鯉魚(yú)g型溶菌酶基因的cDNA克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)

李 雯, 陶 妍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

鯉魚(yú)g型溶菌酶基因的cDNA克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)

李 雯, 陶 妍

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院/上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

從鯉魚(yú)鰓組織中分離克隆到一種新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).該基因的全長(zhǎng)cDNA為558 bp，除去終止密碼子,編碼185個(gè)氨基酸，推斷的氨基酸序列沒(méi)有信號(hào)肽，含3個(gè)催化位點(diǎn)(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97)，具有魚(yú)類(lèi)g型溶菌酶的基本特征.通過(guò)PCR方法在CLYG基因的5′和3′端分別引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn).擴(kuò)增到的目的片段與表達(dá)載體pPICZαA連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG后，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33，篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在1.0%甲醇、29 ℃、pH 6.0的條件下誘導(dǎo)表達(dá)72 h，獲得重組體CLYG.SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在畢赤酵母中成功表達(dá)了重組體CLYG.

鯉魚(yú); g型溶菌酶; 畢赤酵母; 重組表達(dá)

溶菌酶(EC 3.2.1.17)是一類(lèi)能水解肽聚糖N-乙酰胞壁酸(NAM)與N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)之間的β-1,4-糖苷鍵的酶的總稱(chēng)，又稱(chēng)為胞壁質(zhì)酶，1921年，由蘇格蘭生物學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)[1].溶菌酶是機(jī)體重要的先天性免疫物質(zhì)，參與水解細(xì)菌的細(xì)胞壁，具有抑制外源微生物生長(zhǎng)的作用；同時(shí)，它也是一種理想的蛋白研究模型，在蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)、結(jié)晶學(xué)、光譜學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域都起到重要作用[2].根據(jù)生物來(lái)源和作用機(jī)制，可以將溶菌酶分為動(dòng)物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物源溶菌酶和噬菌體T4溶菌酶.其中，動(dòng)物源溶菌酶又可以分為c型、g型和i型.3種動(dòng)物源溶菌酶在氨基酸序列、催化機(jī)制和酶的性質(zhì)等方面存在很大差異，但它們具有相似的三維結(jié)構(gòu)和功能.

1967年，Canfield和McMurry第一次在鵝蛋清中發(fā)現(xiàn)并純化得到g型溶菌酶[3].自2001年Hikima et al[4]在牙鲆(Paralichthysolivaceus)中發(fā)現(xiàn)了g型溶菌酶之后，目前已在6個(gè)目12種魚(yú)中發(fā)現(xiàn)g型溶菌酶[5]；團(tuán)頭魴(Megahbramaamblycephala)和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)等多種魚(yú)類(lèi)的g型溶菌酶基因已被克隆[6-15].然而，迄今為止關(guān)于魚(yú)類(lèi)g型溶菌酶的重組DNA表達(dá)方面的研究報(bào)道甚少.2003年，Savan et al[16]從鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)頭腎中分離到一種g型溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA，從推斷的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)它與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)及鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)的g型溶菌酶在3個(gè)保守的催化殘基位點(diǎn)(谷氨酸73、天冬氨酸86和天冬氨酸97)存在一些差異，即脯氨酸86替代了天冬氨酸86，這個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的不同對(duì)g型溶菌酶的結(jié)構(gòu)和功能有何影響需要在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行研究.據(jù)此，本試驗(yàn)參考鯉魚(yú)g型溶菌酶(common carp g-type lysozyme， CLYG)的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，首先通過(guò)RT-PCR從鯉魚(yú)鰓組織中獲得編碼g型溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA，并與已知的參考序列比較，然后構(gòu)建畢赤酵母(Pichiapastoris)真核重組表達(dá)系統(tǒng)，旨在實(shí)現(xiàn)CLYG的重組DNA表達(dá)，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物材料、菌株和質(zhì)粒 鯉魚(yú)(體重0.1 kg)來(lái)源于上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室.畢赤酵母X-33、表達(dá)載體pPICZαA和博來(lái)霉素購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó)).克隆質(zhì)粒pMD19-T simple購(gòu)自TaKaRa公司(日本).大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒(RNAisoTMPlus)、第一鏈cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)和限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ、SacⅠ以及T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司(日本).胰蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)XOID公司(英國(guó)).DNA割膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母DNA提取試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京).抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(北京).彩虹預(yù)染超低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司(北京).其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA 的合成 鮮活魚(yú)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，立即用鈍器擊斃，取其鰓組織提取總RNA.采用RNAisoTMPlus試劑，按照使用說(shuō)明書(shū)對(duì)鯉魚(yú)鰓組織進(jìn)行總RNA的提取.第一股cDNA的合成按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.反應(yīng)體系為：6 μL總RNA、1 μL oligo dT Primer (50 μmol·L-1)、2 μL ddH2O、1 μL dNTP mixture (10 mmol·L-1each).于65 ℃保溫5 min后迅速在冰上冷卻，再依次加入4 μL 5×Prime Script Buffer、0.5 μL PNase Inhibitor (40 U·μL-1)和1 μL Prime Script RTase (200 U·μL-1)，緩慢混勻后，于42 ℃保溫60 min，最后于95 ℃保溫5 min，冰上冷卻后得到第一鏈cDNA.

1.2.2 g型溶菌酶基因的cDNA克隆 以鯉魚(yú)鰓組織的第一鏈cDNA為模板，參考CLYG基因序列(GenBank登錄號(hào)：AB084624)設(shè)計(jì)引物L(fēng)YG-p1和LYG-p2(表1)，對(duì)編碼g型溶菌酶的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系：LYG-p1和LYG-p2 (10 μmol·L-1) 各0.8 μL、2.0 μL 10×PCR Buffer、1.6 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)、0.2 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U·μL-1)、0.2 μL第一鏈cDNA，用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至20 μL.PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性40 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、72 ℃終延伸5 min，保溫10 min，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán).

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

采用DNA純化試劑盒純化上述片段；以此片段為模板，根據(jù)巢式PCR原理，使用分別添加X(jué)hoⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽的LYG-p3、LYG-p4、LYG-p5引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除了退火溫度改為58.4 ℃外，反應(yīng)體系和條件基本與上述的體系和條件相同.純化后的目的片段CLYG基因與pMD-19T simple質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；經(jīng)菌落PCR鑒定后，挑選陽(yáng)性克隆由上海生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序.

1.2.3 序列分析及分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建 采用SignalP 4.1在線(xiàn)軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；采用ExPASy在線(xiàn)軟件(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；采用BioEdit version7.0.9軟件進(jìn)行多重序列比較；采用MEGA6臨位相聯(lián)法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù).

1.2.4 重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG的構(gòu)建及對(duì)畢赤酵母X-33的轉(zhuǎn)化 用XhoⅠ和XbaⅠ對(duì)pMD-19T-CLYG進(jìn)行消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收目的片段CLYG基因，將其與用同樣酶處理過(guò)的表達(dá)載體pPICZαA連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞.通過(guò)菌落PCR、雙酶切和DNA測(cè)序鑒定pPICZαA-CLYG.

用SacⅠ對(duì)重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG進(jìn)行處理后，以1∶8的體積比與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電極間距為0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min，電擊(2 kV、25 μF、200 Ω)后立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol·L-1山梨醇，離心后菌體涂布于含100 μg·mL-1博來(lái)霉素的酵母蛋白胨葡萄糖山梨醇培養(yǎng)基(YPDS)平板，29 ℃下孵育至單克隆產(chǎn)生.挑選60個(gè)單克隆分別接種于最小甲醇培養(yǎng)基(MM)、最小甘油培養(yǎng)基(MD)、不含博來(lái)霉素的酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)和含1 000 μg·mL-1博來(lái)霉素的酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基平板，篩選得到甲醇利用快速型高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子.提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用pPICZαA上的通用引物5′AOX1和3′AOX1以及LYG-p3和LYG-p5引物進(jìn)行PCR鑒定.

1.2.5 CLYG的誘導(dǎo)表達(dá)及其蛋白質(zhì)印跡分析 將酵母轉(zhuǎn)化子接種于25 mL緩沖復(fù)合甘油培養(yǎng)基(BMGY)中，于29 ℃、250 r·min-1、pH 6.0的條件下培養(yǎng)至D600 nm為3.0～6.0，于6 000 r·min-1離心5 min收集菌體，重懸于100 mL緩沖復(fù)合甲醇培養(yǎng)基(BMMY)中，調(diào)節(jié)D600 nm至1.0；于29 ℃、250 r·min-1、pH 6.0的條件下培養(yǎng)72 h[17].離心收集培養(yǎng)液上清，用于SDS-PAGE分析(分離膠濃度12%).另外，將SDS-PAGE膠上的蛋白質(zhì)條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜后，與封閉液反應(yīng)1 h；洗去封閉液后與一抗(抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體)在室溫下孵育2 h；洗去一抗后，加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG)室溫反應(yīng)1 h；洗去二抗后用DAB顯色[18].

2 結(jié)果與分析

2.1 CLYG的cDNA克隆及其與其他生物之間一級(jí)結(jié)構(gòu)的比較

以鯉魚(yú)鰓組織的第一鏈cDNA為模板，使用LYG-p1和LYG-p2為引物，第1次PCR擴(kuò)增得到574 bp的片段(圖1A)；除去引物序列和終止密碼子，g型溶菌酶的全長(zhǎng)cDNA為555 bp，編碼185個(gè)氨基酸殘基(圖2).該cDNA序列提交至GenBank，序列號(hào)為KT454836.經(jīng)軟件預(yù)測(cè)，g型溶菌酶的分子質(zhì)量20.5 ku，等電點(diǎn)9.35，未檢測(cè)到信號(hào)肽序列，只含一個(gè)半胱氨酸殘基，包含了3個(gè)催化位點(diǎn)——甘氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97(圖2).

M：100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.圖1 CLYG基因的PCR 擴(kuò)增(A)及添加酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽的PCR 擴(kuò)增(B)Fig.1 PCR amplification of CLYG (A) and PCR amplification for adding restriction sites and 6×His tag (B)

斜體表示XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)；下劃線(xiàn)表示6×His標(biāo)簽；黑色方框表示Kex2識(shí)別位點(diǎn)；陰影表示3個(gè)催化位點(diǎn)；*表示終止密碼子.圖2 用于連接至pPICZαA的目的片段的核苷酸及推斷的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the target fragment ligated with pPICZαA

進(jìn)一步以上述片段為模板，使用LYG-p3和LYG-p4為引物，第2次PCR擴(kuò)增得到5′端含XhoⅠ位點(diǎn)和3′端含XbaⅠ位點(diǎn)及6×His標(biāo)簽的598 bp的片段“CLYG”基因(圖1B).該片段經(jīng)克隆和DNA測(cè)序，證明了兩個(gè)酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽被成功引入.

使用CLUSTALW程序?qū)LYG的氨基酸序列與其他生物進(jìn)行多重比對(duì)(圖3)，發(fā)現(xiàn)鯉魚(yú)鰓組織中的g型溶菌酶(CyprinuscarpioⅡ型)與鯉魚(yú)頭腎組織中的g型溶菌酶(CyprinuscarpioⅠ型)的同源性最高(95.7%)，與其他魚(yú)類(lèi)g型溶菌酶的同源性為50.3%～75.1%，但與人類(lèi)g型溶菌酶的同源性?xún)H為41.8%.所有用作比對(duì)的氨基酸序列中均有比較保守的3個(gè)催化位點(diǎn)，但兩種CLYG的第2個(gè)催化位點(diǎn)是脯氨酸而不是像大多數(shù)g型溶菌酶所顯示的天冬氨酸(圖3).

2.2 基于鯉魚(yú)和其他生物g型溶菌酶氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹(shù)

采用臨位相聯(lián)法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，各結(jié)點(diǎn)的置信度由自引導(dǎo)值估計(jì)，重復(fù)次數(shù)1 000.由圖4可見(jiàn)，根據(jù)不同生物的g型溶菌酶氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)可分為3大組，分別為魚(yú)類(lèi)組、鳥(niǎo)類(lèi)組和哺乳類(lèi)組.其中，魚(yú)類(lèi)組又可分為兩個(gè)亞組.可以發(fā)現(xiàn)，同為鯉科的鯉魚(yú)和草魚(yú)聚在一枝，顯示了更近的親緣關(guān)系.該分子系統(tǒng)樹(shù)的分析結(jié)果與氨基酸序列多重比對(duì)的結(jié)果是一致的.

2.3 重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG的構(gòu)建及其鑒定

將CLYG基因與pPICZαA連接得到重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG(圖5).以載體的通用引物5′AOX1和3′AOX1進(jìn)行菌落PCR鑒定，3個(gè)泳道都在理論分子質(zhì)量位置1 099 bp處有明顯條帶(圖6A)；此外，使用XhoⅠ和XbaⅠ對(duì)pPICZαA-CLYG進(jìn)行雙酶切，在598 bp處有明顯條帶，與理論分子質(zhì)量相符(圖6B).DNA測(cè)序結(jié)果亦證明目的片段CLYG基因已成功連接至表達(dá)載體pPICZαA中.

黑色方框表示3個(gè)催化位點(diǎn).圖3 鯉魚(yú)與其他脊椎動(dòng)物之間g型溶菌酶氨基酸序列的多重比較Fig.3 Comparison of g-type lysozyme amino acid sequences between common carp and other vertebrates

圖4 基于不同動(dòng)物來(lái)源的g型溶菌酶氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)Fig.4 Molecular phylogenetic tree based on amino acid sequences of g-type lysozymes from different animals

圖5 重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG的構(gòu)建Fig.5 Construction of recombinant expression vector pPICZαA-CLYG

M1：1 000 bp plus DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M2：100 bp DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；4：雙酶切產(chǎn)物.圖6 重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG的菌落PCR(A)和雙酶切鑒定(B)Fig.6 Identification of the recombinant expression vector pPICZαA-CLYG by colony PCR (A) and restriction endonuclease digestion (B)

2.4 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選及其在畢赤酵母X-33中表達(dá)的目的蛋白

M：1 000 bp plus DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7：含pPICZαA-CLYG的酵母轉(zhuǎn)化子.圖7 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.7 PCR identification for the yeast transformants

上述重組表達(dá)載體pPICZαA-CLYG經(jīng)線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33中，通過(guò)博來(lái)霉素篩選和甲醇利用速度篩選，獲得7株長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)化子.以酵母基因組DNA為模板，以載體的通用引物5′AOX1和3′AOX1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在2 200和1 009 bp處有明顯的條帶，前者為畢赤酵母X-33中因存在醇氧化酶基因AOX1自身的引物結(jié)合位點(diǎn)而擴(kuò)增的條帶，后者為含目的基因的擴(kuò)增條帶(結(jié)果未顯示).又以引物L(fēng)YG-p3和LYG-p5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示了一個(gè)598 bp的明顯條帶，與理論值相符(圖7).

選取3株經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子，經(jīng)1.0%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72 h，離心后的上清經(jīng)透析濃縮后用于SDS-PAGE分析.結(jié)果顯示，3和4號(hào)菌的培養(yǎng)液上清在21.3 ku處有明顯的目的條帶，2號(hào)菌的培養(yǎng)液上清顯示的條帶不明顯；但1號(hào)菌(含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子，作為陰性對(duì)照)的培養(yǎng)液上清并未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶(圖8).

2.5 重組蛋白CLYG的蛋白質(zhì)印跡分析

由圖9可見(jiàn)，1號(hào)陰性對(duì)照無(wú)條帶，但3和4號(hào)泳道顯示清晰的條帶，與圖8中的條帶相對(duì)應(yīng)，證明3和4號(hào)菌的上清中含有能被抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體結(jié)合的帶有6×His標(biāo)簽的CLYG.蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證明了目的蛋白在畢赤酵母中的表達(dá).

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：含pPICZαA的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清；2～4：含pPICZαA-CLYG的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清.圖8 培養(yǎng)液上清的SDS-PAGE分析Fig.8 SDS-PAGE analysis for supernatants from culture solutions

3 討論

雖然在上世紀(jì)就已經(jīng)開(kāi)始了對(duì)溶菌酶的研究，但關(guān)于魚(yú)類(lèi)溶菌酶的研究基本上處于起步階段.本試驗(yàn)在鯉魚(yú)的鰓組織中發(fā)現(xiàn)了一種新的g型溶菌酶同工型，這種在同一種魚(yú)中存在多種g型溶菌酶同工型的現(xiàn)象在一些硬骨魚(yú)類(lèi)中已被報(bào)道.如在點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)、大西洋鮭魚(yú)(Salmosalar)和大西洋鱈魚(yú)(Gadusmorhua)中都發(fā)現(xiàn)了2種g型溶菌酶同工型[8,11-12]；在斑點(diǎn)叉尾鮰和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中發(fā)現(xiàn)有3種g型溶菌酶同工型[7].魚(yú)體內(nèi)存在多種g型溶菌酶同工型可能有助于其更好地抵御水域環(huán)境中的病原微生物侵染.相比于哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)，魚(yú)類(lèi)g型溶菌酶在組織中的分布更廣泛且表達(dá)量高[6-16].

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的CLYG在N端沒(méi)有信號(hào)肽，含3個(gè)催化位點(diǎn)，只有1個(gè)半胱氨酸殘基，與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)g型溶菌酶相似，但第2個(gè)催化位點(diǎn)是脯氨酸86(圖2)，而不是大多數(shù)脊椎動(dòng)物g型溶菌酶所顯示的天冬氨酸86.研究表明，第1個(gè)催化位點(diǎn)(谷氨酸)對(duì)g型溶菌酶的催化活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是必需的，而第2(天冬氨酸)和3個(gè)催化位點(diǎn)(天冬氨酸)也參與催化作用，但第3個(gè)更重要[19].就脯氨酸而言，它是一種亞氨基酸，可能對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生較大的影響，這也是本試驗(yàn)克隆分離到這種新的CLYG基因后對(duì)其進(jìn)行真核表達(dá)的原因之一.

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，在29 ℃、pH 6.0的條件下采用1.0%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)72 h，獲得了重組體CLYG.進(jìn)一步的研究將考慮對(duì)該g型溶菌酶CLYG進(jìn)行純化，并研究其抑菌活性和抑菌譜.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

cDNA cloning of g-type lysozyme gene from common carp and its expression inPichiapastoris

LI Wen, TAO Yan

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University/Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China)

G-type lysozyme plays an important role in fish′s immune response against microbial invasion. In the present study, a new g-type lysozyme isoform gene (CLYG) was separated from common carp (Cyprinuscarpio) gill. The full-length cDNA ofCLYGis 558 bp, which encodes 185 amino acid residues. The amino acid sequence deduced from the cDNA ofCLYGcontains 3 catalytic residues (Glu73, Pro86 and Asp97) without any signal peptide, which is similar to those of other teleost species. Subsequently,XhoⅠ andXbaⅠ restriction sites were added to the 5′ and 3′ ends ofCLYGgene by PCR, respectively. After that, the expected fragment was ligated with expression vector pPICZαA, and followed by being transformed into competentPichiapastorisX-33 cells. Then recombinant CLYG was induced in 1.0% methanol under pH 6.0 at 29 ℃ for 72 h. SDS-PAGE analysis and Western blot analysis demonstrated that the recombinant CLYG was successfully expressed.

common carp; g-type lysozyme;Pichiapastoris; recombinant expression

2015-12-22

2016-04-01

上海市教育委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(15CXY30)；農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目(UA201307)；上海市交叉學(xué)科研究生拔尖創(chuàng)新人才培養(yǎng)平臺(tái)項(xiàng)目(B5201120040)；上海市2015高校內(nèi)涵建設(shè)項(xiàng)目(A2018150009).

李雯(1992-)，女，碩士研究生.研究方向：水產(chǎn)生物分子生物學(xué).Email:fenzhongbahe@outlook.com.通訊作者陶妍(1961-)，女，教授.研究方向：水產(chǎn)生物分子生物學(xué).Email:ytao@shou.edu.cn.

Q785

A

1671-5470(2017)01-0081-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.013