肝癌細(xì)胞中DNAJC6過表達(dá)可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程的發(fā)生

耿蘊(yùn)峰，李曉娜，盧玉娟，賈金廣，楊 濤*

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011；2.河北省體育科學(xué)研究所門診部，河北 石家莊 050011)

·論 著·

肝癌細(xì)胞中DNAJC6過表達(dá)可誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程的發(fā)生

耿蘊(yùn)峰1，李曉娜2，盧玉娟1，賈金廣1，楊 濤1*

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011；2.河北省體育科學(xué)研究所門診部，河北 石家莊 050011)

目的通過體外實驗，探討DNAJC6在肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展中的作用途徑。方法應(yīng)用體外肝癌細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測肝癌細(xì)胞HepG2中DNAJC6表達(dá)對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)過程的影響。結(jié)果與對照組比較，轉(zhuǎn)染DNAJC6后的肝癌細(xì)胞HepG2中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist1、Snail、Slug、ZEB1表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)-鈣黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，上皮標(biāo)記物上皮-鈣黏素(E-cadherin)和上皮細(xì)胞緊密連接蛋白(ZO-1)表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論DNAJC6通過誘導(dǎo)EMT過程參與肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)程。

肝腫瘤；轉(zhuǎn)染；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變

目前研究發(fā)現(xiàn)DNAJC6表達(dá)與帕金森病和精神發(fā)育遲滯癲癇等疾病有關(guān)[1-2]。然而在肝癌組織中研究發(fā)現(xiàn)DNAJC6在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DNAJC6過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-to-mesenchymal Transition,EMT)過程。EMT是指上皮細(xì)胞受到某些特定的生物信號的刺激而轉(zhuǎn)變成為間質(zhì)表型細(xì)胞的分子生物過程。EMT發(fā)生的過程中，與其相關(guān)的分子標(biāo)志物、轉(zhuǎn)錄因子及信號通路傳遞蛋白也發(fā)生相應(yīng)變化[3-6]。本研究顯示在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染DNAJC6后，肝癌細(xì)胞HepG2中EMT過程明顯增強(qiáng)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自美國模式菌種收集中心，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚購自美國Invitrogen公司，兔多克隆抗體DNAJC6(1∶1 000)、Vimentin(1∶2 000)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、ZO-1(1∶1 000)購自英國Abcam公司，Twist1，Snail、Slug、ZEB1購自美國cell signaling公司，Odyssey熒光雙色紅外成像儀購自德國LI-COR公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞HepG2從液氮罐中取出，置于恒溫水浴箱中(37℃)，后將溶解的細(xì)胞懸液加入DMEM培養(yǎng)基中。1 000 r/min，離心5 min，去除上清液，置于DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃,5% CO2加濕空氣培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞系篩選 利用肝癌細(xì)胞HepG2總DNA 實施逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerize chain reaction，RT-PCR)，從而獲得全長的DNAJC6 cDNA。引物序列為：正向5′-GGAATTCATGAGCCTCCTC-GGGAGCTAC-3′；反向5′- CCTCGAGATATAA-GGGCTTTTGGCCTTG-3′。PCR產(chǎn)物克隆到載體pcDNA3.1(+)的BamH I和Xho I酶切位點上酶切后，進(jìn)行連接構(gòu)建得到DNAJC6的過表達(dá)載體(pcDNA3.1-DNAJC6)。用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，得到DNAJC6過表達(dá)的HepG2細(xì)胞系。然后將DNAJC6過表達(dá)的HepG2細(xì)胞系按照制造商說明書步驟，用800 μg/mL G418進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系篩選。

1.4 實時熒光定量PCR分析 應(yīng)用SYBR法，取適量的混合cDNA樣品，按照體積比1∶4稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品。后以標(biāo)準(zhǔn)品做為模板，進(jìn)行合成引物的qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后用得出的Ct值和相對濃度繪制曲線。根據(jù)其曲線線性度，確保引物擴(kuò)增效率合格。在樣本檢測時，在曲線線性范圍內(nèi)選擇模板的起始濃度。25 μL反應(yīng)體系：2×Sybr Premix 12.5μL、ROX參照染料Ⅱ 0.5 μL、引物 1μL、cDNA模板+H2O 11 μL 。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s 、60 ℃ 15 s 、72 ℃ 10 s ，10 s末收集熒光信號，照此條件進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增。qPCR實驗基因表達(dá)值按照以下方式計算：△Ct=Ct待測基因- Ct參照基因，基因相對表達(dá)值=2-△Ct。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料比較采用獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組Twist1、Snail、Slug和ZEB1表達(dá)水平比較 DNAJC6轉(zhuǎn)染組Twist1、Snail、Slug和ZEB1表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNAJC6后Twist1、Snail、Slug和ZEB1表達(dá)水平變化Table 1 Changes of Twist1,Snail,Slug and ZEB1 expression in hepatocellular carcinoma cells transfected with DNAJC6

2.2 2組E-cadherin、ZO-1、Vimentin和N-cadherin表達(dá)水平比較 DNAJC6轉(zhuǎn)染組E-cadherin和ZO-1表達(dá)均低于對照組，Vimentin和N-cadherin的達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。

表 2 2組E-cadherin、ZO-1、Vimentin和N-cadherin表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the expression levels of E-cadherin,ZO-1,Vimentin and N-cadherin in the two groups

3 討 論

肝細(xì)胞肝癌是最常見的人類惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計每年有約700 000人因肝細(xì)胞肝癌死亡，同時約有21 000個新診斷的病例。肝細(xì)胞肝癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅到人類的健康、發(fā)病率呈逐年上升趨勢、高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和高病死率的疾病，特別是在我國這樣的乙型病毒性肝炎高發(fā)的國家，肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率及病死率更是處于世界前列，成為威脅我國人民生命健康的主要惡性腫瘤之一[7-8]。找到潛在的致病性的分子機(jī)制，對于發(fā)展肝癌的新的治療方法、改善肝細(xì)胞肝癌患者生存質(zhì)量有著重要的意義。

DNAJC6屬于進(jìn)化上保守的DnaJ/Hsp40家族的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)分子伴侶活性從而刺激ATP酶活性。DNAJ蛋白可能有多達(dá)3個不同的領(lǐng)域：一個保守的70個氨基酸的J結(jié)構(gòu)域，通常在N末端，甘氨酸/苯丙氨酸(G/F)豐富的地區(qū)；和一個鋅指結(jié)構(gòu)域；富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。到目前為止證實與DNAJC6相關(guān)的疾病包括帕金森病和精神發(fā)育遲滯癲癇。而DNAJC6在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用的有關(guān)報道十分有限。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中DNAJC6表達(dá)上調(diào)，并且本研究結(jié)果顯示在肝癌細(xì)胞中DNAJC6過表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的EMT過程。表明DNAJC6可能是潛在的致癌基因。

EMT是上皮細(xì)胞在外界刺激信號的作用下細(xì)胞失去極性及細(xì)胞之間黏附、細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，由上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，同時細(xì)胞運動能力及遷移能力明顯增強(qiáng)的過程。有研究表明，在不同的腫瘤細(xì)胞中EMT可以被多種重要的信號通路調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)化生長因子β(trnsfroming growth factor-β，TGF-β)可以在肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲；在卵巢癌細(xì)胞中可通過抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制EMT過程,降低卵巢癌的遷移及侵襲能力[9]；在人類乳腺癌細(xì)胞中血管抑制蛋白2(vasohibin 2，VASH2)可通過激活TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)EMT過程，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移[10]；在肺癌細(xì)胞中抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，間質(zhì)標(biāo)記物纖連蛋白、Vimentin、N型鈣黏蛋白表達(dá)明顯減弱，證實在肺癌細(xì)胞中TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過誘導(dǎo)EMT過程增加肺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[11]。肝細(xì)胞生長因子(hepetocyte growth promoting factor，HGF) 可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)，從而激活EMT，促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移[7]；有研究表明，索拉非尼可通過HGF信號通路抑制極化巨噬細(xì)胞，從而抑制EMT過程[12]； 在非小細(xì)胞肺癌中MiR-206可以通過抑制HGF信號通路活性來抑制EMT過程，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲及遷移能力[13]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，有研究表明，在卵巢癌細(xì)胞中抑制EGFR后間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin 表達(dá)減低，上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)增加，EGFR可通過激活EMT過程參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程[6]；在乳腺癌細(xì)胞中可通過抑制EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來抑制EMT過程，從而降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[14]。血小板源性生長因子D(platelet-derived growth factor-D,PDGF-D) 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中增強(qiáng)PDGF-D表達(dá)，可誘導(dǎo)EMT過程，從而增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的活性[5]；在舌鱗癌細(xì)胞中PDGF-D可通過激活EMT過程，促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15]；另有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中PDGF-D可誘導(dǎo)EMT過程增強(qiáng)，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對吉西他濱的耐藥[16]。這些通路同時也在胚胎早期發(fā)育過程中及器官形成過程中起著關(guān)鍵作用，因此這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是胚胎發(fā)育和腫瘤進(jìn)展的共同通道之一。受上游信號通路的影響，在EMT過程中其轉(zhuǎn)錄因子Twist、Slug和Snail被活化，誘導(dǎo)EMT過程中Vimentin、N-cadherin表達(dá)上調(diào)，同時抑制E-cadherin表達(dá)。隨著對EMT過程的研究深入，有越來越多的研究結(jié)果證實在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中EMT扮演著重要角色，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲過程中，腫瘤細(xì)胞受到炎癥細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的信號刺激，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，由原發(fā)病灶向局部鄰近組織侵襲。并且間質(zhì)樣的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶后可以通過血液及淋巴途徑，造成遠(yuǎn)端組織器官的轉(zhuǎn)移。EMT主要是在腫瘤發(fā)展的前期發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子(如Integrin、Ig超家族、Cadherin、CD44及Selectin)、細(xì)胞外基質(zhì)(包括膠原、蛋白聚糖、彈力蛋白、纖維結(jié)合蛋白及層黏連蛋白等)介導(dǎo)細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互作用。

EMT被認(rèn)為是一個正常的發(fā)展過程如中胚層和神經(jīng)嵴細(xì)胞的形成。癌癥的發(fā)展過程中，EMT使上皮細(xì)胞極性喪失，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明，DNAJC6誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞EMT程序，包括間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin上調(diào)，上皮標(biāo)記物E-cadherin和ZO-1表達(dá)下調(diào)。此外，DNAJC6可激活EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(Twist1、Snail、Slug、ZEB1)從而誘導(dǎo)EMT過程。

綜上所述，DNAJC6在肝癌的表達(dá)上調(diào)，與DNAJC6具有癌基因活性有關(guān)，其通過誘導(dǎo)EMT過程影響肝癌細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，表明DNAJC6可能成為肝癌治療的一個潛在靶點。

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(本文編輯：許卓文)

Overexpression of DNAJC6 induces the occurrence of EMT in hepatocellular carcinoma cells

GENG Yun-feng1， LI Xiao-na2， LU Yu-juan1， JIA Jin-guang1， YANG Tao1*

(1.DepartmentofHeapatobiliarySurgery，theFirstHospitalofShijiazhuangCity，HebeiProvince，Shijiazhuang050011，China； 2.TheOutpatientdepartment，theSportsScienceInstituteofHebeiProvince，Shijiazhuang050011，China)

Objective To investigate the role of DNAJC6 in the progression of hepatocellular carcinoma in vitro. Methods The effects of DNAJC6 expression on epithelial-to-mesenchymal transition(EMT) in HepG2 cells were detected by in vitro liver cancer cell culture, plasmid construction, transfection and reverse transcription-polymerize chain reaction. Results Compared with the control group，the expression level of EMT related transcription factor in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 transfected with DNAJC6 Twist1, Snail, Slug, ZEB1 was increased significantly(P<0.01). Mesenchymal cell markers N-cadherin and vimentin were up-regulated(P<0.01). Epithelial markers E-cadherin and ZO-1 were down-regulated(P<0.01). Conclusion DNAJC6 is involved in the process of hepatocellular carcinoma by inducing EMT.

liver neoplasms； transfection； epithelial-to-mesenchymal transition

2017-01-04；

2017-02-06

河北省科技計劃項目(16277705D)；石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃(141463243)

耿蘊(yùn)峰(1980-)，男，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事肝膽外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：yangtaopla@163.com

R575.2

A

1007-3205(2017)02-0151-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.007