金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶PtT1的克隆與生物信息學(xué)分析

李 媛 李國(guó)棟 張愛(ài)麗 錢子剛

云南中醫(yī)學(xué)院中藥材優(yōu)良種苗繁育工程中心，云南 昆明 650500

金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶PtT1的克隆與生物信息學(xué)分析

李 媛 李國(guó)棟 張愛(ài)麗*錢子剛*

云南中醫(yī)學(xué)院中藥材優(yōu)良種苗繁育工程中心，云南 昆明 650500

目的：克隆金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶(PtT1)全長(zhǎng)基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆金鐵鎖PtT1全長(zhǎng)cDNA，命名為PtT1，并通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)該基因進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)等分析。結(jié)果：克隆得到PtT1基因，其cDNA全長(zhǎng)1529bp，ORF長(zhǎng)1377bp，編碼458個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為51.25KDa，等電點(diǎn)5.80，定位于線粒體，與同科植物香石竹糖基轉(zhuǎn)移酶基因DcT227具有很高的同源性。結(jié)論：成功克隆、分析了金鐵鎖PtT1基因，為金鐵鎖該基因的后續(xù)功能鑒定提供了基礎(chǔ)。

金鐵鎖；糖基轉(zhuǎn)移酶；生物信息學(xué)

植物中化合物的糖基化是一種很普遍的生理現(xiàn)象，是植物細(xì)胞維持代謝平衡的主要機(jī)制之一[1]。糖基轉(zhuǎn)移酶則是負(fù)責(zé)催化分子糖基化修飾反應(yīng)的酶，其可將活性糖基從尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖(UDP-glucose)轉(zhuǎn)移至次級(jí)代謝物及植物內(nèi)外源毒性物質(zhì)等一系列植物小分子化合物受體中[2]。糖基化經(jīng)常是次生代謝產(chǎn)物主要的后修飾方式，往往修飾合成途徑中的最終一步或幾步。植物三萜皂苷類次生代謝產(chǎn)物，往往都具有較高的藥理活性價(jià)值。其合成途徑可前體形成，骨架構(gòu)建及后修飾等三個(gè)過(guò)程[3]。次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的基本骨架形成之后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450 酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等一系列關(guān)鍵酶基因的后修飾，最終形成眾多種類繁多的三萜皂苷[4]。

金鐵鎖來(lái)源于石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C. Y. Wu的干燥根[5]。主要分布在云南、貴州、西藏等省，為云南的道地藥材[6]，是云南白藥等中成藥的重要主要組成藥之一。其活性成分為齊墩果烷型的三萜總皂苷[7-8]，具有顯著鎮(zhèn)痛、抗炎等的藥理活性[9-10]。目前，參與金鐵鎖三萜皂苷合成途徑前體形成，骨架構(gòu)建等過(guò)程的關(guān)鍵酶基因都已有報(bào)道[11-12]，而后修飾環(huán)節(jié)中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因還未見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物克隆了一條金鐵鎖PtT1家族基因，命名為PtT1，并采用生物信息學(xué)軟件對(duì)其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、功能及系統(tǒng)演化關(guān)系等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果將為金鐵鎖PtT1基因的功能鑒定研究奠定基礎(chǔ)，揭示金鐵鎖三萜皂苷的分子形成機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 植物材料 金鐵鎖采集于云南省麗江市，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院錢子剛教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C. Y. Wu。

1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)(eppendorf)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(BIO-RAD公司)；DYC-33A微型電泳槽(BIO-RAD公司)；凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(BIO-RAD公司)；移液槍(范圍100～1000μL，20～200μL，0.5～10μL)(eppendorf)。

1.3 試劑 EastepTM總RNA提取試劑盒(普洛麥格生產(chǎn)批號(hào)：7020001018)； PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa生產(chǎn)批號(hào)：AK3201)；TransStart KD Plus DNA Polymerase(Trans生產(chǎn)批號(hào)：K10511)；薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(GENEray生產(chǎn)批號(hào)：1601G20)；pEASY-T1 cloning kit(Trans生產(chǎn)批號(hào)：I40914)； DL2000 DNA Marker(TaKaRa生產(chǎn)批號(hào)：A2101A)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 方法

2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組中糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物PtT1-F: AAAAATGAAACACCAAGAAAAGCAG，PtT1-R: GATTGAAGAAACCAAAGAAGGGGGC。

2.2PtT1基因的克隆 按照EastepTM總RNA提取試劑盒(普洛麥格)說(shuō)明書(shū)提取金鐵鎖根中的總RNA；并根據(jù)PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以cDNA為模板使用TransStartKD Plus DNA Polymerase(AP301)通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段。

表1 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件：94℃、5min；94℃、30s;45℃、30s，68℃、2 min30sec，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選取較亮的目的條帶進(jìn)行回收純化，并將回收產(chǎn)物與1μL pEASY-T1 cloning kit(Trans)配成連接體系，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含Amp+抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選白色單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取陽(yáng)性單克隆過(guò)夜搖菌保種后測(cè)序。

2.3 金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶基因的生物信息學(xué)分析 在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站上通過(guò)BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，應(yīng)用 BioEdit翻譯為氨基酸序列，使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)確定開(kāi)放閱讀框。并用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量等；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件進(jìn)行疏水性分析；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)工具預(yù)測(cè)PtT1蛋白的跨膜螺旋區(qū)；Signal 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；利用在線工具TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測(cè)PtT1的亞細(xì)胞定位情況。使用PORTER對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)SWISS-MODEL(http://swissmodel. expasy.org/interactive/k5MUhF/models/)服務(wù)器對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；然后使用MEGA 5.0軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 金鐵鎖PtT1基因的克隆 以金鐵鎖根cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到2000bp左右的片段。使用pEASY-T1載體通用引物對(duì)單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)為陽(yáng)性克隆后送樣測(cè)序，結(jié)果表明擴(kuò)增序列與轉(zhuǎn)錄組序列基本一致。見(jiàn)圖1。

3.2PtT1基因的生物信息學(xué)分析PtT1糖基轉(zhuǎn)移酶cDNA全長(zhǎng)1529bp，ORF長(zhǎng)1377bp，編碼458個(gè)氨基酸。通過(guò)Blastn比對(duì)分析可知與石竹科香石竹同源性最高，為81%。采用ProtParam工具預(yù)測(cè)PtT1編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，從分析結(jié)果中可知PtT1的分子質(zhì)量為51.25KDa，理論等電點(diǎn)為5.80；在組成糖基轉(zhuǎn)移酶的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占的比例最高，達(dá)到11.4%；PtT1的不穩(wěn)定指數(shù)為37.19，為穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為90.44。采用ProtScale分析PtT1氨基酸序列的疏水性/親水性，結(jié)果顯示415左右位置有一個(gè)典型的親水性區(qū)域，見(jiàn)圖2。

利用TMHMM 2.0對(duì)PtT1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。推測(cè)其不存在跨膜區(qū)域，該糖基轉(zhuǎn)移酶編碼的蛋白不屬于跨膜蛋白。見(jiàn)圖3

使用SignalP 3.0對(duì)PtT1蛋白質(zhì)的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，由神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析可判斷該蛋白不存在信號(hào)肽。隱馬爾夫模型進(jìn)一步證實(shí)了金鐵鎖PtT1編碼的蛋白是非分泌蛋白質(zhì)，沒(méi)有信號(hào)肽存在。將PtT1編碼的蛋白質(zhì)序列輸入在線細(xì)胞定位分析工具TargetP 1.1服務(wù)器，分析表明目的蛋白的分泌途徑為線粒體型，即定位在線粒體上。

對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶PtT1的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，在190位到442位之間存在高度保守的結(jié)構(gòu)功能域—UDPGT，即UDPGT家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域。見(jiàn)圖4。

利用PORTER對(duì)金鐵鎖PtT1進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(H)占44.32%，β-折疊(E)占12.45%，無(wú)規(guī)則卷曲(C)占43.23%，該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)屬于混合型。利用Swiss-Model Workspace對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。見(jiàn)圖5。

將金鐵鎖PtT1與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中17種植物的糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白進(jìn)行Clustal W比對(duì)分析后，利用MEGA 5.1中的Neighbor-Joining 方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明金鐵鎖與同科植物香石竹聚為一類，親緣關(guān)系最近；其次與北柴胡、小麥、擬南芥等植物的親緣關(guān)系也比較接近，與蓖麻等植物中的PtT1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。見(jiàn)圖6。

4 討論

糖基轉(zhuǎn)移酶催基因催化三萜皂苷骨架糖基化的反應(yīng)，其通過(guò)催化生物物體內(nèi)已活化的糖，連接到不同的受體分子上，對(duì)一系列化合物進(jìn)行激活、抑制或者調(diào)節(jié)溶解度，從而參與植物體多種調(diào)控和代謝途徑。目前已發(fā)現(xiàn)的催化植物中天然產(chǎn)物糖基化的酶均屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族Ⅰ，其作用是將活性糖基從核苷糖(尿嘧啶核苷二磷酸糖)轉(zhuǎn)移到包括次生代謝物在內(nèi)的多種植物小分子化合物受體上[13]。

目前，僅有少數(shù)幾個(gè)參與三萜皂苷生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶被報(bào)道[14-19]。本研究立足于金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從金鐵鎖根中克隆得到一條糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtT1，其cDNA全長(zhǎng)1529bp，ORF長(zhǎng)1377bp，編碼458個(gè)氨基酸。Blast比對(duì)分析可知與同科植物香石竹有較高的同源性，保守結(jié)構(gòu)域分析顯示其具有UDPGT家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明所得糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白具有較高的結(jié)構(gòu)保守性。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)該基因與香石竹、北柴胡、擬南芥等植物的親緣關(guān)系比較接近。為進(jìn)一步研究金鐵鎖糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌異源表達(dá)，三萜皂苷合成代謝途徑及其關(guān)鍵酶表達(dá)模式等研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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Cloning ofPtT1 genes of Psammosilene tunicoides and Bioinformatics

LI Yuan LI Guodong ZHANG Aili*QIAN Zigang*

Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants, Yunnan University of Traditional, Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Subject To clone the glycosyltransferase gene(PtT1) inPsammosilenetunicoides, and to analyze the bioinformation ofPtT1. Methods cDNA was reversely transcriped according to the Transcriptome Sequencing. The protein characteristics was analyzed and the phylogenetic tree ofPtT1 was constructed using the bioinformatics. ResultsThe 1529bp sequence inP.tunicoideswas obtained, which has a 1377bp ORF, encoding 458 amino acids. The protein molecular weight was51.25KD, with the isoelectric point of 5.80. The protein was located at mitochondria. ThePtT1 in P.tunicoides was most similar with DianthuscaryophyllusDcT227 by NCBI blast. Conclusions ThePtT1 in P. tunicoides was successfully cloned and analyzed, which provides the foundation for this gene function characterization.

Psammosilenetunicoides; Glycosyltransferase; Bioinformation

國(guó)家自然科學(xué)基金(NO: 81260609)；云南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(NO: 2015119)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(NO:2015J101)。

李媛(1991-)，女，漢族，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail:365408783@qq.com

錢子剛(1962-)，男，漢族，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)分子生物學(xué)。E-mail: qianzig@ailiyun.com；

張愛(ài)麗(1986-)，女，漢族，講師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)分子生物學(xué)。

R914.1

A

1007-8517(2017)04-0023-04

2016-12-05 編輯：梁志慶)