二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒抗氧化及抑菌性研究

王亞男，吳 春

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆?？寡趸耙志匝芯?/p>

王亞男，吳 春

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

通過對羥自由基、超氧陰離子、DPPH清除能力和還原力的測定，確定了二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的抗氧化能力；濾紙片法測定了二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對細菌和霉菌抑菌性能.結(jié)果表明,二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒較二氫楊梅素的DPPH清除作用略高，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的羥自由基體系清除作用高于二氫楊梅素、Vc的清除作用，當(dāng)質(zhì)量質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時對于超氧陰離子的清除率可達到80.89%，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒與Vc的還原力接近，抑菌試驗結(jié)果顯示，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌效果，對青霉和黑曲霉抑菌效果不明顯，對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的平均抑菌直徑分別為14.1 mm和12.4 nm；對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉的最小抑菌質(zhì)量濃度分別是7.5、15、60 mg/mL，對黑曲霉幾乎無抑制作用.

二氫楊梅素；固體脂質(zhì)顆粒；抗氧化性；抑菌性

二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DMY)又名雙氫楊梅素、蛇葡萄素等，是雙氫黃酮醇化合物.二氫楊梅素具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等生物活性，且無毒副作用[1-2]，因此在日用化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)以及其他領(lǐng)域獲得了極為廣泛的應(yīng)用[3-5].但由于二氫楊梅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點，其水溶性較差；且易發(fā)生氧化，穩(wěn)定性較差，使其在水溶性體系中的應(yīng)用受到限制.為改善二氫楊梅素的水溶性，作者以二氫楊梅素為原料，硬脂酸與卵磷脂為載體，采用高溫乳化-低溫固化的方法將其制備成O/W型的固體脂質(zhì)顆粒(SLP).本文在此基礎(chǔ)上研究二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的抗氧化和抑菌活性，為擴大其應(yīng)用范圍提供有益的實驗依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA2004N電子天平、pH-2S(數(shù)顯)pH計、HH.S11-2數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、721E型紫外可見分光光度計、LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器、PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋、LRH-70生化培養(yǎng)箱、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-IFD型超凈工作臺.

1.2 材料

二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒：實驗室自制.

鄰苯三酚(上海第二化學(xué)試劑廠)、DPPH(美國Sigma公司)、Tris(上?？婆d技術(shù)有限公司)、抗壞血酸(上?？婆d技術(shù)有限公司)、青霉素鈉(上海晶純生化試劑股份有限公司)、牛肉膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、瓊脂粉(哈爾濱新春化工廠)，其他試劑均為分析純.

實驗菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院微生物實驗室培養(yǎng)并提供).

2 試驗方法

2.1 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆?？寡趸阅艿臏y定

2.1.1 DPPH自由基的清除作用

用無水乙醇溶液配制成20 μg/mL的DPPH乙醇溶液，保存于暗處備用[6-7].取五只25 mL容量瓶，將二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒用無水乙醇分別配制成質(zhì)量濃度梯度為0.005、0.01、0.02、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL的二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒乙醇溶液.量取2 mLDPPH乙醇溶液，2 mL的樣品溶液在具塞試管中混合，在室溫下暗處反應(yīng)30 min后，在517 nm處測其吸光值，平行3次，作為Ai；量取2 mLDPPH乙醇溶液，2 mL的無水乙醇溶液在具塞試管中混合，在室溫下暗處反應(yīng)30 min后，在517 nm處測其吸光值，平行3次，作為A0；量取2 mL無水乙醇溶液，2 mL的樣品溶液在具塞試管中混合，在室溫下暗處反應(yīng)30 min后，在517 nm處測其吸光值，平行三次，作為Aj；計算公式如下：DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.以上吸光值均以無水乙醇作參比.同樣方法測得二氫楊梅素、Vc的對DPPH的清除作用.結(jié)果見圖1.

2.1.2 對羥自由基體系的清除作用[8]

取5只試管，分別加入10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，10 mmol/L的FeSO41.0 mL，混勻，再加入質(zhì)量濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒乙醇溶液，加入1 mmol/L的H2O21.0 mL啟動反應(yīng)，用蒸餾水將體系補至10 mL，37 ℃保溫30 min，于510 nm處測定吸光值，按照下列公式計算不同質(zhì)量濃度的二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對于羥自由基的清除率P，平行3次，計算公式如下：P=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%.其中A0為空白對照即用乙醇代替樣品溶液的吸光值；Ai為加入樣品后的吸光值；Aj為不加入水楊酸的吸光值.同樣方法測得Vc、二氫楊梅素的對清除率.結(jié)果見圖2.

2.1.3 對超氧陰離子自由基體系的清除作用[9]

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH= 8.2)5 mL，加入1 mL質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/mL樣品溶液混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)10 min，加入10 mmol/L的鄰苯三酚溶液(用10 mmol/L的HCl配制)0.5 mL，迅速混勻，320 nm處測定吸光值，每30 s讀取1次，4 min后結(jié)束，樣品的鄰苯三酚氧化速率由吸收率曲線(ΔAi)的斜率計算.空白對照組以1 mL的蒸餾水代替樣品(ΔA0)進行測定.樣品本底組以0.5 mL的蒸餾水代替10 mmol/L的鄰苯三酚溶液(ΔAj)進行測定.以上實驗均平行3次.計算公式P：超氧陰離子清除活性(%)=[1-(ΔAi-ΔAj)/ΔA0]×100%，同樣方法測得Vc、二氫楊梅素的對超氧陰離子的清除作用.結(jié)果見圖3.

2.1.4 還原能力的測定[10]

取5支試管，分別加入質(zhì)量濃度梯度為0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 mg/mL的二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒水溶液，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩溶液(pH=6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液(K3Fe(CN)6)2.5 mL 置于50 ℃水浴20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的速度離心10min后取5mL上清液，依次加入4 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液(FeCl3)1 mL，充分混勻后靜置10 min，以蒸餾水作參比溶液，在700 nm下測定其吸光度值，吸光值越高說明還原力越強.同樣方法測得Vc、二氫楊梅素的還原力.結(jié)果見圖4.

2.2 抑菌實驗

2.2.1 菌種懸液的配制

細菌：在無菌操作臺上，取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌斜面各一支，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮下，接入滅過菌的細菌液體培養(yǎng)基中，振蕩均勻，將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的菌懸液置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，備用.

霉菌：在無菌條件下，將青霉、黑曲霉分別用接種環(huán)接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基后，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)3 d后，待菌落成熟后，取適量的滅過菌的生理鹽水倒于其上，用無菌玻璃棒將菌落刮下，置于已滅菌的三角瓶中，振蕩搖勻，再用無菌8層紗布過濾，即得霉菌孢子懸液，備用.

2.2.2 配制培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基：于1 L蒸餾水中加入蛋白胨10 g，準確稱取的牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，邊加熱邊用玻璃棒攪拌使其充分溶解，然后分裝到錐形瓶中，加塞，121 ℃高壓滅菌20 min(固體培養(yǎng)基另加 15～20 g的瓊脂).

霉菌培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g(馬鈴薯去皮，洗凈，切成小塊)，放入1 000 mL水中煮沸20 min，雙層紗布過濾，得馬鈴薯汁，再加瓊脂20 g，煮沸溶解，趁熱加20 g葡萄糖，并補足水分到1 000 mL，分裝，于121 ℃高壓滅菌20 min.

2.2.3 抑菌圈測定

將濾紙用直徑6 mm的打孔器打成6 mm的圓片，經(jīng)高壓滅菌處理后，置100 ℃烘干，保存?zhèn)溆?在無菌超凈臺中，每個滅菌后平板中加入大約20 mL的45 ℃左右的未凝固培養(yǎng)基，放在超凈臺的水平位置待其凝固后使用一次性注射器取菌種懸液100 μL于平板的中心處，用涂布棒將其在整個平板中涂布均勾.將濾紙浸泡在無菌水、青霉素鈉、二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(30 mg/mL)溶液30 min以上.取出分別貼在1～6﹟培養(yǎng)基中.每種溶液做3次水平實驗.平板封口后，放入培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng).細菌(大腸、枯草)放于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.霉菌放于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)霉菌48 h.毫米刻度尺測量抑菌圈直徑，并記錄，結(jié)果見表1、2.

2.2.4 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)檢測

采用兩倍稀釋法[11-13].根據(jù)體外抑菌實驗結(jié)果并結(jié)合提取物的溶解性，測定二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的最低抑菌質(zhì)量濃度.將其配成120 mg/mL的質(zhì)量濃度備用，取無菌試管10支，每管加入適宜的培養(yǎng)基20 mL，分別加入120、60、30、15、7.5、3.75 mg/mL的二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒溶液1 mL，混合均勻傾入平皿，培養(yǎng)基凝固后，將0.1 mL稀釋后的菌懸液加入平皿中并涂勻，將細菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h，霉菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h，而后觀察結(jié)果.MIC表示不長菌的稀釋溶液的質(zhì)量濃度.結(jié)果判定：以肉眼觀察，不發(fā)生混濁變化的最高提取物稀釋倍數(shù)為該提取物的MIC，結(jié)果見表3.

3 結(jié)果與討論

3.1 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆?？寡趸钚詼y定的結(jié)果與分析

3.1.1 對DPPH的清除作用

二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)、二氫楊梅素(DMY)和Vc對DPPH的清除作用結(jié)果如圖1所示.二氫楊梅素、二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒及Vc對DPPH的清除率均隨其質(zhì)量濃度的增加而增大，三者均有較好的清除效果，快速的達到平衡，清除能率依次為Vc>二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒>二氫楊梅素，其中Vc的清除效果最好.結(jié)果表明，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的DPPH清除能力較二氫楊梅素略高，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒有利于其抗氧化能力的發(fā)揮.

圖1 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)對DPPH的清除作用

3.1.2 對羥自由基體系的清除作用

采用水楊酸法測定不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)、二氫楊梅素(DMY)及Vc溶液對羥自由基的清除率結(jié)果如圖2所示.二氫楊梅素、二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒及Vc對羥自由基的清除率均隨樣液質(zhì)量濃度的增加而增大.由于黃酮類化合物有活潑的3，4位酚羥基，能提供活潑的氫離子，從而阻斷自由基反應(yīng)，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的清除效果一直高于Vc.當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.8 mg/mL后，Vc的羥自由基體系的清除作用高于二氫楊梅素.結(jié)果表明，二氫楊梅素和二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒均對羥自由基有一定的清除能力，而以硬脂酸與卵磷脂作為載體制備的二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒在一定程度上增強了二氫楊梅素的抗氧化能力.

圖2 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)對羥自由基的清除作用

3.1.3 對超氧陰離子自由基體系的清除作用

采用鄰苯三酚法測定不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)、二氫楊梅素(DMY)及Vc溶液對溶超氧陰離子自由基的清除率的結(jié)果如圖3所示.可以看出隨質(zhì)量濃度的升高，對超氧陰離子的清除能力也逐漸增大，這是由于二氫楊梅素和二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的質(zhì)量濃度升高，他們作為自由基的接受體，阻礙自由基連鎖反應(yīng)的能力也就越強，同時增強了清除自由基的能力.在質(zhì)量濃度梯度為0～0.04 mg/mL中，二氫楊梅素與Vc的清除效果接近且低于二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.04 mg/mL后，Vc的清除作用高于二氫楊梅素及其固體脂質(zhì)那顆粒.實驗結(jié)果表明，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒及二氫楊梅素均有抗氧化能力，且二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的清除能力較二氫楊梅素強.

圖3 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)對超氧陰離子的清除作用

3.1.4 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的還原能力

采用鐵氰化鉀還原法測定不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)、二氫楊梅素(DMY)及Vc溶液的還原能力結(jié)果如圖4所示.可以看出，在0.06～0.1 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，二氫楊梅素、二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒及Vc的還原能力都隨質(zhì)量濃度的升高而增強，抗壞血酸的還原能力最強，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒次之，且二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒與Vc的還原能力相近.

圖4 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒(SLP)的總還原能力

3.2 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的抑菌活性的結(jié)果與分析

3.2.1 對細菌的抑菌效果

見表1.

表1 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對大腸桿菌的抑菌效果

3.2.2 對霉菌的抑菌效果

二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒及青霉素鈉均未在涂有黑曲霉的平皿上出現(xiàn)抑菌圈，說明二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對黑曲霉沒有抑菌作用，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒及青霉素鈉在涂有青霉的平皿中只有濾紙片粘貼處無菌生長，說明二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對青霉抑制作用不明顯.

3.2.3 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定結(jié)果

見表2.

表2 二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定結(jié)果

注：“-”：無菌生長；“+”：菌落生長

4 結(jié) 語

實驗以二氫楊梅素和Vc作為對照，對二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的抗氧化性進行了研究，主要測定其對DPPH、羥基自由基、超氧陰離子和還原能力.二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的清除能力雖比Vc略低但較二氫楊梅素有了明顯的提高，且清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而提高.當(dāng)質(zhì)量濃度達到0.1 mg/mL時對DPPH的清除率最高達到81.77%，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時對羥自由基的清除作用超過Vc，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時對于超氧陰離子的清除率就可達到80.89%，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的還原力高于Vc.

實驗以無菌水、二氫楊梅素、和青霉素鈉做對照，研究了二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉和黑曲霉這四種菌的抑制效果.結(jié)果表明二氫楊梅素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，對青霉、黑曲霉無明顯的抑制作用，二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對四種菌中的具體抑制效果如下：1)二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對大腸桿菌草芽芽孢桿菌和的平均抑菌分別為14.1 mm和12.4 nm；對青霉和黑曲霉抑制效果較弱，說明二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對細菌抑制效果顯著.2)二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒的最小抑菌質(zhì)量濃度：二氫楊梅素固體脂質(zhì)顆粒對細菌的抑制作用較明顯，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉的最小抑菌質(zhì)量濃度分別是7.5、15、60 mg/mL，對黑曲霉幾乎無抑制作用.

[1] 曹敏惠, 姜 晴, 鄭西洲, 等. 藤茶二氫楊梅素茶氨酸復(fù)合物的制備及抗氧化活性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(10): 36-41.

[2] 熊 偉, 李雄輝, 胡居吾, 等. 薄膜-超聲法制備二氫楊梅素脂質(zhì)體的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012(5): 254-257.

[3] 張曉元, 吳 暉, 林 霞, 等. 用ESR檢測二氫楊梅素對自由基的清除作用的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(10): 1040-1042, 1070.

[4] SHEN Y, LINDEMEYER A K, CLAUDIA G,etal. Dihydromyricetin as a novel anti-alcohol intoxication medication [J]. Journal of Neuroscience, 2012, 32(1): 390-401.

[5] 徐靜娟, 姚茂君, 鄔敏辰. 二氫楊梅素生物功效的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(11): 622-625.

[6] 李鉉軍, 崔勝云. 抗壞血酸清除DPPH自由基的作用機理[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(1): 86-90.

[7] LIU B, DU J, JIE Z,etal. Characterization and antioxidant activity of dihydromyricetin-lecithin complex [J]. European Food Research & Technology, 2009, 230(2): 325-331.

[8] 陳根洪. 藤茶總多酚的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(6): 127-130.

[9] 陳金娥, 趙金玲, 張海容. 青蒿中黃酮、多酚和VC含量測定及抗氧化性研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(4): 1-4.

[10] 陳曉靜, 于江傲, 趙瑞香. 顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素的制備及其抗氧化活性研究[J]. 農(nóng)業(yè)機械, 2012, 18: 137-139.

[11] 蕭力爭, 銀 霞, 劉素純, 等. 二氫楊梅素抗菌活性研究[J]. 食品科技, 2008(4): 140-143.

[12] 楊 文, 李海霞, 陳麗珍, 等. 二氫楊梅素-鎳配合物的合成及抗菌活性的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(14): 122-126.

[13] 張 一，吳 春.二氫楊梅素微乳對油脂的抗氧化活性研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，26(5)：622-625.

Study on antioxidant and antibacterial activity of solid lipid particles of dihydromyricetin

WANG Ya-nan, WU Chun

(School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The antioxidant capacity of dihydromyricetinsolid lipid particles was determined through hydroxyl free radical, superoxideanion, DPPH scavenging capacity and reducing power assay. The antibacterial properties of bacteria and molds of dihydromyricetinsolid lipid particles were measured using filter paper method. The optimized conditions were obtained as follows. The scavenging effect of DPPH on dihydromyricetinsolid lipid particles was higher than that of dihydromyricetin. The scavenging effect of hydroxyl radical system of dihydromyricetinsolid lipid particles was higher than that of Vc and dihydromyricetin. When the concentration was 0.08 mg/mL, the scavenging rate of superoxide anion could reach 80.89%, and the reduction force of dihydromyricetinsolid lipid particles was close to Vc. The results of antibacterial test showed that dihydromyricetinsolid lipid particles had obvious antibacterial effect on E. coli and Bacillus subtilis, and the average antibacterial diameter of E. coli and Bacillus subtilis was 14.1mm and 12.4 nm. The minimal inhibitory concentrations of E. coli, Bacillus subtilis and Penicillium were 7.5 mg/mL, 15 mg/mL and 60 mg/mL, respectively. It had almost no inhibitory effect on Aspergillus niger.

solid lipid particles; dihydromyricetin; antioxidant activity; antibacterial activity

2016-06-06.

王亞男(1991-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué).

TS272

A

1672-0946(2017)01-0048-04