一株近玫色鎖擲酵母的分離鑒定及其產(chǎn)胞外乳糖酶性質(zhì)的研究

苑廣偉， 林 梅， 李鎮(zhèn)標， 孫玉紅， 王兆磊， 王 磊*

1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣州 510642；2.廣東唯新生物科技有限公司，惠州 516057；3.深圳唯新生物科技有限公司，深圳 518116

近玫色鎖擲酵母(Sporidioboluspararoseus)是一類擔(dān)子菌門真菌，屬擲孢酵母科，菌落一般呈紅色或淺紅色。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鎖擲酵母能產(chǎn)色素、不飽和脂肪酸、多糖等營養(yǎng)代謝物質(zhì)，已作為食品添加劑應(yīng)用于動物飼料中，其在醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域也越來越受到人們關(guān)注，應(yīng)用范圍也愈加廣泛[1]。目前利用其生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的研究日趨火熱，LIU C等人通過酸堿處理法、酶溶法、化學(xué)試劑處理法、高壓勻漿法和細胞自溶法五種破壁方法處理近玫色鎖擲酵母，達到破壞細胞壁釋放類胡蘿卜素的目的，并通過SK-HEP-1細胞實驗確定其產(chǎn)生的類胡蘿卜素具有抗氧化作用[2]；CHAIYASO T等人研究發(fā)現(xiàn)SporidioboluspararoseusKX709872具有產(chǎn)α-淀粉酶和葡糖糖苷酶的活性，將其用于生物發(fā)酵，結(jié)果表明其有效的將餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)和脂類，達到變廢為寶的作用[3]；DU C等人的研究表明Sporidioboluspararoseus的代謝產(chǎn)物可緩解血脂異常的情況，可用于改善肥胖人員的脂類代謝，降低疾病的發(fā)生[4]，但針對近玫色鎖擲酵母(Sporidioboluspararoseus)所產(chǎn)乳糖酶的研究還未深入。

乳糖酶(Lactase)又稱β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside-galactohydrolase,EC.3.2.1.23)，簡稱為β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)[5,6]。乳糖酶能催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖[7]。β-半乳糖苷酶在自然界中廣泛地存在，哺乳動物的腸、大腦，特別是嬰兒的腸道中都含有β-半乳糖苷酶[8,9]；桃、蘋果和咖啡豆等植物中也含有β-半乳糖苷酶[10]；微生物界中的細菌、酵母、霉菌和放線菌等都具有產(chǎn)β-半乳糖苷酶的能力[11]。β-半乳糖苷酶可用于乳產(chǎn)品的生產(chǎn)加工[12]，β-半乳糖苷酶通過水解乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖，而低聚半乳糖是一種功能性物質(zhì)，是人體腸道中胃腸道微生物菌落所利用的營養(yǎng)源。低聚半乳糖有利于維持和恢復(fù)胃腸道菌群，同時促進其生長增殖，其具有調(diào)節(jié)腸道健康，改善免疫功能、降低代謝紊亂的潛力[13]；β-半乳糖苷酶作為酶制劑可用于治療乳糖不耐受癥狀及多種兒童消化不良癥，特別是嬰幼兒腹瀉病[14]；β-半乳糖苷酶還能與其他抗生素聯(lián)用，例如與杜迪和思密達聯(lián)用治療輪狀病毒腸炎，能明顯地縮短治療療程，提高治愈度；同時β-半乳糖苷酶還可以用于免疫分析、對微量激素藥物的定量分析，以及病毒等的測定[15]；β-半乳糖苷酶的水解從而有效解決乳清的利用和排放問題，同時還生成乳清糖漿等制品，從而達到節(jié)約資源，減少環(huán)境污染的可能[16]。

近年來，微生物來源的β-半乳糖苷酶被廣泛研究，其在食品和制藥工業(yè)中的許多應(yīng)用而受到越來越多的關(guān)注；酵母菌是生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的主要微生物菌株[17]。乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)作為生產(chǎn)乳糖酶的優(yōu)先來源已被廣泛研究；SONG C等人對嗜冷性酵母產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶進行研究，表明了其應(yīng)用于乳業(yè)生產(chǎn)中的潛力[5]；NAKAGAWA等人從日本北海道的土壤樣品中分離出一株假單胞菌可以產(chǎn)生耐低溫耐酸的β-半乳糖苷酶[18]。在本研究中，從土壤中分離得到一株近玫色鎖擲酵母XWSP1(SporidioboluspararoseusXWSP1)，并發(fā)現(xiàn)其具有產(chǎn)β-半乳糖苷酶的能力，故初步優(yōu)化其產(chǎn)β-半乳糖苷酶的培養(yǎng)條件和酶學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源

SporidioboluspararoseusXWSP1，分離自廣州徐聞農(nóng)墾豐收農(nóng)場土壤。

1.1.2主要試劑和儀器

Tryptone，OXOID公司)，Yeast extract，OXOID公司；β-半乳糖苷(ONPG)生化鑒定管，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，麥克林；E.Z.N.A.TMSP Fungal DNA Kit，OMEGA BIO-TEK；TaKaRa LA Taq?，TaKaRa公司；10×Loading Buffer，TaKaRa公司；DL 2 000 bp DNA Marker，TaKaRa公司；DL 15 000 bp DNA Marker，TaKaRa公司。超低溫冷凍離心機，德國Eppendorf公司；紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；pH計，奧豪斯儀器有限公司；PCR儀，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；核酸測序儀，美國Applied Biosystems公司；電泳儀，美國Bio-rad公司；核酸成像系統(tǒng)，美國UVP公司。

1.1.3種子培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato peptone agar，PDA，g/L)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，NaCl 3 g，KH2PO41.5 g，維生素B10.008 g，瓊脂粉15 g。

1.1.4發(fā)酵培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，g/L)：Tryptone 20 g，Yeast extract 15 g，葡糖糖20 g。

1.2 產(chǎn)乳糖酶菌株的分離、篩選

采用種子培養(yǎng)基進行土壤真菌的分離純化，取10 g土壤樣品，添加90 mL無菌水，置于恒溫搖床上28 ℃、180r/min恒溫振蕩1 h，使土樣均勻地分散于無菌水中，制成10-1土壤懸液。采用稀釋涂布平板法和平板劃線法進行土壤真菌的分離純化。取10-1土壤懸液，通過梯度稀釋，使懸液稀釋至10-3；取100 uL不同稀釋梯度的懸液涂布于PDA固體培養(yǎng)基中，每個稀釋梯度做三個平行組；將涂布完畢的PDA平板置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d～4 d，觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況，并通過平板劃線法根據(jù)菌落的形態(tài)特征挑取不同的單菌落進行劃線，從而獲得純化菌株。

將已純化的菌株以2%接種量、1×106CFU/mL接種濃度接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)30 h獲得菌液；將菌液稀釋至1×106CFU/mL，取50 μL稀釋后菌液加入β-半乳糖苷(ONPG)生化鑒定管中(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)，三個平行組，混勻，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，將生化鑒定管顏色變黃色的菌株進行進一步純化和鑒定。

1.3 菌株分子鑒定

采用E.Z.N.A.TMSP Fungal DNA Kit試劑盒法提取真菌基因組DNA。并以ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)為引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，交由廣州擎科生物科技有限公司進行核酸測序。ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析。

1.4 粗酶液的制備

取不同培養(yǎng)條件下的近玫色鎖擲酵母發(fā)酵液，經(jīng)12 000 r/min，4 ℃離心5 min，除去菌體，得到的上清液即為粗酶液，用于后續(xù)胞外乳糖酶酶活測定。

1.5 乳糖酶酶活力測定方法

采用吉斯特-布洛卡茲法[19]，以鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)為底物進行測定，取0.5 mL粗酶液待測液于5 mL離心管中，并加入2.0 mL 10 mmol/L ONPG溶液并震蕩均勻，30 ℃水浴中反應(yīng)10 min后取出，加入0.5 mL 1 mol/L Na2CO3(已預(yù)冷)溶液顯色，于分光光度計420 nm處比色。以加熱滅活的粗酶液同樣處理作為空白。在上述條件下，每分鐘催化ONPG生成1 μmol/L鄰硝基苯酚(ONP)所需的酶量定義為一個酶活力單位(1 U)。用已知濃度的鄰硝基苯酚(ONP)溶液繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線得到待測液中鄰硝基苯酚(ONP)濃度。從而計算出胞外乳糖酶酶活力。

酶活力計算公式：U/mL=(V1·N·c)/(V2·t)

注：c：根據(jù)標準曲線計算出的ONPG濃度(mmol/L)；N：為粗酶液稀釋倍數(shù)；V1：反應(yīng)總體積(mL)；V2：粗酶液體積(mL)；t：反應(yīng)時間(min)

1.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

以培養(yǎng)時間、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分(碳源、氮源)等條件優(yōu)化菌株產(chǎn)乳糖酶的能力。設(shè)置三個發(fā)酵培養(yǎng)重復(fù)組，以1×106CFU/mL接種濃度、2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180r/min培養(yǎng)72 h，分別測定培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h和72 h發(fā)酵液的胞外乳糖酶酶活。根據(jù)測定結(jié)果，選擇最優(yōu)培養(yǎng)時間，探索不同接種量、培養(yǎng)溫度對酶活力的影響。在以上優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同培養(yǎng)基組分，分別以不同碳源取代原始培養(yǎng)基的葡萄糖，確定最優(yōu)碳源。然后改變培養(yǎng)基中蛋白胨、酵母粉的量，最終確定最適產(chǎn)酶發(fā)酵條件。

1.7 pH、金屬離子對乳糖酶酶活的影響

在pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的乳糖酶反應(yīng)體系中，測定pH對胞外乳糖酶活性的影響。根據(jù)測定結(jié)果，選擇最適pH，在反應(yīng)體系中分別加入終溶度為1 mmol/L的金屬離子K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+，探索不同金屬離子對胞外乳糖酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

篩選出一株具有乳糖酶活性的菌株，命名為XWSP1，酶活篩選結(jié)果如圖1所示，與CK(加入等量ddH2O)相比,該菌株使β-半乳糖苷(ONPG)生化鑒定管中液體顏色變?yōu)樯铧S色，表明該菌株具有產(chǎn)乳糖酶的能力。

注：實驗組1、2、3為加入XWSP1發(fā)酵液的三個平行實驗組，CK為加入ddH2O對照組

圖1 菌株XWSP1在ONPG生化管中的顏色變化

2.2 菌株XWSP1形態(tài)特征

菌株XWSP1在種子培養(yǎng)基上形態(tài)特征如圖2所示：菌落呈淡紅色，向上凸起，表面光滑、濕潤、容易挑取，菌落質(zhì)地均勻，顏色均一。

圖2 XWSP1菌落形態(tài)

2.3 菌株XWSP1的分子鑒定

通過試劑盒法提取的該菌基因組DNA片段長度在15 kb以上，符合基因組DNA長度的大小，如圖3所示。通過ITS1/ITS4引物對進行PCR擴增，該菌PCR產(chǎn)物電泳條帶如圖4所示，其序列大小在500 bp～750 bp之間，與ITS序列條帶大小相符。

注：M為15 000 bp marker；1為菌株XWSP1基因組DNA

注：M為2 000 bp maker；ITS為菌株XWSP1的PCR條帶

圖4 ITS PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠的電泳分析

將ITS序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，該菌株與近玫色鎖擲酵母SporidioboluspararoseusstrainAUMC 7791(JQ425362.1)同源性最高，達到99%。故命名為：近玫色鎖擲酵母XWSP1(SporidioboluspararoseusXWSP1)。進一步利用MEGA7.0軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，如圖5所示，該菌株與SporidioboluspararoseusstrainAUMC 7791(JQ425362.1)聚為一支，進化距離最近。

圖5 XWSP1及同源菌株的ITS序列系統(tǒng)進化分析

2.4 菌株XWSP1產(chǎn)乳糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1培養(yǎng)時間的優(yōu)化

由圖6可知，菌株XWSP1產(chǎn)胞外乳糖酶酶活力與培養(yǎng)時間有關(guān)，隨著培養(yǎng)時間的增加，酶活力逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)至54 h，酶活力最高，達到0.019U/mL，此時菌密度亦達到穩(wěn)定期；當(dāng)培養(yǎng)時間多于54 h時，酶活力又逐漸降低，推測引起酶活力下降的原因是菌株發(fā)酵所需營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，菌株代謝物積累，導(dǎo)致菌株生長代謝受限；故培養(yǎng)時間54 h為產(chǎn)酶最適的培養(yǎng)時間。

圖6 菌株培養(yǎng)時間與胞外乳糖酶酶活力關(guān)系圖

2.4.2接種量的優(yōu)化

由圖7可知，菌株XWSP1以4.0%接種量進行液體培養(yǎng)時，胞外乳糖酶酶活力最高，達到0.050 U/mL當(dāng)接種量低于或高于4.0%時，酶活力均有所下降。故4.0%的接種量是該菌產(chǎn)酶最適的接種量。

圖7 菌株接種量對胞外乳糖酶酶活力的影響

2.4.3培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

由圖8可知，當(dāng)菌株XWSP1的培養(yǎng)溫度為28 ℃時，其胞外乳糖酶酶活力最高，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于23 ℃或高于28 ℃時，其胞外乳糖酶的酶活力明顯下降。故28 ℃是該菌發(fā)酵及產(chǎn)胞外乳糖酶的最適培養(yǎng)溫度。

圖8 培養(yǎng)溫度對胞外乳糖酶酶活力的影響

2.4.4培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

由圖9可知，當(dāng)以半乳糖、乳糖替代葡萄糖提供碳源時，菌株XWSP1發(fā)酵后的胞外乳糖酶酶活力明顯升高。以半乳糖做碳源其胞外乳糖酶酶活力是葡萄糖的2.77倍；而以可溶性淀粉、蔗糖、果糖替代葡萄糖提供碳源時，胞外乳糖酶酶活力明顯降低。故半乳糖為菌株XWSP1發(fā)酵產(chǎn)胞外乳糖酶最適培養(yǎng)基碳源組分。

由圖10可知，與僅添加蛋白胨或酵母粉相比，以蛋白胨和酵母粉同時添加至培養(yǎng)基中，菌株XWSP1的產(chǎn)酶能力較好；當(dāng)添加蛋白胨15 g/L、酵母粉20 g/L時，菌株XWSP1產(chǎn)酶能力最佳；僅有蛋白胨或酵母粉一種組分時，菌株XWSP1的產(chǎn)酶能力較差。

2.5 乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1pH對酶活的影響

由圖11可知，在反應(yīng)溫度不變的條件下，胞外乳糖酶在pH為5.0～8.0范圍內(nèi)均維持較高的酶活力，其中pH為7.0時酶活力最高，pH大于7.0或小于7.0時酶活下降；該實驗中不同pH反應(yīng)條件(pH為5.0～8.0)下的酶活力均高于0.2 mg/mL β-半乳糖苷酶/GAL標準品的酶活。

圖9 培養(yǎng)基碳源對乳糖酶酶活力的影響

注：P為蛋白胨，Y為酵母粉

注：CK：β-半乳糖苷酶/GAL標準品，其標準酶活力為110 U/mg，本研究所用β-半乳糖苷酶溶液濃度為0.2 mg/mL。

2.5.2金屬離子對酶活的影響

由圖12可知，不同金屬離子對胞外乳糖酶酶活力起到不同的作用，Ca2+、Mn2+、Mg2+和Cu2+對酶活有抑制作用，其中Cu2+對酶活有抑制作用最強，K+、Zn2+和Na+對胞外乳糖酶酶活力幾乎沒有影響。

圖12 金屬離子-胞外乳糖酶酶活力關(guān)系圖

3 討論與結(jié)論

酵母菌是目前工業(yè)化生產(chǎn)乳糖酶的主要菌種來源[19]，但針對近玫色鎖擲酵母所產(chǎn)乳糖酶的研究較少。本研究從土壤中分離出一株產(chǎn)乳糖酶菌株，經(jīng)鑒定該菌株在分類學(xué)上與近玫色鎖擲酵母屬聚為一族，故命名為：近玫色鎖擲酵母XWSP1(SporidioboluspararoseusXWSP1)，該菌株的保藏編號為CCTCC NO: M2019119。近玫色鎖擲酵母XWSP1在蛋白胨 15 g/L、酵母粉 20 g/L、半乳糖20 g/L和初始pH7.0的培養(yǎng)基中，以1×106CFU/mL接種濃度、4%接種比例，28 ℃ 180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)54 h時，其分泌的胞外乳糖酶具有最高的酶活；近玫色鎖擲酵母XWSP1所產(chǎn)胞外乳糖酶最適反應(yīng)pH為7.0，Ca2+、Mn2+、Mg2+和Cu2+對酶活有不同程度的抑制作用，其中Cu2+對酶活抑制作用最強。

不同培養(yǎng)條件和反應(yīng)條件對乳糖酶酶活具有一定的調(diào)節(jié)作用。GHOSH M等人研究表明CandidapseudotropicalisB57產(chǎn)乳糖酶最適溫度為30 ℃、最適pH為7.0[20]；ITOH T等人研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的pH為6.6～6.8時，最適合乳酸克魯維酵母產(chǎn)乳糖酶[21]；SONG C等人對psychrotolerantyeastGuehomycespullulans17-1培養(yǎng)條件和酶學(xué)特性進行研究，培養(yǎng)基中添加乳糖可以促進乳糖酶的產(chǎn)生，不同比例的氮源亦可以促進菌株生長和乳糖酶的產(chǎn)生[5]。張明麗等人的研究表明Zn2+、Cu2+、Pb2+等離子對節(jié)桿菌代謝產(chǎn)生的乳糖酶具有顯著的抑制作用，其中Cu2+對乳糖酶的抑制作用最強[22]；BIAKOWSKA A M等人的研究表明，Ca2+、Mn2+普遍被認為是酶抑制劑，其研究把Mg2+作為乳糖酶激活劑使用，同時亦指出不同濃度的Mg2+所起到的作用亦不同，過高濃度的Mg2+可以起到抑制乳糖酶的作用[11]。本研究SporidioboluspararoseusXWSP1最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，其所產(chǎn)胞外乳糖酶最適pH為7.0，并在pH為5.5～8.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，適宜于工業(yè)化應(yīng)用，后續(xù)將進一步研究乳糖酶代謝調(diào)控機理。