基于文獻(xiàn)計(jì)量的微藻收獲技術(shù)研究分析

李海健， 周化嵐， Sarman Oktovianus Gultom, 張建國(guó)*

1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，上海 20093;2.Department of Agricultural and Biosystems Engineering, Papua University, Manokwari, Papua Barat, Indonesia

微藻具有能以光自養(yǎng)模式利用光和二氧化碳生長(zhǎng)積累油脂，也能以異養(yǎng)模式利用其它碳源生長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于生物能源，生產(chǎn)高附加值物質(zhì)，以及廢水處理等多個(gè)領(lǐng)域[1]。微藻在生物能源方面的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：(1)獲得富油藻種，例如富油藻種的篩選[2, 3]，以及基因工程改造微藻達(dá)到富油性能[4]；(2)微藻積累油脂的過(guò)程工程研究，例如培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素的優(yōu)化[5]、溫度及光照強(qiáng)度等環(huán)境因素的優(yōu)化；(3)建立簡(jiǎn)單、易行的油脂測(cè)定和提取方法，例如利用核磁共振的方法測(cè)定油脂含量[6]。近年來(lái)，利用微藻生產(chǎn)高附加值物質(zhì)的研究也日益增多[7]。微藻積累的多不飽和脂肪酸可以作為食用營(yíng)養(yǎng)品，還可以作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體、抗生素、蛋白藥物、激素、腸道活性蛋白和工業(yè)用酶等[8]。小球藻自身能合成的氨基酸、多肽、維生素和核酸等已經(jīng)被制作為小球藻生長(zhǎng)因子(chlorella growth factor),在增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤、改善代謝綜合征、清除自由基、抵御紫外損傷、螯合重金屬以及保肝護(hù)腸等多個(gè)方面展現(xiàn)了良好功效[9, 10]。微藻用于廢水處理也是一種非常有前景的綠色技術(shù)。微藻吸收營(yíng)養(yǎng)能力強(qiáng)，可以高效利用廢水中有機(jī)質(zhì)、氮和磷等污染物合成生物質(zhì)，并達(dá)到處理廢水的目的。微藻在處理農(nóng)業(yè)廢水、工業(yè)廢水、城市廢水和含農(nóng)藥以及抗生素等有害廢水方面都有報(bào)道。很多學(xué)者對(duì)藻類處理廢水的原理、技術(shù)路線、藻種篩選、環(huán)境條件等方面都有研究，為生態(tài)建設(shè)提供了新思路[11]。

為了獲得微藻中的油脂、高附加值物質(zhì)，微藻收獲是必不可少的步驟。但是由于微藻在培養(yǎng)體系中濃度較低(約0.3 g/L～5 g/L)和體型較小(Φ2 μm～40 μm)，導(dǎo)致微藻收獲步驟的成本占總成本高達(dá)20%～30%，因此，微藻的大規(guī)模應(yīng)用相對(duì)較少[12]。微藻收獲成為其工業(yè)化的熱點(diǎn)問(wèn)題。本文從文獻(xiàn)計(jì)量的角度闡明微藻收獲的研究趨勢(shì)，同時(shí)，也展示了我國(guó)在微藻收獲的研究方面所處的位置，最后分析了研究動(dòng)向，為微藻收獲和相關(guān)研究提供參考。

1 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)來(lái)源

本文以web of science數(shù)據(jù)庫(kù)為數(shù)據(jù)來(lái)源，以 microalgae harvest為主題詞搜索相關(guān)文獻(xiàn)，時(shí)間截止至2019年7月31日，檢索結(jié)果共2 471篇文獻(xiàn)，經(jīng)手工剔除，得到關(guān)于微藻收獲相關(guān)文獻(xiàn)共742篇。

國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)研究以萬(wàn)方中文數(shù)據(jù)庫(kù)為數(shù)據(jù)來(lái)源，以“微藻收獲”為關(guān)鍵詞搜索，加上手動(dòng)獲取和篩選，共得到文獻(xiàn)334篇。

2 文獻(xiàn)檢索結(jié)果與分析

2.1 微藻收獲研究的趨勢(shì)

Web of science數(shù)據(jù)庫(kù)中最早收錄的有關(guān)微藻收獲的研究為2001年Oh報(bào)道的使用類芽孢菌屬的生物絮凝劑收獲小球藻。自2009年起，有關(guān)微藻收獲的文獻(xiàn)數(shù)量逐年增加，成為研究熱點(diǎn)(圖1)，尤其在2018年已達(dá)到139篇。截止2019年7月31日，2019年出版的文獻(xiàn)數(shù)量為103篇。這說(shuō)明微藻收獲的研究逐漸增多，依然是研究熱點(diǎn)。

圖1 微藻收獲的文獻(xiàn)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.2 文獻(xiàn)種類分析

從文獻(xiàn)類型的組成來(lái)看(圖2)，數(shù)量最多的文獻(xiàn)為研究論文，占65.9%。然后依次是專利(19.7%)、評(píng)論(6.2%)、會(huì)議論文(5.3%)和摘要(1.8%)，其他文獻(xiàn)占1.1%。圖2表明專利為數(shù)量第二多的文獻(xiàn)，說(shuō)明研究人員認(rèn)為微藻收獲的研究具有很大應(yīng)用潛力，需要進(jìn)行專利保護(hù)。

圖2 微藻收獲文獻(xiàn)的類型

2.3 文獻(xiàn)量前10的國(guó)家及其文獻(xiàn)引用

微藻收獲的文獻(xiàn)共來(lái)自56個(gè)國(guó)家和地區(qū)。發(fā)表文獻(xiàn)總數(shù)前10的國(guó)家見(jiàn)圖3。

圖3 微藻收獲文獻(xiàn)數(shù)量的前10國(guó)家

前10國(guó)家的文獻(xiàn)數(shù)為528篇，占文獻(xiàn)總數(shù)的71.2%。排名前10的國(guó)家和地區(qū)依次為中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、馬來(lái)西亞、印度、西班牙、比利時(shí)、英國(guó)、澳大利亞和加拿大。其中，我國(guó)發(fā)表文獻(xiàn) 184 篇，占總文獻(xiàn)量的24.8 %。圖4為前10國(guó)家的文獻(xiàn)平均引用次數(shù)。比利時(shí)的每篇文獻(xiàn)平均引用次數(shù)最多，為42.6次/篇，其次為英國(guó)(27.7次/篇)、美國(guó)(27.2次/篇)、澳大利亞(23.4次/篇)。我國(guó)每篇文獻(xiàn)的平均引用次數(shù)為19.4次/篇。這說(shuō)明我國(guó)有關(guān)微藻收獲的文獻(xiàn)雖多，但其影響力還有待進(jìn)一步提高。

圖4 文獻(xiàn)總數(shù)前10國(guó)家的每篇文獻(xiàn)引用次數(shù)

2.4 文獻(xiàn)數(shù)量前5國(guó)家在近10年內(nèi)的文獻(xiàn)數(shù)量變化

對(duì)文獻(xiàn)總數(shù)前5名國(guó)家的文獻(xiàn)數(shù)量進(jìn)行分析，可以看出我國(guó)文獻(xiàn)的增長(zhǎng)趨勢(shì)較為明顯(圖5)。我國(guó)的文獻(xiàn)數(shù)從 2010一直增長(zhǎng)到 2016年，2017年文獻(xiàn)數(shù)稍有降低后，2018年又呈上升趨勢(shì)，達(dá)42篇，是美國(guó)發(fā)表文獻(xiàn)最多年份文獻(xiàn)數(shù)量(2018年13篇)的 3.2倍。來(lái)自美國(guó)的文獻(xiàn)數(shù)量出現(xiàn)小幅度波動(dòng)，總體維持在10篇/年左右。印度的文獻(xiàn)數(shù)量在2010年—2015年之間較為平穩(wěn)，2016年后，呈持續(xù)上升趨勢(shì)。2014年以來(lái)，我國(guó)的文獻(xiàn)數(shù)量始終高于其他國(guó)家的文獻(xiàn)量，而且優(yōu)勢(shì)明顯，說(shuō)明我國(guó)已經(jīng)成為研究微藻收獲的活躍地區(qū)。

圖5 發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)量前 5 的國(guó)家的文獻(xiàn)數(shù)隨時(shí)間的變化

2.5 研究方向

對(duì)web of science數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的微藻收獲文獻(xiàn)研究方向進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)在生物技術(shù)和應(yīng)用微生物(Biotechnology and Applied Microbiology)方向的研究最多，占62.4%。這說(shuō)明從微生物方向入手對(duì)微藻收獲進(jìn)行研究最多，其次依次為能源燃料(30.5%)、化學(xué)(27.5%)和農(nóng)業(yè)(23.9%)等。

2.6 基于萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)的國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)數(shù)量變化

在萬(wàn)方知識(shí)數(shù)據(jù)服務(wù)平臺(tái)中以微藻收獲為關(guān)鍵詞搜索，共得文獻(xiàn)334篇，文獻(xiàn)數(shù)量逐年增加(圖7)，其中2014年—2016年達(dá)到了研究的頂峰期，期間內(nèi)每年約48篇，2017年至今國(guó)內(nèi)發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)逐年減少，而且中文期刊論文比專利和學(xué)位論文數(shù)量少，而國(guó)際上我國(guó)對(duì)微藻收獲技術(shù)的研究呈逐年上升趨勢(shì)(圖5)。其中部分原因可能為我國(guó)學(xué)者注重將研究結(jié)果優(yōu)先發(fā)表在web of knowledge索引的國(guó)際期刊上。中文文獻(xiàn)中52%為專利(圖8)。這說(shuō)明我國(guó)學(xué)者對(duì)微藻收獲技術(shù)優(yōu)先進(jìn)行專利保護(hù)。其次是學(xué)位論文、期刊論文、會(huì)議論文、科技報(bào)告、成果。

圖6 微藻收獲文獻(xiàn)的主要研究方及其占比

圖7 近10年國(guó)內(nèi)發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)隨時(shí)間的變化

圖8 國(guó)內(nèi)發(fā)表文獻(xiàn)類型占比

3 展望

文獻(xiàn)計(jì)量分析表明微藻收獲正在處于研究熱點(diǎn)，也說(shuō)明微藻收獲對(duì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。下面對(duì)有關(guān)微藻收獲相關(guān)研究進(jìn)行展望，以企為將來(lái)的相關(guān)研究提供參考。

3.1 微藻對(duì)可持續(xù)發(fā)展的重要作用

我國(guó)在過(guò)去20年里經(jīng)歷了高速發(fā)展時(shí)期，2010年成為世界第1大能源消費(fèi)國(guó)。我國(guó)能源消費(fèi)在全球的比重由1990年的4%，上升到2006年的10%，2019年將達(dá)到18%[13]。當(dāng)前，我國(guó)大部分能源來(lái)自煤炭(66.2%)、石油(18.8%)、天然氣(5.4%)等非再生原料，共占總能源約90%[14]。自1990年我國(guó)變成原油凈進(jìn)口國(guó)以來(lái)，2015年我國(guó)石油進(jìn)口量達(dá)到54 300萬(wàn)噸，占全國(guó)石油消費(fèi)量的60.6%[15]。所以開(kāi)發(fā)可持續(xù)能源是我國(guó)進(jìn)一步發(fā)展的必由之路。我國(guó)規(guī)劃在2020年生產(chǎn)230萬(wàn)噸生物柴油。但是，我國(guó)2015生產(chǎn)約114萬(wàn)噸生物柴油[16]，所以，繼續(xù)提高生物柴油產(chǎn)量的需求很緊迫。石油能源對(duì)環(huán)境的影響也十分巨大。2015年全球石油能源的二氧化碳排放量占全部二氧化碳排放量的34%。根據(jù)國(guó)際能源機(jī)構(gòu)(International Energy Agency)的報(bào)告，我國(guó)2015年的二氧化碳排放量占全球二氧化碳總排放量的28%，約9×109噸。微藻的自養(yǎng)模式不僅可以提供可持續(xù)能源，還可以降低二氧化碳排放量。采用生物能源，每生成1 kg微藻能吸收2 kg二氧化碳[17]。預(yù)計(jì)在2050年我國(guó)能減少3.7×108噸二氧化碳[15]。XIN等在2016年計(jì)算微藻生物柴油的成本約為2.23美元/加侖[18]，2018年時(shí)重新評(píng)估后價(jià)格變?yōu)?.85美元/加侖[19]。開(kāi)發(fā)進(jìn)一步降低成本的新微藻收獲技術(shù)對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)，以及世界可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

3.2 微藻收獲技術(shù)的發(fā)展

目前微藻收獲方法包括離心、過(guò)濾、浮選、沉降和化學(xué)絮凝等。離心法雖然可以快速收集微藻細(xì)胞，但需要投入設(shè)備和大量的能量[20]。過(guò)濾法易出現(xiàn)膜堵塞，需要不斷清洗[21]。自然沉降法的速度緩慢。浮選法耗能較大[22]?；瘜W(xué)絮凝法的絮凝劑和微藻細(xì)胞粘附成的無(wú)定型細(xì)胞團(tuán)仍然需要過(guò)濾、離心、或者沉降等步驟進(jìn)一步分離。而且大量使用氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鋁、聚丙烯酰胺等化學(xué)絮凝劑會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染[23]。美國(guó)能源部報(bào)道的脫水和干燥相結(jié)合的微藻收獲方式需要?jiǎng)恿鬏敽碗娂訜幔杀据^高[24]。ZHANG和SARMAN 報(bào)道的利用絲狀真菌和微藻共培養(yǎng)形成菌絲球的方式可以收獲100%微藻，而且不需要添加任何化學(xué)物質(zhì)，不需要大型設(shè)備[25, 26]。絲狀真菌和微藻共培養(yǎng)迅速成為研究熱點(diǎn)[27]。而且，絲狀真菌和微藻共同培養(yǎng)形成菌絲球降低培養(yǎng)液的粘度，提高培養(yǎng)液的透明度，有利于光線的射入，對(duì)微藻生物量和代謝物產(chǎn)量有協(xié)同作用。許多絲狀真菌，例如黑曲霉、煙曲霉、紅綬曲霉、Aspergilluslentulus、Isariafumosorosea都可以與微藻(普通小球藻、布朗葡萄藻、Auxenochlorellaprotothecoides、Nannochloropsissp.)共培養(yǎng)形成菌絲球[23]。這種共成球技術(shù)不僅可以達(dá)到收獲微藻的目的，而且可以應(yīng)用到廢水處理、高附加值代謝物生產(chǎn)等方面，例如去除廢水COD、總氮和總磷，吸附重金屬[28]，降解有害化合物[29]，及積累脂肪酸(C16-C18>83%)等[30]。絲狀真菌和微藻的共同培養(yǎng)形成菌絲球是一個(gè)含有固體、液體和氣體的異質(zhì)化培養(yǎng)體系。其影響因素包含菌種類型、種子形式、種子濃度、生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)基成分、顆粒、反應(yīng)器類型及培養(yǎng)策略等。絲狀真菌和微藻在不同應(yīng)用場(chǎng)景下形成菌絲球所需要的條件也不一樣。XIA前期利用調(diào)控pH的方式將卷枝毛霉形成菌絲球[31]。菌絲形態(tài)對(duì)絲狀真菌的代謝有很大影響[32]。例如聚半乳糖醛酸酶[33]、木質(zhì)素過(guò)氧化酶、葡萄糖糖化酶和呋喃果糖苷酶[34]等在菌絲球形態(tài)下產(chǎn)量較高。這些酶將微藻細(xì)胞壁水解產(chǎn)生的碳水化合物，用作絲狀真菌生長(zhǎng)的碳源，生長(zhǎng)為菌絲球，達(dá)到收獲微藻的效果。所以，絲狀真菌和微藻共同形成菌絲球技術(shù)是值得大力推廣的微藻收獲思路。

3.3 共成球方法收獲微藻的基礎(chǔ)研究

共成球方法收獲微藻主要綜合靜電相互作用、疏水相互作用和細(xì)胞壁組分的鹽橋作用三種作用力[25-26, 35]。由于絲狀真菌和微藻細(xì)胞均呈負(fù)電荷，具有靜電相互作用。絲狀真菌壁的羧基是負(fù)電荷的主要來(lái)源。孢子壁中黑色素富含羧基。分別敲除黑曲霉和煙曲霉合成黑色素的一個(gè)基因后，黑曲霉[36]和煙曲霉[37]孢子負(fù)電荷均明顯減少。而且，黑曲霉和白地霉孢子壁被聚丙烯酸羧化后表現(xiàn)出同樣的電荷量[38]。利用乙酸十二烷胍的氨基與菌孢子壁的羧基發(fā)生反應(yīng)，可使孢子的負(fù)電荷變?yōu)榱?，甚至變?yōu)檎姾伞２煌N類細(xì)胞所帶的電荷不同，而且受到pH、離子強(qiáng)度、離子化合價(jià)和陽(yáng)離子濃度等因素影響。高pH時(shí)孢子呈現(xiàn)負(fù)電荷多，細(xì)胞之間的靜電相互作用抑制聚集。例如，高pH時(shí)孢子不能與帶有負(fù)電荷的云母片粘附[39]。減少孢子負(fù)電荷量，降低了靜電相互作用，有利于孢子聚集。例如，孢子在等電點(diǎn)條件下利于孢子聚集。而且溶液中反離子(counter-ion)中和負(fù)電荷，也有利于孢子聚集[40]。絲狀真菌和微藻的靜電相互作用可以借助膠體化學(xué)的DLVO(Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek)理論表征[41]。

疏水相互作用是細(xì)胞之間相互粘附的一個(gè)重要因素[42]。細(xì)胞的疏水相互作用來(lái)自一種含有100～150個(gè)氨基酸，具有兩親性的疏水蛋白。孢子和氣生菌絲上都含有疏水蛋白。疏水蛋白在孢子表面形成厚度為5 nm～10 nm的涂層。氣生菌絲由于表面疏水蛋白涂層而可以延伸到空氣中[43]。細(xì)胞之間疏水相互作用較大時(shí)，吉布斯自由能低，有利于細(xì)胞聚集。敲除疏水蛋白基因?qū)е骆咦邮杷越档蚚44]。孢子的疏水相互作用也受到pH和離子強(qiáng)度的影響。pH由2.5升到5.0，導(dǎo)致疏水相互作用下降36.4%[45]。離子強(qiáng)度由0.5 mol/L NaCl降到0.05 mol/L NaCl，導(dǎo)致疏水相互作用下降25%。

鹽橋作用主要來(lái)自細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)、葡聚糖、疏水蛋白、黑色素和脂肪類組分[46]。細(xì)胞壁成分的不同導(dǎo)致鹽橋作用的差異。絲狀真菌孢子壁和菌絲壁的碳水化合物含量分別為2.5%和64.5%，而孢子壁和菌絲壁的蛋白質(zhì)含量分別為63.4%和6.6%。胞外多糖在菌絲體和微藻細(xì)胞的聚集中起重要作用[47]。絲狀真菌孢子萌發(fā)時(shí)，疏水蛋白和黑色素褪去，露出多糖結(jié)構(gòu)[48]，細(xì)胞可以附著在α-1,3葡聚糖鏈上[49]。因此，α-1,3葡聚糖對(duì)細(xì)胞和菌絲體的聚集有重要影響[50]。

上述三種作用力都受到細(xì)胞壁組分的影響。目前培養(yǎng)條件、細(xì)胞的生理狀態(tài)、細(xì)胞壁組分、細(xì)胞之間的作用力之間的關(guān)系還沒(méi)有統(tǒng)一起來(lái)。所以，對(duì)絲狀真菌和微藻共同培養(yǎng)收獲微藻的機(jī)制還需要進(jìn)一步明確，指導(dǎo)收獲微藻的研究。