 62℃；4. 64℃；M. DL-2000 DNA marker.B：PERV-env：M. DL-2000 DNA marker；1. 54℃；2. 56℃；3. 58℃；4. 60℃；5. 62℃；6. 64℃.Fig.2 Amplification products of β-actin and PERV-env at different annealing temperatures

A：PERV-env部分基因；B：β-actin基因圖A、圖B泳道(相同)：1. 1.0 mmol/L；2. 1.25 mmol/L；3. 1.5 mmol/L；4. 1.75 mmol/L；5. 2.0 mmol/L圖3 不同Mg2+濃度對(duì)PERV-env部分基因和 β-actin基因擴(kuò)增效率的分析Note. A：PERV-env; B：β-actin. 1. 1.0 mmol/L; 2. 1.25 mmol/L; 3. 1.5 mmol/L; 4. 1.75 mmol/L; 5. 2.0 mmol/L.Fig.3 Analysis of amplification efficiency of PERV-env and β-actin with different Mg2+ concentration

本試驗(yàn)選取30個(gè)循環(huán)作為待測(cè)PERV-env基因的最佳循環(huán)數(shù)；而選取28個(gè)循環(huán)為內(nèi)參β-actin基因最佳循環(huán)數(shù)。

2.3 以β-actin為內(nèi)參對(duì)PERV-env部分基因定量測(cè)定

以β-actin為內(nèi)參，采用雙管法對(duì)不同組織樣品進(jìn)行半定量RT-PCR分析，分別測(cè)定各自PCR產(chǎn)物電泳條帶的OD值，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次取均值，經(jīng)計(jì)算各個(gè)組織mRNA相對(duì)含量分別為：肝臟：0.85；心臟：0.90；胰腺：0.70；腎臟：1.31；脾臟：0.89；胸腺：0.86；肺：0.85；卵巢：0.84；外周血：1.28。以SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明PERV-env在mRNA上述組織中均有表達(dá)，但在不同組織中表達(dá)存在明顯差異，腎臟和外周血白細(xì)胞表達(dá)豐度最高(P<0.05)，胰腺的表達(dá)豐度最低，其它組織表達(dá)豐度差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

3 討論

A：PERV-env部分基因；B：β-actin基因圖A泳道：1. 34循環(huán)；2. 32循環(huán)；3. 30循環(huán)；4. 28循環(huán)；5. 26循環(huán)圖B泳道：1. 22循環(huán)；2. 24循環(huán)；3. 26循環(huán)；4. 28循環(huán)；5. 30循環(huán)圖4 不同循環(huán)數(shù)對(duì)PERV-env部分基因及 β-actin擴(kuò)增效率影響Note. A：PERV-env：1. 34 cycles; 2. 32 cycles; 3. 30 cycles; 4. 28 cycles; 5. 26 cycles.B：β-actin：1. 22 cycles; 2. 24 cycles; 3. 26 cycles; 4. 28 cycles ; 5. 30 cycles.Fig.4 Effects of different cycles on the amplification efficiency of PERV-env partial gene and β-actin.

目前用于定量分析mRNA表達(dá)量主要方法有：半定量RT-PCR、Northern印跡雜交、cDNA微陣列和寡聚核苷酸微陣列技術(shù)以及目前發(fā)展迅速的實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。后幾種方法特異性好、具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，但是成本高，對(duì)儀器設(shè)備和樣品處理要求高且步驟繁瑣。半定量RT-PCR以其簡(jiǎn)單、快速、方便、可同時(shí)測(cè)定幾個(gè)基因且所需費(fèi)用低、普通實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。但利用半定量RT-PCR法分析基因表達(dá)水平的影響因素較多，要提高半定量RT-PCR法的準(zhǔn)確性，最關(guān)鍵的是優(yōu)化試驗(yàn)條件。首先必須選擇一個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的基因作為參照，如常用的有GAPDH、β-actin、18S等；其次所提的mRNA純度要高，完整性要好并達(dá)到一定的濃度，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定，其吸光度值A(chǔ)260/A280在1.8～2.0 時(shí)，符合實(shí)驗(yàn)要求。在優(yōu)化試驗(yàn)條件中，選擇合適的循環(huán)數(shù)是PCR 半定量方法的關(guān)鍵因素，但它必須在指數(shù)內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，保證產(chǎn)物與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系。此外合適的退火溫度與Mg2+濃度也會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

自從發(fā)現(xiàn)PERV對(duì)異種移植存在潛在的病毒生物安全性以來(lái)，尋找無(wú)PERV或低拷貝PERV的小型豬，開(kāi)展小型豬中內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的存在狀況調(diào)查及其潛在的危害性的研究一直是研究的熱點(diǎn)[4-6]。目前的研究發(fā)現(xiàn)PERV在不同的豬種之間負(fù)載不平衡，不同豬種攜帶PERV亞型也不盡相同[7,8]。雖然PERV在腎、肝、脾、肺、胸腺、胰腺、卵巢、腦神經(jīng)、外周血白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等組織均有表達(dá)，但表達(dá)的拷貝數(shù)有差異。靳二輝[9]采用RT-PCR技術(shù)對(duì)近交系五指山小型豬15種組織內(nèi)PERV的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PERV在心臟、肝臟、腎臟表達(dá)較弱，在免疫組織表達(dá)較強(qiáng)。因此檢測(cè)PERV mRNA在不同豬種、不同組織中的表達(dá)情況對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)用豬的挑選及豬—人異種器官移植均具有重要意義。在進(jìn)行豬—人異種移植時(shí)，可以選用病毒負(fù)載較低組織作為供體，可以降低異體移植潛在的危險(xiǎn)性。

本試驗(yàn)采用半定量RT-PCR方法，首次對(duì)PERV-env mRNA在巴馬小型豬各個(gè)組織中表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所采集的十個(gè)組織樣品中均可以檢測(cè)到PERV-env mRNA的表達(dá)。SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，腎、外周血白細(xì)胞中PERV表達(dá)豐度最高，肺、心、肝、脾、胸腺、卵巢次之，胰腺中PERV表達(dá)豐度最低。肺、心、肝、脾、胸腺、卵巢表達(dá)豐度差異不顯著(P>0.05)，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果基本一致[10,11]。

關(guān)于選擇PERV低拷貝豬及PERV表達(dá)豐度較低的器官進(jìn)行異種移植，以降低其潛在的危害性問(wèn)題學(xué)者們進(jìn)行了大量研究。Patience 等[1]在1997年首先提出PERV5′端或部分結(jié)構(gòu)基因的缺失會(huì)造成部分拷貝失去轉(zhuǎn)錄活性和功能，因此并不是所有的拷貝都具有感染活性。然而，PERV各基因可以通過(guò)互補(bǔ)或重組產(chǎn)生具有生物活性的病毒顆粒，因此可以通過(guò)選擇性育種降PERV的拷貝數(shù)以達(dá)到降低異種移植風(fēng)險(xiǎn)的目的。Clemenceau等[10]在1999年通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬胰島細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞所含PERV前病毒的負(fù)荷相對(duì)較低，認(rèn)為進(jìn)行豬胰島細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞異種移植發(fā)生PERV感染的潛在危險(xiǎn)性可能要比移植豬腎、肝等器官要小。最近，國(guó)際異種器官移植協(xié)會(huì)發(fā)表了一份聯(lián)合聲明，啟動(dòng)在上個(gè)世紀(jì)九十年代被停止的豬胰島產(chǎn)品在1型糖尿病治療方面的臨床試驗(yàn)， 重新評(píng)價(jià)胰島在異種移植方面的安全性[12]?？傊?，在未來(lái)的5到10年，在適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)和監(jiān)管控制下，豬的胰島異種移植材料被認(rèn)為是一種可行的手段，解決臨床上胰島遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求的問(wèn)題[13]。本研究發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬胰腺中PERV表達(dá)豐度最低，可初步認(rèn)為以巴馬小型豬胰島細(xì)胞進(jìn)行異種移植發(fā)生PERV感染的潛在危險(xiǎn)性可能要低于其它器官。由于本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物個(gè)體數(shù)量有限，只得出了初步的結(jié)論，還需要做更多細(xì)致的工作。

[1] Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs [J]. Nat Med, 1997, 3(3): 282-286.

[2] Takeuchi Y, Patience C, Magre S, et al. Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus [J]. J Virol, 1998, 72: 9986-9991.

[3] 吳健敏，呂茂民，陳鳳蓮，等.中國(guó)特有小型豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜基因的克隆及進(jìn)化分析 [J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2006, 22 (10): 925-928.

[4] Ma Y, Yang Y, Lv M, et al. Real-time quantitative polymerase chain reaction with SYBR green I detection for estimating copy numbers of porcine endogenous retrovirus from Chinese miniature pigs [J].Transplant Proc, 2008, 28(3): 160-163.

[5] 李金澤, 岳敏, 張建明，等. 四種小型豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因研究 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2008, 28(3): 160-163.

[6] 連正興, C. Rogel-Gaillard, 李寧, 等. 利用半定量PCR方法分析中國(guó)地方豬種內(nèi)源病毒序列拷貝數(shù)的多態(tài)性 [J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2002, 33(6): 521-524.

[7] Heneine W, Tibell A, Switzer WM, et al. No evidence of infection with porcine endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xenografts [J]. Lancet, 1998, 352(9129): 695-699.

[8] Blusch JH, Roos C, Nitschko H. A polymerase chain reaction-based protocol for the detection of transmission of pig endogenous retroviruses in pig to human xenotransplantation [J]. Transplantation, 2000, 69(10): 2167-2172.

[9] 靳二輝. 近交系五指山小型豬解剖和組織學(xué)研究及內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)的檢測(cè) [D]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[10] Clemenceau B, Lalain S, Martignat L, et al. Porcine endogenous retroviral mRNA in pancreas and a panel of tissues from specific pathogen free pig [J]. Diabetes Metab,1999, 25(6): 518-525.

[11] 丁生財(cái)，陳意生，魏私，等. PERV在豬外周血白細(xì)胞DNA和組織mRNA中的表達(dá)及其差異性分析 [J]. 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2004, 37(5): 351-358.

[12] Matsumoto S,Tomiya M, Sawamoto O. Current status and future of clinical islet xenotransplantation [J]. J Diabetes. 2016, 10: 1753-0407.

[13] Spizzo T, Denner J, Gazda L, et al. First update of the International Xenotransplantation Association consensus statement on conditions for undertaking clinical trials of porcine islet products in type 1 diabetes — Chapter 2a: source pigs-preventing xenozoonoses [J]. Xenotransplantation, 2016, 23(1): 25-31.

Cloning of PERV-env in GXBM minipig and analysis of its tissue expression profile

ZHONG Hua1,PAN Han-shi2,MA Ling2, LONG Han1, CHEN Feng-lian2, LIAO Yan-juan1, TANG Hai-bo2, WU Jian-min2

(School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University for Nationalities, Nanning 53001, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 53001 )

Objective To clone partial env genes of porcine endogenous retrovirus (PERV) isolated from Guangxi Bama minipigs and study their expression differences in different organ tissues. Method The PERV-env genes from peripheral blood leukocytes of Bama minipigs were amplified by RT-PCR, and their homology and phylogenetic analysis were compared with those of some other PERV-env genes published home and abroad. The PERV-env genes obtained by amplification from Bama minipig were used as templates to design primers for analysis on the expressions of PERV mRNA in different tissues of the Bama minipig with a semi-quantitative RT-PCR analysis. Result Differences in the expression levels of PERV mRNA were detected in nine organ tissues of Bama minipig, in which the abundance of PERV mRNA in kidney and peripheral blood lymphocytes was the highest, followed by that in lung, heart, liver, spleen, thymus and ovary, but the expression differences among the six organs were not significant (P>0.05), while the expression abundance of PERV mRNA in pancreas was the lowest. Conclusions The potential risk of PERV infection in using the islet cells of Bama mini pig for xenotransplantation is probably lower than using the other organs. However, further research is still needed.

Bama minipig; PERV-env genes; Semi-quantitative RT-PCR; Tissue expression profile; Xenotransplantation

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260613)；廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFBA019123)； 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(12-071-28-B-3)。

鐘華(1981-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。Email: 17737290@qq.com。

吳健敏(1963-)，女，研究員，博士生導(dǎo)師，研究生方向:動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)。E-mail： wu-jm20@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0001-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.001

2016-08-05