Ubc9在胃癌中的表達及其與耐藥蛋白的相關(guān)性研究

(太原市第九人民醫(yī)院，山西 太原 030008)

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，根據(jù)全球癌癥研究機構(gòu)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，胃癌位于全球惡性腫瘤發(fā)病的第五位，死亡率位于第三位。我國是胃癌高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率分別占到全球的42.6%和45.0%[1]。泛素結(jié)合酶9(Ubiquitin-conjugating enzyme 9,Ubc9)是小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin related modifier，SUMO)過程中唯一的結(jié)合酶，Ubc9在細胞增殖、有絲分裂、周期進程、分化等方面發(fā)揮著重要作用[2]，最近的研究表明，Ubc9在多種腫瘤中過表達，可能參與了腫瘤發(fā)生、進展的病理過程，并且可能與腫瘤的耐藥相關(guān)[3]，本研究觀察了Ubc9及耐藥相關(guān)蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)在胃癌中的表達及相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 實驗方法

1.1 一般資料

收集太原市第九人民醫(yī)院普通外科2016年4月～2017年4月入院手術(shù)切除的胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織(距離腫物>5 cm)標(biāo)本40例，標(biāo)本收集以不影響術(shù)后病理診斷為前提，所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理診斷為胃腺癌。納入研究的患者術(shù)前均未經(jīng)任何形式的放化療及靶向治療，均為散發(fā)病例，無家族史。其中：男27例，女13例，年齡42～71歲，中位年齡55.7歲；腫物≤5 cm者25例，>5 cm者15例；高分化10例，中低分化30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ者26例，Ⅲ+Ⅳ者14例。

1.2 試劑及儀器

試劑：Ubc9單克隆抗體：Santa-cruz(sc-130281)；MRP單克隆抗體：北京中杉金橋(ZM-0345)；P-gp多克隆抗體：北京博奧森(bs-0563R)；生物素標(biāo)記的IgG二抗：北京中杉金橋。儀器：石蠟切片機、攤片烤片機：德國Leica；全自動脫水機：美國Thermo Fisher。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測Ubc9, MRP及P-gp在胃癌組織及癌旁組織中的表達

收集的組織標(biāo)本立即置于中性福爾馬林液中固定24 h，全自動脫水機脫水、包埋至蠟塊；常規(guī)石蠟切片，厚度5μm，多聚賴氨酸處理的載玻片撈片，烤片機烤片5h；枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性生物素及過氧化物酶，血清封閉；滴加一抗，4℃過夜反應(yīng)，以PBS代替一抗作為陰性對照；滴加二抗，37℃反應(yīng)30 min；DAB顯色，蒸餾水終止顯色；蘇木精復(fù)染細胞核，封片裱片。 免疫組化結(jié)果判定方法：Ubc9蛋白的陽性信號定位于細胞質(zhì)或/和細胞核，以染色強度(-為0分，+為1分，++為2分，+++為3分)和陽性細胞百分比(<5%為0分; 5%～24%為1分; 25%～49%為2分; 50%～74%為3分;>75%為4分)的乘積進行評分，評分<6分為低表達，≥6分為高表達。MRP及P-gp蛋白的陽性信號定位于細胞膜或/和細胞漿，陽性細胞數(shù)<10%為陰性表達，≥10%為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用計數(shù)資料的關(guān)聯(lián)性分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ubc9、MRP及P-gp在胃癌組織及癌旁組織中的表達

Ubc9、MRP及P-gp在胃癌組織中的高表達/陽性表達率依次為：62.5%,32.5%及72.5%，在癌旁組織中的高表達/陽性表達率依次為：15.0%, 10.0%及22.5%，與癌旁組織相比，三者在癌組織中的表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌組織及癌旁組織中的表達

圖1 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌組織及癌旁組織中的表達

IHC×200

(A:Ubc9在癌旁組織中低表達，B：Ubc9在癌組織中高表達；C:P-gp在癌旁組織中陰性表達， D：P-gp在癌組織中陽性表達；E:MRP在癌旁組織中陰性表達，B：MRP在癌組織中陽性表達)

2.2 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌組織中的表達與臨床病理特征的關(guān)系

Ubc9的表達與患者的性別、年齡、腫物大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系(P>0.05)，與腫瘤的分化程度及TNM分期有關(guān)(P<0.05)；MRP的表達與患者的性別、年齡、腫物大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無明顯關(guān)系(P>0.05)；P-gp的表達與患者的性別、年齡、腫物大小無明顯關(guān)系(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表1 Ubc9,MRP及P-gp在胃癌組織中的表達與臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 Ubc9的表達與MRP及P-gp表達的相關(guān)性

胃癌組織中，Ubc9的表達與MRP的表達無顯著相關(guān)性(P>0.05)，與P-gp的表達呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 Ubc9的表達與MRP及P-gp表達的相關(guān)性

3 討論

SUMO化修飾可參與基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種途徑，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要機制之一，不恰當(dāng)?shù)腟UMO化修飾是多種疾病，尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要分子生物事件[4]。Ubc9基因于1996年首次通過酵母雜交實驗被克隆，1997年被確定為SUMO化修飾過程中的唯一結(jié)合酶，在人類器官組織中普遍表達，在睪丸、胸腺等組織中高表達[5]。Ubc9參與的SUMO化過程與腫瘤密切相關(guān)，目前的研究結(jié)果顯示：Ubc9在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中過表達，通過RNA干擾等方式下調(diào)Ubc9基因的表達可抑制腫瘤細胞增殖[6]。Chen等[7]學(xué)者的研究結(jié)果顯示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Ubc9的高表達提示預(yù)后不良，并且臨床化療反應(yīng)性差，F(xiàn)ang等[8]的研究表明下調(diào)Ubc9基因的表達可增加肝癌細胞對多柔比星的化療敏感性，提示Ubc9還可能與腫瘤的多藥耐藥相關(guān)。P-gp及MRP介導(dǎo)的多藥耐藥是目前研究最為深入的腫瘤耐藥機制之一，包括胃癌在內(nèi)的多種實體瘤的多藥耐藥與其密切相關(guān)。P-gp主要介導(dǎo)多種親脂性化療藥物，包括抗生素類如多柔比星、長春新堿、依托泊苷等。MRP識別和轉(zhuǎn)運與谷胱甘肽耦合的藥物，如柔紅霉素、順鉑等[9]。本研究初步觀察Ubc9、P-gp及MRP在胃癌中的表達及相關(guān)性，為胃癌的研究提供新的思路。

本實驗結(jié)果表明：Ubc9在胃癌及癌旁組織中均有不同程度的表達，但在癌組織中的高表達率顯著高于癌旁組織，提示Ubc9可能參與了胃癌發(fā)生發(fā)展的病理過程。此外，Ubc9與患者年齡、性別、腫物大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)，但在中低分化胃癌中的高表達率顯著高于高分化癌，在TNM分期Ⅲ+Ⅳ中的高表達率顯著高于Ⅰ+Ⅱ，說明Ubc9的表達可能與胃癌的惡性程度及預(yù)后相關(guān)。P-gp及MRP均屬于ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，雖然二者的分子構(gòu)成及具體作用機制不同，但相似的作用結(jié)果是可將藥物泵出細胞外，降低藥物在細胞內(nèi)的濃度，從而導(dǎo)致細胞耐藥。本研究結(jié)果表明：P-gp及MRP在胃癌中的表達顯著高于癌旁組織，MRP的表達與患者的性別、年齡、腫物大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無明顯關(guān)系，P-gp的表達與患者的性別、年齡、腫物大小無明顯關(guān)系，與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示：Ubc9的表達與MRP的表達無顯著相關(guān)性，與P-gp的表達呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示Ubc9可能參與了P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥過程。

綜上，Ubc9可能參與了胃癌的發(fā)生、進展的病理過程，并且可能與P-gp介導(dǎo)的耐藥過程相關(guān)，其具體的機制尚待進一步研究。值得注意的是：Ubc9參與的SUMO化過程具有相對可逆性，相信隨著研究的深入，該途徑有望成為腫瘤治療的基因和藥物靶點。

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