HPLC法同時(shí)測(cè)定忍冬葉中9種活性成分的研究

朱金花，王悠悠，慶偉霞,劉繡華,2*，趙東保,3

(1.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，環(huán)境與分析科學(xué)研究所，河南 開封 475004；2.河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004；3.河南大學(xué) 特種功能材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

HPLC法同時(shí)測(cè)定忍冬葉中9種活性成分的研究

朱金花1，王悠悠1，慶偉霞1,劉繡華1,2*，趙東保1,3

(1.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，環(huán)境與分析科學(xué)研究所，河南 開封 475004；2.河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004；3.河南大學(xué) 特種功能材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

為了有效利用忍冬植株，建立了同時(shí)檢測(cè)忍冬葉中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C、木犀草素和槲皮素9種活性成分含量的HPLC分析方法，并用于忍冬葉中活性成分的定量測(cè)定，為忍冬葉多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)和方法參考.

忍冬葉；HPLC；9種活性成分同時(shí)測(cè)定

忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)為傳統(tǒng)中藥材金銀花的藥源植物[1]，其花具有廣譜抗菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝利膽、降血脂、降血糖、止血等作用[2-7].在臨床上對(duì)多種疾病均有較好的治療效果，被廣泛地應(yīng)用在中藥制劑、飲料、花茶、保健品等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景.在忍冬的種植過程中，忍冬葉的產(chǎn)量是花的10倍左右[8]，但大多作為非藥用部位被廢棄，造成極大的資源浪費(fèi).所以，改善忍冬葉的應(yīng)用現(xiàn)狀，提高忍冬的種植效益是當(dāng)前亟待解決的問題.

綠原酸和木犀草苷是2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定的金銀花質(zhì)量控制指標(biāo).綠原酸屬于有機(jī)酸類，為金銀花的主要抗菌有效成分；木犀草苷屬于黃酮類，該類物質(zhì)具有很好的藥理活性[9-11].除此之外，忍冬中還含有很多其他的有效成分.文獻(xiàn)報(bào)道從忍冬葉中分離鑒定出多種黃酮類化合物[12-16].課題組前期研究結(jié)果表明，忍冬葉中黃酮化合物的含量要高于花中[17]，并且有研究學(xué)者利用膠束介質(zhì)萃取-HPLC的方法測(cè)定了金銀花中的綠原酸、蘆丁和槲皮素[18].《中國(guó)藥典》中只規(guī)定了綠原酸和木犀草苷是金銀花質(zhì)量控制指標(biāo)，指標(biāo)成分較為單一，難以全面衡量金銀花藥材質(zhì)量.并且截止到目前為止，還未見同時(shí)測(cè)定忍冬中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C、木犀草素和槲皮素9種活性物質(zhì)含量的報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)首次建立 HPLC法同時(shí)測(cè)定忍冬葉中這9種活性物質(zhì)含量的方法，以期為忍冬葉進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Aglient1200系列(美國(guó)安捷倫科技公司)，四元泵G1311A，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱：COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6×250 mm，5 μm)，水為二次蒸餾水，甲醇、乙睛為色譜純(默克股份有限公司)，冰乙酸為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司).

對(duì)照品：新綠原酸、異綠原酸C、金絲桃苷(四川省維克奇生物科技有限公司)；蘆丁(Aladdin-阿拉丁試劑(上海)有限公司)，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(本實(shí)驗(yàn)室自制，含量≥98%)；木犀草素、綠原酸、咖啡酸、槲皮素(中國(guó)藥品生物制品檢定所).忍冬葉采于河南大學(xué)金明校區(qū)藥用植物園內(nèi)，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院李欽教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬的葉子.

1.2 供試品溶液的制備

將忍冬葉樣品40 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩.精密稱取樣品2 g，置索氏提取器中，加120 mL石油醚脫脂至無色，脫脂粉末晾干后用80%甲醇100 mL，80 ℃下回流提取3次，每次3 h，合并甲醇提取液，減壓濃縮至干，用甲醇溶解，定容至50 mL的容量瓶中，作為供試品溶液，備用.進(jìn)樣前用0.45μm有機(jī)濾膜過濾.

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品木犀草素2.0 mg、木犀草苷4.6 mg、綠原酸5.5 mg、異綠原酸C 2.9 mg、新綠原酸1.3 mg、金絲桃苷4.6 mg、蘆丁6.2 mg、槲皮素1.9 mg、咖啡酸1.6 mg.置同一25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成混合對(duì)照品溶液.

1.4 色譜條件

采用COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm，5μm) 色譜柱，流動(dòng)相為乙腈 (A) -0.5% 醋酸 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，12%～20% A；10～20 min，20% A；20～45 min，20%～30% A)，流速1 mL/ min.檢測(cè)波長(zhǎng)λ= 327 nm；溫度t= 25 ℃；進(jìn)樣量：10μL.按上述條件可以將9種物質(zhì)分離開.對(duì)照品和供試品色譜圖如圖1所示.

1.新綠原酸， 2.綠原酸， 3.咖啡酸,4.蘆丁,5.木犀草苷,6.金絲桃苷,7.異綠原酸C,8.木犀草素,9.槲皮素.圖1 對(duì)照品(A)和供試品(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and sample (B)

2 方法學(xué)考察

2.1 線性關(guān)系的考察

將上述對(duì)照品溶液用甲醇稀釋至不同濃度梯度，取上述不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL進(jìn)樣分析，分別以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.9種分析物的線性方程見表1.

2.2 精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

按1.3項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，1.4項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C和木犀草素的RSD分別為1.47%,1.74%,0.55%,1.58%,0.49%,2.11%,3.73%,3.78%.表明儀器精密度良好.

精密稱取忍冬葉粉末2 g，平行5份，按1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，1.4項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算得到新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C和木犀草素峰面積的RSD分別為1.52%,1.64%,0.93%,1.38%,0.67%,3.21%,2.73%,3.53%.表明該方法重現(xiàn)性良好.

精密稱取忍冬葉粉末2 g，按1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得到新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C和木犀草素峰面積的RSD分別為1.27%,1.51%,0.60%,1.42%,0.46%,1.94%,3.34%,3.33%.表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.3 加標(biāo)回收率

精密稱取忍冬葉粉末2 g，平行3份，分別加入一定量的混合對(duì)照品，按1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照1.4方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各成分的回收率.新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C、木犀草素和槲皮素的平均回收率分別為97.13%,96.93%,101.82%,100.12%,98.89%,97.70%,98.16%,99.17%,99.97%，RSD分別為2.76%,2.22%,4.06%,0.91%,0.44%,1.76%,0.61%,1.37%,0.59%,9個(gè)成分的回收率在96.93%～101.82%之間，表明該方法準(zhǔn)確度較高.

2.4 樣品的測(cè)定

取忍冬葉待測(cè)樣品，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果如表2.

表1 9種分析物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table 1 Calibration curves,correlation coefficients and linear ranges of 9 analytes

表2 忍冬葉中9 種成分的含量(n=3)Table 2 9 analytes in leaves of Lonicera japonica Thunb (n=3)

注：采摘時(shí)間為2015年2月

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

綠原酸和木犀草苷是《中國(guó)藥典》規(guī)定忍冬質(zhì)量的控制指標(biāo)，而忍冬成分復(fù)雜，單以綠原酸和木犀草苷作為指標(biāo)性成分，不能全面反映忍冬質(zhì)量.本實(shí)驗(yàn)建立HPLC同時(shí)測(cè)定忍冬葉中9 種較穩(wěn)定活性成分(新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C、木犀草素和槲皮素)的含量，以及對(duì)相應(yīng)的方法學(xué)進(jìn)行考察.所有化合物均在327 nm左右有較大的吸收，故選327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).分別考察了乙腈-水和甲醇-水溶液為流動(dòng)相對(duì)9種成分的分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙腈-水溶液為流動(dòng)相的色譜峰峰型和分離度均良好，且保留時(shí)間短，故選其作為流動(dòng)相；在該流動(dòng)相體系中，部分待測(cè)化合物峰形對(duì)稱性較差，故又考察了乙腈-(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)醋酸水溶液，結(jié)果顯示在乙腈-0.5%醋酸水溶液條件下效果最好，各個(gè)成分在45 min內(nèi)洗脫,且得到良好的分離.

3.2 測(cè)定結(jié)果討論

從測(cè)定結(jié)果(表2)來看，忍冬葉中9種物質(zhì)的含量差異較大，異綠原酸C和綠原酸的含量相對(duì)較高，其次是木犀草苷和蘆丁，木犀草素和咖啡酸的含量相對(duì)較低，在該實(shí)驗(yàn)條件下，未檢出槲皮素.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，張芳等[19]曾對(duì)山東5個(gè)不同變異類型的忍冬進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)槲皮素的含量在0.001 1%～0.007 1%之間；辛華等[20]測(cè)得結(jié)果顯示：山東金銀花中槲皮素只有0.12 mg/g，遂意弄椿紅腺、北更加樂紅腺、北更植仁紅腺、北更內(nèi)仁紅腺等品種未檢出槲皮素.為進(jìn)一步確證所分析樣品中是否含有槲皮素，采用加大被提取樣品用樣量、加大待測(cè)液濃度以及選用超聲法等進(jìn)行提取，均未能檢出槲皮素.另外，對(duì)一年內(nèi)其他所有月份采摘的忍冬葉進(jìn)行槲皮素的分析，也未檢出.由此推斷該品種的忍冬葉中可能不含槲皮素或其含量極微.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中我們建立的HPLC定量分析方法，能同時(shí)測(cè)定9種活性成分的含量，且穩(wěn)定、可靠、效率高、重復(fù)性好，可以為忍冬葉活性成分進(jìn)一步研究提供依據(jù)和參考.

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[責(zé)任編輯：吳文鵬]

Determination of nine active constituents in the leaves ofLonicerajaponicaThunb by HPLC

ZHU Jinhua1,WANG Youyou1,QING Weixia1,LIU Xiuhua1,2*,ZHAO Dongbao1,3

(1.InstituteofEnvironmentalandAnalyticalSciences,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmune-EngineeringofHenanProvince,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 3.KeyLabForSpecialFunctionalMaterials,MinistryofEducation,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

In order to effectively utilize the individual plant ofLonicerajaponicaThunb,a method to determine the contents of nine bioactive compounds (neochlorogenic acid,chlorogenic acid,caffeic acid,rutin,galuteolin,hyperoside,isochlorogenic acid C,luteolin and quercetin) in leaves ofLonicerajaponicaThunb was established by HPLC.The method was applied to determine the 9 active ingredients in the leaves.It can apply to evaluate the quality of the leaves ofLonicerajaponicaThunb.

leaves ofLonicerajaponicaThunb; HPLC; simultaneousl determination of 9 components

2016-09-23.

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(152102210257),河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A150028,14B150017),河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(14IRTSTHN030).

朱金花(1982-),女,副教授,研究方向?yàn)樯V技術(shù)的理論及應(yīng)用研究.*

,E-mail:liuxiuhua@henu.edu.cn.

R284.2

A

1008-1011(2017)01-0070-05