沉默Versican基因?qū)κ笤葱愿伟┘?xì)胞株Hepa1-6體外增殖及遷移影響的研究*

李之曦， 王 力， 劉燕揚(yáng)， 王喻義， 羅 鋒， 曹 丹

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院肺癌中心， 成都 610041; 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院腹部腫瘤科， 成都 610041)

沉默Versican基因?qū)κ笤葱愿伟┘?xì)胞株Hepa1-6體外增殖及遷移影響的研究*

李之曦1， 王 力1， 劉燕揚(yáng)1， 王喻義1， 羅 鋒1， 曹 丹2△

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院肺癌中心， 成都 610041; 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院腹部腫瘤科， 成都 610041)

目的： 檢測(cè)Versican基因在鼠源性肝癌細(xì)胞的表達(dá)情況，觀察沉默Versican基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖及遷移能力的影響。 方法： 采用Western blot技術(shù)檢測(cè)鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6中Versican的表達(dá)。構(gòu)建沉默Versican基因的shRNA質(zhì)粒(shVCAN)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hepa1-6，通過(guò)熒光顯微鏡觀察shVCAN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，采用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)Versican基因的沉默效率。CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shVCAN質(zhì)粒后Hepa1-6的增殖能力變化；劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shVCAN質(zhì)粒后Hepa1-6的遷移能力變化；免疫熒光及Western blot檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shVCAN質(zhì)粒后Hepa1-6上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6中Versican蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)。熒光顯微鏡顯示shVCAN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hepa1-6效率高；RT-PCR及Western blot顯示，shVCAN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hepa1-6后，其內(nèi)的Versican表達(dá)受到明顯抑制。此外，shVCAN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hepa1-6后，其增殖及遷移能力降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，免疫熒光及Western blot顯示，shVCAN質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hepa1-6內(nèi)，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，N-cadherin的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論： 沉默鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6內(nèi)Versican基因的表達(dá)，其增殖及遷移能力均受到抑制，其部分機(jī)理可能與沉默Versican基因引發(fā)Hepa1-6內(nèi)E-cadherin上調(diào)及N-cadherin下調(diào)有關(guān)。

肝癌； Versican； 增殖； 遷移； 上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

原發(fā)性肝癌(primary hepatic cancer，PHC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的90%左右[1]。在我國(guó)的癌癥患者中，肝癌位居死亡原因第二位，是預(yù)后最差的腫瘤之一。肝癌預(yù)后兇險(xiǎn)，治療效果不理想，平均生存期僅4～5個(gè)月[2]。由于肝癌的早期癥狀多不明顯，且極易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，故大部分肝癌患者就診時(shí)已屬中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，其5年生存率只有7%，絕大多數(shù)患者死于肝癌的局部復(fù)發(fā)或侵襲轉(zhuǎn)移[3]。因此，抑制或者延緩肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移成為治療的首要目的，更加有效的，新的治療策略需要基于對(duì)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入理解，而尋找出有效的干預(yù)靶點(diǎn)則是提高肝癌患者總體療效的關(guān)鍵所在。

Versican是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種大分子的硫酸軟骨素蛋白多糖，是機(jī)體重要的多功能分子，在許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、大腸癌等組織中呈表達(dá)上調(diào)[4]。研究證實(shí)[5]，腫瘤細(xì)胞自身會(huì)分泌大量的Versican，通過(guò)TLR2(toll-like receptor 2)激活巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，上調(diào)炎性因子的表達(dá)，從而營(yíng)造并維持腫瘤炎性微環(huán)境。此外，Versican還參與了惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程，我們的既往研究發(fā)現(xiàn)[6]，沉默Versican能明顯抑制黑色素瘤的遷移能力。由此看來(lái)，Versican在炎癥的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。若能在腫瘤原位沉默或敲除Versican基因的表達(dá)，則有希望減少或延緩腫瘤微環(huán)境相關(guān)炎癥性改變，同時(shí)拮抗或逆轉(zhuǎn)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力，最終抑制腫瘤進(jìn)展。

肝癌的發(fā)生發(fā)展離不開(kāi)肝臟微環(huán)境的變化[7]。有研究報(bào)道，炎癥可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生及發(fā)展[8-9]，這提示Versican可能涉及了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，然而其是否能調(diào)節(jié)肝癌微環(huán)境炎性改變，是否參與調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在初步探討Versican基因在鼠源性肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，設(shè)計(jì)并構(gòu)建沉默Versican基因的shRNA質(zhì)粒(shVCAN)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，觀察shVCAN質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及在肝癌細(xì)胞中的對(duì)Versican基因的沉默效率，同時(shí)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變情況及部分可能的相關(guān)機(jī)理，以期為后續(xù)的肝癌炎性微環(huán)境研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 質(zhì)粒shVCAN(pcDNA6.2-GW/EmGFP-MIR-VCAN)及質(zhì)粒shC(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negative)均購(gòu)自Invitrogen公司，寡聚單鏈DNA序列見(jiàn)表1，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。

表1 miRNA 寡聚單鏈DNA序列(附陰性對(duì)照序列)

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠肝癌細(xì)胞株Hepa1-6購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，由本實(shí)驗(yàn)室保種。

1.1.3 主要試劑 培養(yǎng)基DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基)購(gòu)自Gibco公司，殺稻瘟菌素Blasticidin S HCl購(gòu)自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofecTAMine2000購(gòu)自Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8購(gòu)自Dojindo公司，Versican多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，Anti-β actin antibody購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，E-cadherin及N-cadherin均購(gòu)自Santa Cruz公司。

圖1 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR圖譜

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hepa1-6用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作參照Invitrigen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofecTAMine2000使用說(shuō)明書進(jìn)行。取鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6(2×105/孔)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按一定比例分別加入LipofecTAMine2000及Invitrigen公司提供的4對(duì)miRNA 寡聚單鏈DNA，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后吸除轉(zhuǎn)染液，并加入DMEM完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.3 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 取鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6(2×105/孔)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按一定比例分別加入LipofecTAMine2000及篩選出的沉默效率最高的1對(duì)miRNA 寡聚單鏈DNA所構(gòu)建的相應(yīng)質(zhì)粒，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后吸除轉(zhuǎn)染液，并加入DMEM完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。通過(guò)殺稻瘟菌素Blasticidin S HCl(3.5μg/mL)進(jìn)行篩選，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，待有GFP+綠色熒光單克隆細(xì)胞團(tuán)形成時(shí)，反復(fù)多次挑取陽(yáng)性克隆，用含Blasticidin S HCl(3.5μg/mL)的選擇性DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 RT-PCR 取各處理組的Hepa1-6細(xì)胞，分別提取總RNA，采用兩步法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，RT的反應(yīng)條件為：94℃ 5min，94℃ 30s，60～61℃(退火溫度隨引物而不同)30s，72℃ 30s，36個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。反應(yīng)產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc型，Bio-RAD公司)成像。GAPDH引物：上游5’-ACCACAGTCCATGCCA-3’下游5’-TCCACCACCCTGTTGC-3’。

1.2.5 Western blot 細(xì)胞中加入適量RAPI：PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)(100 ∶1)裂解，離心提取總蛋白，按照BCA(bicinchoninic acid，聚氰基丙烯酸正丁酯)法測(cè)定總蛋白濃度，上樣量為每孔30μg總蛋白。在所提取的蛋白中加入上樣緩沖液，98℃變性10 min。100V恒壓電泳，電泳后進(jìn)行濕式電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜后用5%牛奶封閉液封閉1h，一抗的Versican，E-cadherin、N-cadherin用0.05%TBST緩沖液按1 ∶1000稀釋，4℃孵育過(guò)夜，0.05%TBST洗3次，每次15～20min。加入二抗稀釋液(1 ∶1000)，室溫孵育1h，0.05%TBST洗3次，每次15～20min。使用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×103/孔，接種于96孔板。每天每種細(xì)胞各取出3個(gè)孔，加入培養(yǎng)基與CCK-8以10 ∶1混合的培養(yǎng)液110μL，同時(shí)在僅含培養(yǎng)液的孔加入CCK-8作為空白對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)4h，重復(fù)該步驟3～5天。用Micro-ELISA儀讀取吸光值，計(jì)算出存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔板中加入約(1～2)×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至各組細(xì)胞形成細(xì)胞單層后用槍尖頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕。用無(wú)血清培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次，加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后取樣，拍照。Transwell實(shí)驗(yàn)：用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液按1 ∶2.5稀釋Matrigel膠，包被Transwell小室底部，將其放入24孔培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，待膠凝。消化收集細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基懸浮并計(jì)數(shù)。在小室外加入1mL按1 ∶1混合的條件培養(yǎng)液和DMEM完全培養(yǎng)基，在小室內(nèi)加入400μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1×104。培養(yǎng)24～48h后，取出Transwell小室，PBS輕輕沖洗，用棉簽將膠及微孔膜上層的細(xì)胞輕輕擦掉，950mL/L酒精固定10～15min，蘇木素染色10～15min。用PBS洗凈后顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.8 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于覆有蓋玻片的6孔板，制備細(xì)胞爬片。PBS清洗爬片，4%的多聚甲醛固定爬片15min；5%BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)室溫孵育細(xì)胞30 min。滴加免疫熒光一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；次日二抗室溫避光孵育1h，DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)復(fù)染細(xì)胞核；最后抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡玻片觀察采集圖像并拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定沉默Versican基因的鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6的構(gòu)建

通過(guò)RT-PCR技術(shù)從Invitrigen公司提供的4對(duì)miRNA 寡聚單鏈DNA序列中篩選出沉默效率最高的1對(duì)序列(MIR-VCAN-4F及MIR-VCAN-4R序列信息詳見(jiàn)表1)，根據(jù)此序列，我們構(gòu)建了沉默Versican基因的質(zhì)粒shVCAN及空載體對(duì)照質(zhì)粒shC。待shVCAN及shC質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hepa1-6后，首先，通過(guò)熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率(圖2a)，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)陽(yáng)性細(xì)胞占90%以上。

圖2 成功構(gòu)建沉默Versican基因的鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6

(a)熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率

(b)RT-PCR驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shVCAN及shC后Hepa1-6中 Versican表達(dá)

(c)Western blot驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shVCAN及shC后Hepa1-6中 Versican表達(dá)

接下來(lái)，采用RT-PCR及Western blot技術(shù)分別在RNA水平及蛋白水平驗(yàn)證Hepa1-6內(nèi)Versican基因的沉默效率，結(jié)果顯示：Versican基因無(wú)論在RNA水平還是蛋白水平上，其表達(dá)在Hepa1-6/shVCAN中都明顯低于Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6(圖2b-c)。此外，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hepa1-6，在連續(xù)傳代及凍存復(fù)蘇后，仍具有強(qiáng)的GFP熒光表達(dá)且通過(guò)RT-PCR及Western blot證實(shí)Hepa1-6/shVCAN中Versican仍處于明顯低表達(dá)狀態(tài)。以上結(jié)果提示，Versican在鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6內(nèi)呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)，我們已成功構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shVCAN的Hepa1-6。

2.2 CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6的增殖

本研究采用CCK-8法檢測(cè)Hepa1-6/shVCAN、Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6增殖活性的變化。結(jié)果顯示，以正常Hepa1-6作為對(duì)照，在72h時(shí)，Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC活細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)；其余觀察點(diǎn)(24,48,96h)Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC，其增殖率的下降無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沉默Versican對(duì)Hepa1-6在72h時(shí)的增殖有一定的抑制作用。

圖3 CCK-8檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6的增殖變化shVCAN vs. shC, *P<0.05

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6的遷移

本實(shí)驗(yàn)采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hepa1-6在穩(wěn)定沉默Versican后其遷移能力的變化，結(jié)果顯示，在24h及48h時(shí)，以正常Hepa1-6作為對(duì)照，Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC的遷移細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)(圖4)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沉默Versican可抑制Hepa1-6的遷移能力。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6的遷移

采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hepa1-6/shVCAN、Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6的遷移能力變化。結(jié)果顯示：以穿過(guò)Transwell小室的正常Hepa1-6數(shù)量作為對(duì)照，48h時(shí)， Hepa1-6/shVCAN數(shù)量較Hepa1-6/shC明顯減少(P<0.01)(圖5)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：沉默Versican能有效地抑制Hepa1-6的遷移能力。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6的遷移能力shVCAN vs. shC, *P<0.05, **P<0.01

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6的遷移能力。shVCAN vs. shC, **P<0.01

2.5 免疫熒光及Western-blot檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6內(nèi)EMT(epithelial-mesenchymal transition，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)通路相關(guān)蛋白的變化

我們通過(guò)免疫熒光檢測(cè)穩(wěn)定沉默Versican對(duì)Hepa1-6中EMT相關(guān)特征性蛋白E-cadherin及N-cadherin表達(dá)的改變。結(jié)果顯示，相對(duì)于Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6而言，Hepa1-6/shVCAN中E-cadherin的表達(dá)水平上調(diào)，而N-cadherin的表達(dá)水平下調(diào)(圖6a)。通過(guò)Western blot檢測(cè)，我們同樣發(fā)現(xiàn)，與Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6相比，在Hepa1-6/shVCAN中，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin的表達(dá)下調(diào)(圖6b)。結(jié)果提示，沉默Versican基因后Hepa1-6遷移能力的改變可能與Hepa1-6中EMT通路相關(guān)蛋白發(fā)生的改變關(guān)系密切。

圖6 免疫熒光技術(shù)及Western blot驗(yàn)證穩(wěn)定沉默Versican后Hepa1-6中E-cadherin及N-cadherin表達(dá)的改變

(a)免疫熒光檢測(cè)Hepa1-6中E-cadherin及N-cadherin表達(dá)

(b)Western blot檢測(cè)Hepa1-6中E-cadherin及N-cadherin表達(dá)

3 討 論

肝癌是一種高度惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，容易早期局部擴(kuò)散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其預(yù)后兇險(xiǎn)，死亡率高，患者總生存期短[10]。與其他腫瘤一樣，針對(duì)肝癌的傳統(tǒng)治療方法具有特異性差，愈后差和容易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)，絕大多數(shù)患者死于肝癌的局部復(fù)發(fā)或侵襲轉(zhuǎn)移。肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移均涉及極其復(fù)雜的多基因調(diào)控異常過(guò)程，因此，研究肝癌的病因及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

Versican是一種具有多個(gè)炎癥配體結(jié)合位點(diǎn)的大分子硫酸軟骨素蛋白多糖，存在于大多數(shù)軟組織細(xì)胞外基質(zhì)中。通常，它處于低表達(dá)狀態(tài)，但當(dāng)組織發(fā)生炎癥時(shí)急劇上升。在人類中，Versican由位于5q14.3染色體的單基因編碼，人與鼠存在86%的一致性，表明該蛋白多糖的高度保守性。近年來(lái)，不斷有研究發(fā)現(xiàn)，Versican在許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、大腸癌等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

由于肝癌是一種與炎癥密切相關(guān)的惡性腫瘤，炎癥可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展，那么我們推測(cè)，Versican可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。為了驗(yàn)證此假設(shè)，我們構(gòu)建了沉默Versican的shRNA質(zhì)粒(shVCAN)，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中。Hepa1-6是來(lái)源于C57L/J小鼠的BW7756肝癌細(xì)胞株，表達(dá)AFP，免疫原性弱但惡性度較高，病理特征類似臨床肝細(xì)胞癌組織，同時(shí)也是目前C57BL/6背景下唯一的肝癌細(xì)胞株。通過(guò)GFP熒光觀察，我們證實(shí)了shVCAN及shC質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率高，進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR及Western blot證實(shí)了Versican在Hepa1-6/shVCAN中的表達(dá)明顯低于Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6。接下來(lái)，我們對(duì)轉(zhuǎn)染前后Hepa1-6的生物學(xué)行為進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在72h時(shí)，Hepa1-6/shVCAN較Hepa1-6/shC及正常Hepa1-6活細(xì)胞數(shù)量減少，說(shuō)明沉默Versican能抑制Hepa1-6的增殖，然而其增殖抑制是否與Versican介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期抑制及細(xì)胞自噬有關(guān)[11-13]，仍需進(jìn)一步探索；此外，我們的研究結(jié)果顯示，沉默Versican后，Hepa1-6的遷移能力明顯受阻。既往多項(xiàng)研究也曾得到相似的結(jié)果。例如有研究發(fā)現(xiàn)， 沉默Versican可以干擾CD44-EGFR/ErbB2通路從而減弱黑色素瘤細(xì)胞的遷移能力[14]。

如前所述，我們已然發(fā)現(xiàn)沉默Versican能抑制鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6的增殖及遷移能力，而遷移能力的改變與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移涉及到腫瘤細(xì)胞表型的改變以及對(duì)周圍環(huán)境的改變，是多步驟、多階段的過(guò)程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，EMT在生物的發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，是腫瘤發(fā)展和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的重要標(biāo)志性轉(zhuǎn)變。既往研究表明，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，會(huì)伴隨著腫瘤細(xì)胞EMT[15-16]。這一過(guò)程包括E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附喪失和細(xì)胞外基質(zhì)降解，使得上皮腫瘤細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，從而獲得了較高的侵襲與遷移能力。EMT的發(fā)生是以E-cadherin、細(xì)胞角蛋白等上皮性標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，N-cadherin、Vimentin等間葉性標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)為特點(diǎn)，而且發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞間遷移和侵襲能力增強(qiáng)[17-18]。有文獻(xiàn)報(bào)道[19]，Versican在EMT胞外基質(zhì)重構(gòu)過(guò)程中起到重要的作用。如上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)在沉默Versican基因后，鼠源性肝癌細(xì)胞株Hepa1-6的遷移能力是受到明顯抑制。那么我們猜測(cè)，上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的部分機(jī)理可能與沉默Versican基因后Hepa1-6中EMT通路相關(guān)蛋白發(fā)生了改變有關(guān)。為了證實(shí)穩(wěn)定沉默Versican可能對(duì)Hepa1-6的EMT過(guò)程中胞外基質(zhì)的重構(gòu)產(chǎn)生影響，我們采用免疫熒光技術(shù)及Western blot在細(xì)胞水平探討穩(wěn)定沉默Versican對(duì)EMT相關(guān)特征性蛋白E-cadherin及N-cadherin表達(dá)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Hepa-6/shC及正常Hepa1-6相比，沉默Versican上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)了N-cadherin的表達(dá)，提示沉默Versican后Hepa1-6遷移能力的改變可能與Hepa1-6的EMT通路相關(guān)蛋白發(fā)生了改變有關(guān)。

目前，Versican與肝癌的關(guān)系，以及其對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及部分機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。Versican可作為肝癌發(fā)生、進(jìn)展、遷移和侵襲等過(guò)程中一個(gè)重要的檢測(cè)指標(biāo)及潛在靶點(diǎn)，其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制和意義還有待進(jìn)一步深入研究，同時(shí)也為我們后續(xù)進(jìn)一步研究Versican與肝癌炎性微環(huán)境的改變關(guān)系提供了一定的參考依據(jù)。

作者聲明：本文第一作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任。

利益沖突：本文全部作者均認(rèn)同文章無(wú)相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測(cè)；

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

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Silencing Versican Influences Proliferation and Migration of Mouse Original Hepatocellular Carcinoma Cells Hepa1-6 in Vitro*

Li Zhixi, Wang Li, Liu Yanyang, et al

(LungCancerCenter,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,Sichuan,China)

Objective: To detect the expression of Versican and study the impacts of silencing Versican on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells. Methods: The expression of Versican in mouse original hepatocellular carcinoma cells Hepa1-6 was detected by Western blot. Constructing plasmid silencing Versican stably transfected Hepa1-6 cells. The transfected effect of the plasmid in Hepa1-6 cells was observed under fluorescence microscope. The silenced effects of Versican in Hepa1-6 cells were detected by RT-PCR and Western blot. The CCK-8 assay was used to detect the proliferative ability of Hepa1-6/shVCAN. Migration ability of Hepa1-6/shVCAN was examined by Scratch and Transwell assays. The expression of EMT-related proteins was detected by immunofluorescence and Western blot. Results: The expression of Versican in Hepa1-6 cells was positive. The transfected effect of the shVCAN plasmid in Hepa1-6 cells was high under fluorescence microscope.The expression of Versican in Hepa1-6 cells was obviously inhibited after transfected shVCAN plasmid shown by RT-PCR and Western blot analysis. Moreover, the abilities of proliferation and migration of Hepa1-6 cells were also significantly suppressed after transfected shVCAN plasmid compared with those of Hepa1-6/shC and Hepa1-6 cells (P<0.05). The immunofluorescence and Western blot analysis revealed that the expression level of E-cadherin was up-regulated while N-cadherin was down-regulated in Hepa1-6/shVCAN cells compared with those in Hepa1-6/shC and Hepa1-6 cells. Conclusion: Silencing the expression of Versican could inhibit the proliferative and migration abilities of mouse original hepatocellular carcinoma cells Hepal-6 and the partly mechanisms may be related to the up-regulation of E-cadherin and down-regulation of N-cadherin.

Primary Hepatic Cancer; Versican; Proliferation; Migration; Epithelial-mesenchymal Transition

2016- 10- 25

2017- 01- 11

*國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81071864)

李之曦(1985-)，男，四川成都人，博士，講師，主要研究方向：腫瘤生物治療的基礎(chǔ)與臨床研究。

△曹 丹，副教授，E-mail：caodan316@163.com

R735.7；R730.231

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.01.004

?應(yīng)用基礎(chǔ)研究?