基于網絡藥理學的黃芪抗肺纖維化機制預測與驗證研究

黎金濃 何婭娜 周輝 鄧桂明

〔摘要〕 目的 通過網絡藥理學分析和實驗驗證闡釋黃芪抗肺纖維化作用機制。方法 從中藥系統藥理學數據庫和分析平臺、中藥分子機制的生物信息學分析工具中獲取黃芪所有化學成分和對應靶點，從DrugBank和DisGeNET數據庫獲取肺纖維化疾病相關靶點，兩者取交集，獲得黃芪治療肺纖維化潛在作用靶點，采用Cytoscape構建成分-靶點圖，拓撲分析后通過Degree值篩選黃芪治療肺纖維化關鍵活性成分，通過STRING構建靶點蛋白相互作用圖，篩選核心靶點，通過基因在線富集分析工具Enrichr分析獲得黃芪治療肺纖維化所涉及的通路;觀察黃芪提取物對博來霉素誘導的大鼠肺泡巨噬細胞TGF-β、PTGS2和p-ERK1/2蛋白表達的影響。結果 黃芪含有76個化學成分，作用于563個靶點，肺纖維化疾病相關靶點932個，交集靶點97個，黃芪活性成分-肺纖維化疾病靶點網絡圖中Degree值排名前4的成分依次為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、大豆苷元（daidzein）、刀豆氨酸（canavanine），預測核心靶點分別為PTGS2、MAPK1、MAPK14、EGF、JUN等，涉及糖尿病并發(fā)癥相關AGE-RAGE、流體切應力與動脈粥樣硬化、癌癥、IL-17等信號通路;低、中、高劑量黃芪提取物均能夠降低博來霉素誘導的NR8383細胞TGF-β1、PTGS2的含量（P<0.05），并下調其p-ERK1/2的表達（P<0.05或P<0.01）。結論 黃芪能夠通過多成分、多靶點、多作用途徑干預肺纖維化病理過程，其機制與抑制肺泡巨噬細胞TGF-β、PTGS2和p-ERK1/2表達有關，為進一步研究黃芪治療肺纖維化作用機制奠定基礎。

〔關鍵詞〕 肺纖維化;黃芪;網絡藥理學;效應機制;肺泡巨噬細胞

〔中圖分類號〕R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.018

Mechanism prediction and validation research of Huangqi （Astragali Radix） in the

treatment of pulmonary fibrosis based on network pharmacology

LI Jinnong， HE Yana， ZHOU Hui， DENG Guiming*

（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the potential mechanism of Huangqi （Astragali Radix） in the treatment of pulmonary fibrosis based on network pharmacology and experimental verification. Methods All chemical components and corresponding targets of Huangqi （Astragali Radix） were obtained from traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform and a bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine， and pulmonary fibrosis disease related targets were obtained from DrugBank and DisGeNET databases. The intersection of the two was taken to obtain the potential targets of Huangqi （Astragali Radix） in the treatment of pulmonary fibrosis. The component-target map was constructed by Cytoscape. After topological analysis， the key active components of Huangqi （Astragali Radix） in the treatment of pulmonary fibrosis were screened by Degree value. The target protein interaction map was constructed by STRING to screen the core targets. The pathways involved in the treatment of pulmonary fibrosis by Huangqi （Astragali Radix） were obtained by Enrichr analysis. The effects of Huangqi （Astragali Radix） extract on the expression of TGF-β， PTGS2 and P-ErK1/2 proteins in bleomycin-induced rat alveolar macrophages was observed. Results Huangqi （Astragali Radix） contained 76 chemical components that acted on 563 targets， 932 targets related to pulmonary fibrosis disease and 97 targets of intersection. The top 4 components in the map of Huangqi （Astragali Radix） components-targets of pulmonary fibrosis disease network were quercetin， kaempferol， daidzein， canavanine. The suppositional targets were PTGS2， MAPK1， MAPK14， EGF， JUN， involving AGE-RAGE in diabetic complications， fluid shear stress and atherosclerosis， cancer， IL-17 signaling pathway and so on. Low， medium and high doses of Huangqi （Astragali Radix） extract could down-regulate the content of TGF-β1 and PTGS2 in bleomycin-induced NR8383 cells （P<0.05）， and down-regulate the expression of P-ERK1/2（P<0.05， P<0.01）. Conclusion Huangqi （Astragali Radix） can act on the whole course of pulmonary fibrosis through multi-component， multi-target and multi-action pathway， the mechanism may be related to down-regulating the expression of TGF-β， PTGS2 and p-ERK1/2 in pulmonary macrophage， which provides a basis for studying on the mechanism of Huangqi （Astragali Radix） in treating pulmonary fibrosis.

〔Keywords〕 pulmonary fibrosis; Huangqi （Astragali Radix）; network pharmacology; effect mechanism; alveolar macrophages

肺纖維化（pulmonary fibrosis， PF）是一種慢性的、進行性的肺間質疾病，其病理特征體現為肺泡結構破壞、細胞外基質沉積、炎癥細胞浸潤以及纖維化伴蜂窩肺的形成，患者最終因呼吸衰竭而死亡[1-2]。該病發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，臨床多采用抗炎、抗纖維化等藥物進行治療，但效果不甚理想[3]。

近年來，中醫(yī)藥治療PF在臨床試驗研究中取得較大進展，中醫(yī)學認為PF屬于“肺痿”“肺痹”等范疇[4]?！端貑枴ち?jié)藏象論》曰：“肺者，氣之本?！薄蹲C治匯補·胸膈門·咳嗽》曰：“久咳肺虛……為肺痿之病?！痹跉馓?、血瘀、痰凝等病機中，氣虛貫穿病程始末[5]。因此，多數醫(yī)家在辨治PF時多以補氣扶正為主。研究表明，中醫(yī)治療PF的處方中，黃芪出現頻率最高[6]，這充分體現了中醫(yī)治病求本的中心思想。黃芪富含皂苷、黃酮、多糖等活性成分，藥理實驗表明，黃芪具有大補肺脾、益氣固表、補氣升陽、增強免疫等作用[7]，近期研究報道，黃芪總黃酮可有效減輕特發(fā)性PF小鼠的炎癥反應、PF，抑制TGF-β表達[8]，另有研究表明，黃芪甲苷具有調控miR-29的作用，抑制TGF-β1/Smad3信號通路，從而改善PF病理損傷[9]。但缺少系統的黃芪改善PF的機制研究。本研究采用網絡藥理學結合實驗驗證的方法，從整體、系統的角度探究藥物活性成分、作用靶點和疾病之間的關系，為黃芪治療PF機制研究提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 數據庫及軟件

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP， http：//tcmspw.com/tcmsp.php），中藥分子機制的生物信息學分析工具（a bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine， BATMAN-TCM， http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org），DrugBank數據庫（https：/go.drugbank.ca），DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/），Enrichr數據庫（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/），Cytoscape軟件（V3.2.1）。

1.2? 黃芪活性成分與靶點收集

以“黃芪”或“HUANG QI”為檢索詞，分別在TCMSP和BATMAN-TCM中檢索黃芪活性成分和對應靶點，并將靶點名稱通過UniProt數據庫統一轉換成Gene Names，收集整理黃芪活性成分對應的所有靶點。

1.3? PF疾病靶點收集

在DisGeNET數據庫、DrugBank數據庫搜索“pulmonary fibrosis”相關的疾病靶點，通過UniProt數據庫統一轉換為Gene Names。

1.4? 黃芪活性成分作用PF疾病靶點網絡拓撲分析

參考文獻[10]將黃芪活性成分作用靶點與PF疾病相關靶點合并取交集，得到黃芪治療PF的作用靶點，通過Cytoscape軟件構建成分-靶點網絡圖，行拓撲分析，并做可視化處理。

1.5? 黃芪治療PF潛在靶點富集分析

將上述交集靶點輸入Enrichr數據庫，查看KEGG通路富集分析結果。

1.6? 細胞實驗驗證

1.6.1? 實驗細胞及藥物? 大鼠肺泡巨噬細胞NR8383（中國藥科大學中藥學院饋贈，批號：CRL-2192）。黃芪飲片（湖南華夏湘眾藥業(yè)飲片有限公司，批號：200111）;注射用鹽酸博來霉素（日本化藥株式會社，批號：200501）。

1.6.2? 主要試劑及儀器? 大鼠TGF-β1、PTGS2/COX-2 ELISA試劑盒（武漢Elabscience生物科技公司，批號：AK0020OCT11001、AK0020MAY05001）;抗p-ERK1/2（美國CST公司，批號：4390）;兔多抗ERK1/2（武漢三鷹生物技術公司，批號：16443-1-AP）;胎牛血清FBS、高糖培養(yǎng)基DMEM（美國Gibco公司，批號：42A0378K、8119361）;CO2培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾公司，型號：Form311）;酶標儀、雙垂直電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：WD-2102B、DYCZ-25D）。

1.6.3? CCK8法檢測細胞增殖? 取指數生長期NR8383大鼠肺泡巨噬細胞，制備成5×104細胞/mL的細胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板中，分別加入不同濃度博來霉素和黃芪提取物，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h。取出細胞培養(yǎng)板，向每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度值。同時設置調零孔（培養(yǎng)基、CCK8）、對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解遞質、培養(yǎng)基、CCK8），每組設定3復孔。計算各組細胞的相對增殖率。

1.6.4? 博來霉素誘導NR8383細胞活化模型最優(yōu)條件篩選? 參考文獻[11-12]，選用博來霉素誘導巨噬細胞活化模型。CCK8法考察50、100、150 μg/mL博來霉素在12、24 h對細胞活力值的影響，ELISA法測定細胞上清中TGF-β1含量。

1.6.5? ELISA法測定細胞上清中TGF-β1和PTGS2含量? 按照試劑盒說明書繪制標準曲線，然后分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，按照說明書孵育、洗滌、加酶、顯色，終止后用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中TGF-β1和PTGS2濃度。

1.6.6? 分組與給藥? 分別稱取黃芪提取物凍干粉和鹽酸博來霉素粉末加DMSO溶解后過濾，分別制成1 mg/mL母液，使用時加培養(yǎng)基稀釋成相應濃度。實驗分為空白組、博來霉素組及黃芪低、中、高劑量組，除空白組外其余各組分別加入150 μg/mL博來霉素，然后黃芪低、中、高劑量組分別加入黃芪提取物20、40、60 μg/mL[5]，并置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間。

1.6.7? Weastern blot檢測NR8383細胞中ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白質水平? 按照上述實驗設計將細胞培養(yǎng)于6孔板，培養(yǎng)、干預后，洗凈培養(yǎng)液，用含PMSF的裂解液冰上裂解細胞，30 min后，設置為4 ℃，12 000 r/min，離心半徑6 cm，離心5 min，提取上清液，BCA法測定蛋白質濃度。取Marker和樣品，總蛋白量為40 μg進行電泳。轉PVDF膜，封閉1.5 h后，孵一抗，4 ℃，過夜。TBS-T緩沖液洗滌4次，每次10 min，孵育二抗，室溫1.5 h，洗滌5次，每次10 min，用顯色劑ECL試劑顯色、曝光。觀察各組細胞中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達水平。

1.6.8? 統計學方法? 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，符合正態(tài)分布且各組間方差齊時數據以“x±s”表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時，用Games-Howell（A）檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 黃芪活性成分及PF疾病靶點

通過檢索DisGeNET和DrugBank，共收集整理得到PF疾病相關靶點932個;通過檢索TCMSP和BATMAN-TCM數據庫，共收集整理得到黃芪活性成分76個，其對應靶點共計563個，其中97個與PF疾病靶點重合。見圖1。

2.2? 黃芪活性成分-PF疾病靶點網絡構建和拓撲分析

將黃芪活性成分-靶點數據通過Cytoscape軟件繪制出黃芪活性成分-PF疾病靶點相互作用網絡圖，同時行拓撲分析。黃芪活性成分Degree值排名前4的是槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、大豆苷元（daidzein）、刀豆氨酸（canavanine）。見圖2。

2.3? 黃芪干預PF核心靶點預測

將上述黃芪作用于PF疾病的97個靶點蛋白相互作用關系分析，靶點PTGS2、MAPK14、EGF、JUN、MAPK1、IL-6、TNF、VEGFA等處于核心位置。見圖3。

2.4? 黃芪治療PF靶點KEGG通路富集分析和可視化

將獲得的黃芪治療PF的97個靶點進行富集分析，分析結果P<0.05的KEGG通路共有169條，按照P值從小到大排序，展示前10條通路，依次為糖尿病并發(fā)癥相關AGE-RAGE、流體切應力與動脈粥樣硬化、癌癥、IL-17等信號通路。見圖4。將所富集獲得的通路進行可視化處理，黃芪治療PF的作用靶點有JUN、IL-6、PTGS2等。見圖5。

2.5? 博來霉素誘導NR8383活化模型最優(yōu)條件篩選

博來霉素50、100、150 μg/mL組在12、24 h兩個條件下，細胞活力與空白組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。博來霉素50、100 μg/mL組在12、24 h兩個條件下，TGF-β1含量與空白組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。博來霉素150 μg/mL組在12 h條件下，TGF-β1含量高于空白組（P<0.05）;在24 h條件下，TGF-β1含量顯著高于空白組（P<0.01）。見圖6。

2.6? 黃芪提取物降低博來霉素誘導的NR8383細胞TGF-β1和PTGS2的含量

與空白組比較，博來霉素組TGF-β1和PTGS2含量均顯著升高（P<0.05）;經不同濃度黃芪提取物干預后，TGF-β1和PTGS2含量均顯著降低（P<0.05）。見表1。

2.7? 黃芪提取物抑制博來霉素誘導的NR8383細胞中p-ERK1/2表達

與空白組比較，博來霉素組p-ERK1/2表達水平升高（P<0.01）。與博來霉素組比較，黃芪低、中、高劑量組p-ERK1/2表達水平均降低（P<0.05或P<0.01）。而博來霉素組ERK1/2表達水平與空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。黃芪低、中、高劑量組ERK1/2表達水平與博來霉素組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖7。

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法對黃芪治療PF的物質基礎與作用機制進行了探析。從不同數據庫共收集到黃芪活性成分76個，作用靶點563個，其中與PF相關靶點97個，說明黃芪治療PF涉及多個成分和靶點，黃芪活性成分-PF疾病靶點網絡圖的拓撲分析結果顯示Degree值較高的成分有槲皮素、山奈酚、大豆苷元、刀豆氨酸等，提示其可能是黃芪治療PF的主要活性物質，其中槲皮素Degree值為41，代表槲皮素能夠作用于41個PF相關靶點，槲皮素作為黃芪中重要的黃酮類成分之一，具有廣泛的生理活性，有文獻報道稱口服槲皮素能夠有效降低博來霉素誘導的PF大鼠肺組織中膠原沉積和氧化-抗氧化失衡[13]，并且降低支氣管肺泡灌洗液中促纖維化介質IL-13、PDGF-β和TNF-α濃度[14]，與本研究預測結果相一致，或許可以為后期對槲皮素進一步開發(fā)提供思路。

通過分析黃芪治療PF的作用靶點，其中PTGS2的Degree值為38，表明黃芪76個活性成分中38個成分均與該靶點存在作用關系，后經蛋白相互作用分析研究發(fā)現，PTGS2處于網絡核心，推測該靶點在黃芪治療PF過程中扮演重要角色。PTGS2是環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）的編碼基因，而COX-2是誘導型酶，在各種細胞中可被促炎細胞因子、腫瘤促進劑、有絲分裂原和生長因子等高度誘導，從而參與炎性反應、細胞增殖、細胞凋亡等多種病理過程[15]。有報道稱COX-2在博來霉素誘導PF組織中高度表達[16]，COX-2為微粒體型，在炎癥模型中對PGE2的上調起主要作用。PGE2可刺激Th2型細胞因子IL-10、IL-13的產生，還可抑制Th1型細胞因子如IFN-γ、IL-12的合成，從而導致Th1/Th2型細胞因子的平衡失調，從而造成肺泡炎癥的進一步擴大，最終導致PF。在PF的發(fā)生發(fā)展過程中，肺泡巨噬細胞發(fā)揮了重要的調節(jié)作用[17]。有研究表明博來霉素能夠誘導肺泡巨噬細胞發(fā)生表型轉化，產生M2型肺泡巨噬細胞，從而分泌TGF-β1，而TGF-β1能夠促進成纖維細胞活化、增殖[18]。而TGF-β1對細胞的調控與ERK信號通路是密切相關的[19]。ERK1/2能調控多種炎性介質、細胞因子的表達，在成纖維細胞增生和細胞外基質沉積中起著關鍵作用。有研究表明，博來霉素誘導的PF動物模型中存在p-ERK1/2表達增加的現象[20]，活化后的ERK一方面可以停留在胞漿中，對胞漿蛋白具有催化作用，參與細胞形態(tài)的調節(jié)和細胞骨架的重分布，另一方面可移位至細胞核，通過磷酸化而調節(jié)c-JUN、c-Fos、NF-κB等轉錄因子活性，調控基因表達。PF過程中復雜的細胞因子網絡成員包括TNF-α、IL-1、IL-6和參與組織修復與纖維化進展的TGF-β、PDGF、CTDGF等之間存在相互調控、相互影響，其交互作用與ERK通路密切相關。研究證實，IL-1β可激活ERK，而使用ERK抑制劑PD98059可阻斷IL-1β促TGF-β1表達和分泌作用[21]。本文通過細胞實驗發(fā)現黃芪低、中、高劑量組均能降低博來霉素誘導的大鼠肺泡巨噬細胞NR8383中TGF-β1、PTGS2含量（P<0.05），并下調其p-ERK1/2的表達（P<0.01），是對上述網絡藥理學預測的黃芪作用機制的有力佐證。

除上述靶點之外，我們通過富集分析得到了一些黃芪治療PF的潛在信號通路和生物過程。如晚期糖基化終末產物及其受體（糖尿病并發(fā)癥相關AGE-RAGE信號通路）信號通路可能誘導一系列信號傳導級聯反應參與免疫損傷與異常修復，最終導致肺組織中細胞外基質的過度積聚和成纖維細胞灶的形成[22]。IL-17信號通路可直接參與多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，同時IL-17作為一種多功能的細胞因子，同時具備強大的募集各種炎性細胞和粒細胞的功能。IL-17可以通過激活下游MAPK、NF-κB信號通路，引起TNF-α、IL-6等炎性細胞因子的釋放，導致級聯“炎癥瀑布”反應的發(fā)生，或激活PI3K使GSK3β磷酸化失活，從而抑制GSK3β活性，加快PF進展[23]。研究表明，中和內源性IL-17，能顯著改善BLM誘導的PF，降低TGF-β1產生，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，激活細胞自噬[24]。此部分預測結果還需進一步動物實驗進行驗證。

綜上所述，本文通過網絡藥理學對黃芪多成分、多靶點、多通路干預PF的復雜網絡關系進行研究探討，初步闡明黃芪治療PF的主要活性物質、靶點和通路，并以博來霉素誘導NR8383細胞表型轉化模型驗證黃芪提取物的作用，為進一步研究黃芪抗PF作用機制提供依據。

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