生物方法降解黃曲霉毒素的研究

史敦勝，李 旺，聶利波，宋洋洋，王占彬

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院 河南 洛陽 471003)

生物方法降解黃曲霉毒素的研究

史敦勝，李 旺，聶利波，宋洋洋，王占彬

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院 河南 洛陽 471003)

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉等真菌代謝過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是一種劇毒物質(zhì)，能夠?qū)е聶C(jī)體病變、基因突變和癌變。廣泛存在于糧食、食品以及飼料中，對人體健康和動物生產(chǎn)造成嚴(yán)重的不良影響，給糧食儲存和畜牧業(yè)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。生物方法降解黃曲霉毒素是一種有效、安全和環(huán)保的黃曲霉毒素解毒方法，論述了生物方法降解黃曲霉毒素，并對生物方法降解黃曲霉毒素應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

黃曲霉毒素；糧食；飼料；次級代謝產(chǎn)物；微生物；降解方法

黃曲霉毒素(aflatoxin簡稱AFT或AT)主要由基因同源的黃曲霉和寄生曲霉等真菌在一定的環(huán)境條件下發(fā)生的復(fù)雜酶促反應(yīng)生物合成的次級代謝產(chǎn)物[1]。目前鑒定出的共有18種[2]，分為B族和G族兩大類，在動物體內(nèi)代謝可產(chǎn)生黃曲霉毒素M1、M2等多種同源衍生物[3]。它給糧食及飼料造成嚴(yán)重污染，其中黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)[4]。黃曲霉毒素主要作用于肝臟，引起肝臟病變。食用了含黃曲霉毒素的食物，可引起人畜急性中毒從而引發(fā)疾病，且黃曲霉毒素有強(qiáng)致癌、導(dǎo)致基因突變和畸形作用[5]，嚴(yán)重威脅動物及人類健康，如何除去糧食及飼料中的黃曲霉毒素被人們廣泛關(guān)注。

1 黃曲霉毒素常規(guī)脫毒方法

1.1 物理化學(xué)方法脫毒

黃曲霉毒素常規(guī)脫毒方法有物理方法和化學(xué)方法。物理學(xué)方法包括霉變部分篩選剔除法、射線輻射降解法、高溫加熱處理法、溶劑萃取法，這些方法對除去黃曲霉毒素有一定效果。在實(shí)際操作中，篩選剔除法過程繁瑣，射線輻射法對不同樣品的處理效果存在很大差異，高溫加熱會破壞飼料中的營養(yǎng)成分，同時射線輻射和高溫處理將會產(chǎn)生大量能源消耗，有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)生的廢物無法很好的處理。從而這些方法都很難在大規(guī)模批量生產(chǎn)中應(yīng)用。

化學(xué)處理方法是用化學(xué)試劑破壞黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)酯環(huán)存在于黃曲霉毒素的一般結(jié)構(gòu)式中，只有內(nèi)酯環(huán)被打開時，熒光才會消失，毒性才會消除[6]。 化學(xué)處理方法包括氨化、堿化和臭氧等處理方法，其中氨化和堿化處理是通過化學(xué)作用使黃曲霉毒素內(nèi)酯環(huán)破壞，生成相應(yīng)的香豆素銨鹽或者鈉鹽，從而消除黃曲霉毒素的毒性；臭氧的氧化功能打開黃曲霉毒素內(nèi)酯環(huán)[7]，消除黃曲霉毒素的毒害。但這些方法雖然對去除黃曲霉毒素有一定效果，但在脫毒時，會產(chǎn)生有毒有害化學(xué)成分殘留，破壞飼料產(chǎn)品品質(zhì)，且臭氧處理成本高，不易操作，此方法同樣很難應(yīng)用在規(guī)模化生產(chǎn)中。

1.2 吸附方法脫毒

在工業(yè)生產(chǎn)中，一種是以添加蒙脫石、沸石、膨潤土等硅酸鹽吸附劑以及納米吸附劑的物理吸附來去除霉菌毒素，其吸附原理是硅酸鹽吸附劑強(qiáng)大的表面積與靜電作用，與帶有離子極性的霉菌毒素結(jié)合[8]。其中硅酸鹽吸附劑對黃曲霉毒素有很好的吸附能力，劉媛婷等[9]通過體外實(shí)驗(yàn)表明水合鋁硅酸鹽對黃曲霉毒素的吸附率可達(dá)到99%，且吸附劑能夠明顯減輕黃曲霉毒素對動物的毒害作用。史瑩華[10]等通過豬日糧中添加蒙脫石吸附劑，顯著降低了黃曲霉毒素對動物肝臟的毒害作用。但硅酸鹽吸附方法在吸附毒素的同時會吸附氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分，使飼料中的營養(yǎng)成分含量降低，其中存在著動物體內(nèi)代謝過程重新被暴露的風(fēng)險(xiǎn)。此方法有待于進(jìn)一步優(yōu)化，明確吸附劑在動物體內(nèi)的代謝過程，減少吸附劑對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附。

另一種吸附方法是利用微生物對黃曲霉毒素吸附，研究較多的是酵母菌和乳酸菌的吸附作用，常見的有釀酒酵母、鼠李糖乳酸桿菌、干酪乳桿菌等。酵母菌的細(xì)胞壁電鏡下為“三明治”結(jié)構(gòu)[11]，其細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)和成分形成的分子作用力吸附黃曲霉毒素，Hernandezmendoza等[12]利用緩沖液重復(fù)洗滌來評價釀酒酵母-黃曲霉毒素復(fù)合物的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明釀酒酵母能穩(wěn)定的與黃曲霉毒素結(jié)合，防止黃曲霉毒素被胃腸道吸收；Shah等[13]發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1與乳酸菌形成黃曲霉毒素B1-乳酸菌復(fù)合物來吸附黃曲霉毒素。Redzwan等[14]通過建立體外動物模型和人類臨床試驗(yàn)，表明益生菌添加劑可以減少黃曲霉毒素在人類膳食和動物飼料中的暴露，降低和緩解黃曲霉毒素在人體和動物體內(nèi)的毒害作用，最終被應(yīng)用于飼料工業(yè)。但微生物的吸附作用為物理吸附，是一個可逆的過程，毒素不能完全被吸附，也存在著在動物體內(nèi)毒素被釋放的風(fēng)險(xiǎn)，單一的微生物吸附對黃曲霉毒素的解毒作用存在一定的局限性。

2 生物學(xué)方法降解黃曲霉毒素

生物學(xué)方法降解黃曲霉毒素，是近年來研究熱門的一種脫毒方法，主要為微生物的降解，包括真菌和細(xì)菌兩大類。在黃曲霉毒素生物方法降解的研究中，大量的利用篩選得到能夠降解黃曲霉毒素的生物菌種，通過自身代謝產(chǎn)生某種胞內(nèi)酶或者胞外酶將黃曲霉毒素分子的毒性基團(tuán)降解為無毒害的物質(zhì)被生物利用或通過代謝排出體外。另一方面通過生物酶的單一活性成分對黃曲霉毒素進(jìn)行降解為無毒的其他組分，但生物酶的來源、活性以及穩(wěn)定性需要優(yōu)化與提高。

2.1 真菌對黃曲霉毒素的降解作用

降解黃曲霉毒素的真菌，包括寄生曲霉菌、根霉菌、白腐真菌、假密環(huán)菌和黑曲霉等[15]。國外對真菌的研究較早，Doyle等[16]通過發(fā)酵發(fā)現(xiàn)寄生曲霉在生長14 h后，菌絲產(chǎn)生一種乳過氧化物酶將黃曲霉毒素B1降解，其產(chǎn)物為黃曲霉毒素B2a的衍生物和另一種水溶性衍生物，降解產(chǎn)物的毒性遠(yuǎn)低于黃曲霉毒素B1。Cole等[17]通過同位素標(biāo)記法研究表明根霉菌能夠?qū)ⅫS曲霉毒素降解為兩個具有熒光的羥基化合物。Motomura等[18]從一種平菇中分離出降解黃曲霉毒素的酶，通過熒光含量的測定，表明這種酶能夠降解黃曲霉毒素的內(nèi)酯環(huán)，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)得到其蛋白分子量大小大概為90 ku。

國內(nèi)對黃曲霉毒素的真菌降解研究中，李冰等[19]研究黑曲霉發(fā)酵對黃曲霉毒素B1的降解效果，在一定件條下黃曲霉毒素B1的降解率達(dá)到93.28%，在對其胞外粗提液、活細(xì)胞、細(xì)胞提取物降解黃曲霉毒素進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)其中黑曲霉的胞外粗提液對黃曲霉毒素的降解率最高，表明黃曲霉毒素B1的降解可能是黑曲霉分泌的一種酶的化學(xué)作用。徐丹等[20]通過研究黑曲霉對黃曲霉生長、產(chǎn)毒以及對黃曲霉毒素的影響，驗(yàn)證了黑曲霉既能抑制黃曲霉生長、產(chǎn)毒，又能夠降解黃曲霉毒素。

劉大嶺等[21-22]發(fā)現(xiàn)食用型真菌假密環(huán)菌能夠降解黃曲霉毒素，其活性物質(zhì)為一種胞內(nèi)的氧化酶，提取的粗酶液能夠高效降解黃曲霉毒素，降解效率達(dá)到80%；隨后從提取物中分離出能降解黃曲霉毒素毒性的解毒酶[23-24]，通過SDS-PAGE測定活性蛋白大小表觀分子量為51.8 ku；進(jìn)一步構(gòu)建互補(bǔ)脫氧核糖核酸 (cDNA)文庫并建立原核克隆及表達(dá)載體，得到重組黃曲霉毒素解毒酶活性蛋白(ADTZ)[25-26]，基因大小為2 088 bp，編碼695個氨基酸，并成功的將黃曲霉毒素解毒酶基因在畢赤酵母中表達(dá)[27]；對黃曲霉毒素解毒酶三維結(jié)構(gòu)外層部位的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行了改造,獲得了一種對胰蛋白酶抗性提高的重組黃曲霉毒素氧化酶(AFO)[28-29]，其基因片段大小為2 321 bp，對胰蛋白酶的抗性比黃曲霉毒素解毒酶(ADTZ)提高2.73倍，半衰期延長了72 min,其他酶學(xué)性質(zhì)與野生型酶基本一致。

以上研究表明，真菌微生物降解黃曲霉毒素的機(jī)理是一個復(fù)雜過程，易受環(huán)境和自身因素影響，可控性、穩(wěn)定性差，降解產(chǎn)物不明確，但真菌中的單一活性成分對黃曲霉毒素有很好的降解效果。目前國內(nèi)外對黃曲霉的研究更多的是黃曲霉毒素產(chǎn)生和降解機(jī)理的研究。

2.2 細(xì)菌對黃曲霉毒素的降解作用

國內(nèi)外對細(xì)菌生物降解黃曲霉毒素有大量的報(bào)道，研究表明許多細(xì)菌微生物具有一定的降解黃曲霉毒素的能力。國外的研究中，Lilleho等[30]1966年通過篩選酵母菌、霉菌、細(xì)菌、放線菌、藻類和真菌孢子降解黃曲霉毒素的能力，最終篩選出橙色黃桿菌能夠降解黃曲霉毒素B1，Doyle等[ 31]證明這種物質(zhì)為一種乳過氧化物酶。Smiley等[32]進(jìn)一步報(bào)道橙色黃桿菌的粗蛋白質(zhì)提取物在水溶液中降解黃曲霉毒素B1的降解率能夠達(dá)到74.5%；分別用熱處理、脫氧核糖核酸酶I處理、蛋白酶K處理初蛋白質(zhì)提取物，降解率分別為5.5%、80.5%、34.5%，進(jìn)一步驗(yàn)證這種對黃曲霉毒素的降解機(jī)理可能是酶促反應(yīng)。 Cserháti等[33]篩選出32株紅球菌菌株能夠降解黃曲霉毒素，利用發(fā)酵培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，結(jié)果有16株菌株對黃曲霉毒素的降解效率達(dá)到100%，4株菌株的降解效率達(dá)到98%。

國內(nèi)對黃曲霉毒素的細(xì)菌降解研究中，李俊霞等[34]利用香豆素，從動物糞便、發(fā)霉糧食、實(shí)驗(yàn)室原有菌株等1 500種微生物細(xì)菌和芽孢桿菌樣品中篩選出能夠降解黃曲霉毒素的菌株，并用黃曲霉毒素B1作為培養(yǎng)基底物進(jìn)行復(fù)篩，共得到來自腸道的8株菌株和來自發(fā)霉飼料的2株菌株能夠降解黃曲霉毒素，其中從貘糞便中獲得的假單胞菌屬嗜麥芽窄食單胞菌對黃曲霉毒素的降解效果最好。關(guān)舒[35]等對嗜麥芽窄食單胞菌培養(yǎng)基胞外粗提液、活細(xì)胞和細(xì)胞提取物分別進(jìn)行降解黃曲霉毒素處理，37℃下孵育72 h后檢測胞外提取物中黃曲霉毒素B1減少了82.5%，而活細(xì)胞提取物對黃曲霉毒素的降解效率非常低，用蛋白酶K，蛋白酶K加十二烷基硫酸鈉(SDS)和加熱處理培養(yǎng)物上清液能顯著降低或根除培養(yǎng)物上清液的降解活性。證明其中的嗜麥芽窄食單胞菌對黃曲霉毒素的降解為生物酶的降解。

雷元培[36]等對枯草芽孢桿菌進(jìn)行降解黃曲霉毒素解毒的生物活性、抗菌性及抗逆性的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵后的上清液中存在解毒活性組分，對解毒活性物質(zhì)進(jìn)行加熱和蛋白酶K變性處理后，解毒活性顯著降低，表明起解毒作用的活性物質(zhì)是其分泌的一種胞外酶，同時所分泌的活性蛋白具有強(qiáng)解毒活性，特異性和作用效果溫和的特點(diǎn)，不會破壞飼料中的營養(yǎng)成分，適用于除去飼料中的黃曲霉毒素。

3 前景展望

目前，生物防治黃曲霉毒素研究取得了一定的進(jìn)展，但國內(nèi)外使用生物學(xué)方法降解黃曲霉毒素在飼料工業(yè)中的應(yīng)用剛剛起步。 黃曲霉毒素雖能被不同的菌株所降解，但目前的防治方法依然還存在著許多問題，一般研究主要側(cè)重于降解黃曲霉毒素菌株的篩選，但對于降解的機(jī)理及解毒酶特性需要進(jìn)一步研究。黃曲霉毒素分解酶相關(guān)的基因報(bào)道還比較少，且酶的產(chǎn)量和活性不太高，毒素不能被完全降解。因此，需要用到生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程的手段對微生物菌種進(jìn)行篩選及改造，并獲得黃曲霉毒素分解酶的組成基因并進(jìn)行高效表達(dá)，開發(fā)出能夠高效降解黃曲霉毒素的生物菌種。將生物發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于飼料工業(yè)，以減少飼料的污染和浪費(fèi)，降低養(yǎng)殖行業(yè)和飼料行業(yè)經(jīng)濟(jì)成本。

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(責(zé)任編輯：舒蓮梅)

Reaserch progress of the degradation of aflatoxin by biological methods

SHI Dun-sheng,LI Wang,NIE Li-bo,SONG Yang-yang,WANG Zhan-bing

(College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Aflatoxins are toxic secondary metabolites predominantly produced by the pervasive toxigenic strains ofAspergillusflavusandA.parasiticus. They are extremely toxic, mutagenic, carcinogenic and teratogenic to both humans and livestock. They widely existed in food and feedstuff, threatening people's health and livestock's performance, which resulted economic losses in the storage of foodstuffs and production of animal husbandry Biodegradation is a safe, effective and environmental friendly method for detoxifying the aflatoxin.We reviewed the research on biodegradation of aflatoxin, and looked forward to the biodegradation prospect.

aflatoxin; grain;feed; secondary metabolite;microorganism; degradation method

2016-10-17；

2017-01-15

國家自然科學(xué)基金(31101744)；河南省重大科技專項(xiàng)(131100110300)。

史敦勝(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)轱暳腺Y源開發(fā)利用。

王占彬(1963-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾笄轄I養(yǎng)與生態(tài)。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.02.011

S816.3

A

1003-6202(2017)02-0049-04