飼料中霉菌毒素脫毒方法的評(píng)估

穆雅東,萬(wàn)建美,賈慧君譯自Mycotoxins-may 2016：6～8邵建忠 校 何 閃 制圖表

飼料中霉菌毒素脫毒方法的評(píng)估

穆雅東,萬(wàn)建美,賈慧君*譯自Mycotoxins-may 2016：6～8邵建忠 校 何 閃 制圖表

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和煙曲霉毒素的各種生物標(biāo)記物可用來(lái)證明兩種酶制劑降解玉米赤霉烯酮和煙曲霉毒素的體內(nèi)功效和兩種木質(zhì)纖維素吸附劑無(wú)法吸附豬胃腸道中的玉米赤霉烯酮。

1 生物標(biāo)記物

體外試驗(yàn)是開(kāi)發(fā)霉菌毒素脫毒劑的關(guān)鍵步驟。然而，為了評(píng)估霉菌毒素脫毒劑在動(dòng)物體內(nèi)的功效，體內(nèi)研究是必需的。評(píng)估霉菌毒素暴露和脫毒程度的最適指標(biāo)，是霉菌毒素的生物標(biāo)記物。生物標(biāo)記物和生物基質(zhì)的選擇取決于很多因素，如日糧中霉菌毒素的濃度，暴露時(shí)間長(zhǎng)度，霉菌毒素本身及其脫毒產(chǎn)品的吸收、代謝和排泄，還取決于霉菌毒素改變動(dòng)物代謝過(guò)程和對(duì)動(dòng)物物種影響的能力。非創(chuàng)傷性的生物標(biāo)記最合適，選擇生物基質(zhì)的其他標(biāo)準(zhǔn)是霉菌毒素滅活的機(jī)理。本文將著重介紹用來(lái)研究豬胃腸道中鐮刀菌屬霉菌毒素(玉米赤霉烯酮)和煙曲霉毒素B1+B2(Fumonisins B1+B2，F(xiàn)B1+FB2，F(xiàn)UMs)失活的生物標(biāo)記物。

2 尿液肌酸酐作為生物標(biāo)記物

飼料中添加霉菌毒素脫毒劑的主要目的是降低霉菌毒素的生物利用率。此目標(biāo)可以通過(guò)使用與吸附劑發(fā)生不可逆吸附或利用酶或微生物降解使毒素失活來(lái)實(shí)現(xiàn)。評(píng)估這兩種類(lèi)型飼料添加劑功效最直接的方法是監(jiān)測(cè)效應(yīng)生物標(biāo)記物的變化(然而，這只適用于某些霉菌毒素)或者比較正對(duì)照組和試驗(yàn)組中吸收的霉菌毒素母體及其天然代謝物的總摩爾濃度。對(duì)豬來(lái)講，測(cè)定被吸收化合物總濃度的兩種可能基質(zhì)是尿液和血清。由于尿液樣本水分含量的不同，將總濃度（一種排泄速度相對(duì)恒定的生物標(biāo)志物）為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是進(jìn)行可靠比較的關(guān)鍵。

3 霉菌毒素代謝物作為其他生物標(biāo)記物

吸附劑的適用性取決于對(duì)霉菌毒素母體生物利用率的降低程度，而根據(jù)動(dòng)物腸道中酶或微生物的降解，酶或微生物降解類(lèi)飼料添加劑可作為測(cè)試飼料添加劑適用性的其他生物標(biāo)記物。較難被吸收的霉菌毒素降解產(chǎn)物以及通過(guò)膽汁排泄部分被運(yùn)送到胃腸道中的霉菌毒素降解作用，都可以通過(guò)分析糞便中霉菌毒素代謝產(chǎn)物組成來(lái)進(jìn)行評(píng)估。表1列出了測(cè)定吸附劑、酶和微生物在豬胃腸道中滅活玉米赤霉烯酮和煙曲霉毒素功效的可能生物標(biāo)記物。

玉米赤霉烯酮很容易被豬的胃腸道

吸收，一部分降解成為α-玉米赤霉醇(α-Zeranol，α-ZEL)。玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉醇大部分可以發(fā)生葡糖醛酸化反應(yīng)，并通過(guò)尿液排出。因此，可以根據(jù)尿中ZEN代謝物的總摩爾濃度來(lái)選擇檢測(cè)飼料添加劑功效的生物標(biāo)記物，總摩爾濃度可以通過(guò)直接分析葡糖醛酸苷態(tài)的ZEN濃度或分析經(jīng)β-葡糖醛酸酶水解后的ZEN濃度獲得。與玉米赤霉烯酮不同，煙曲霉毒素不易被豬的胃腸道吸收，從而導(dǎo)致糞便中煙曲霉毒素濃度很高，而血液和尿液中濃度很低。因此，糞便中煙曲霉毒素的組成狀況是最容易檢測(cè)的毒素暴露生物標(biāo)記物。然而，這并不能準(zhǔn)確反映吸收時(shí)煙曲霉毒素的組成狀況，因?yàn)槲幢晃盏臒熐苟舅卦谕ㄟ^(guò)糞便排出前可能會(huì)被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。此外，檢測(cè)糞便中煙曲霉毒素的濃度不適用于評(píng)定吸附劑的功效。然而，與玉米赤霉烯酮相比，效應(yīng)生物標(biāo)記物的存在簡(jiǎn)化了煙曲霉毒素的體內(nèi)試驗(yàn)研究：煙曲霉毒素暴露會(huì)擾亂鞘脂類(lèi)代謝，導(dǎo)致血液中鞘氨基醇?jí)A鞘胺醇(Sphinganine，Sa)對(duì)二氫鞘氨醇(Sphingosine，So)的比例發(fā)生變化。然而Sa/So比例的升高取決于煙曲霉毒素的濃度和暴露的時(shí)間長(zhǎng)度。因此，通常將作為暴露生物標(biāo)記物的糞便中煙曲霉毒素組成與作為效應(yīng)生物標(biāo)記物的Sa/So比例結(jié)合起來(lái)，用來(lái)評(píng)估煙曲霉毒素脫毒劑類(lèi)飼料添加劑的功效。

4 生物標(biāo)記方法在動(dòng)物試驗(yàn)中的應(yīng)用

霉菌毒素脫毒劑體內(nèi)功效的可靠研究需要精心設(shè)計(jì)動(dòng)物試驗(yàn)，包括1個(gè)飼喂基礎(chǔ)日糧的負(fù)對(duì)照組，1個(gè)被目標(biāo)霉菌毒素污染的正對(duì)照組以及1個(gè)或多個(gè)添加飼料添加劑的受霉菌毒素污染的試驗(yàn)組日糧。此外，每個(gè)處理組的動(dòng)物要足夠多，這樣才能消除動(dòng)物個(gè)體差異對(duì)霉菌毒素母體的代謝和降解造成的影響。

利用生物標(biāo)記物研究ZEN的酶解效應(yīng)的一個(gè)實(shí)例，是評(píng)估能在體外將ZEN轉(zhuǎn)化為水解玉米赤霉烯酮(Hydrolyzed Zearalenone，

HZEN)的內(nèi)酯水解酶的體內(nèi)功效(圖1)。試驗(yàn)豬采食含500 μg/kg ZEN的日糧(正對(duì)照)或添加了內(nèi)酯水解酶的相同日糧4 d，然后收集尿樣和糞樣。處理組動(dòng)物尿液中未檢出ZEN和ZEN-葡糖苷酸，再加上檢出HZEN、脫羧水解玉米赤霉烯酮(HZEN自發(fā)脫羧的產(chǎn)物)以及這些物質(zhì)的葡糖苷酸代謝物，這就證實(shí)了具有在豬胃腸道中把ZEN水解為HZEN的能力。糞便樣本分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的一些豬糞便含有微量的ZEN，但未檢測(cè)到任何葡糖醛酸化態(tài)物質(zhì)，從另一個(gè)方面證實(shí)了尿樣分析的結(jié)果。

與ZEN不同，煙曲霉毒素很難被豬的胃腸道吸收，這使得糞便中的煙曲霉毒素濃度最高，而血液和尿液中濃度較低。

另一個(gè)試驗(yàn)評(píng)估了之前在體外試驗(yàn)中顯示90%以上吸收率的兩種木質(zhì)纖維素吸附劑在豬體內(nèi)的功效。將尿液中ZEN代謝物的總摩爾濃度用作生物標(biāo)記物。由于日糧中ZEN的含量較低——僅150 μg/kg，ZEN-葡糖苷酸是尿液中唯一含量高于該檢測(cè)線的代謝產(chǎn)物。按肌酸酐含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，ZEN正對(duì)照組和兩個(gè)木質(zhì)纖維素吸附劑處理組的試驗(yàn)豬尿液中ZEN-葡糖苷酸濃度沒(méi)有顯著差異，表明木質(zhì)纖維素吸附劑在本試驗(yàn)中不能阻止玉米赤霉烯酮的吸收。

5 測(cè)定煙曲霉毒素酯酶效果的試驗(yàn)

最后，進(jìn)行了兩個(gè)豬飼養(yǎng)試驗(yàn)，以此研究煙曲霉毒素酶(以下稱(chēng)為飼料添加劑)效果和最適添加量；煙曲霉毒素酶是一種羧酸酯酶，旨在將FB1分解為毒性較小的水解衍生物（Hydrolyzed Fumonisin B1，HFB1)(圖1）。

在第一個(gè)試驗(yàn)中，每個(gè)處理6頭豬，試驗(yàn)日糧為：正對(duì)照日糧(日糧的FB1、FB2含量分別為5 mg/kg和1 mg/kg)、處理日糧(日糧相同但加入飼料添加劑)、或負(fù)對(duì)照日糧(未被污染的日糧)，試驗(yàn)為期5周。只采集血漿樣本，并且只檢測(cè)試驗(yàn)豬血清Sa/So比值。連續(xù)飼喂3周后，正對(duì)照組的試驗(yàn)豬血清Sa/So比值顯著增加。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正對(duì)照組的平均Sa/So比值從原來(lái)的0.12進(jìn)一步增加至0.85，然而負(fù)對(duì)照組和添加劑組則保持不變。

在第二個(gè)試驗(yàn)中，日糧FB1+FB2濃度增加到(30+9) mg/kg。試驗(yàn)豬分入1個(gè)日糧受煙曲霉毒素污染的正對(duì)照組、4個(gè)污染日糧及加有不同濃度添加劑的處理組以及1個(gè)日糧未被煙曲霉毒素污染的負(fù)對(duì)照組。本試驗(yàn)檢測(cè)了血清Sa/So比值、糞便和尿液的煙曲霉毒素濃度。僅一周后，正對(duì)照組的試驗(yàn)豬血清Sa/So比值從0.20顯著提高到0.92，而負(fù)對(duì)照組和含有添加劑的處理組試驗(yàn)豬都沒(méi)有顯著變化。通過(guò)分析糞便樣本證實(shí)，血清Sa/So比值的提高與飼料添加劑的濃度有著間接的相關(guān)性。隨著飼料添加劑濃度的增加，糞便中FB1和FB2的濃度逐漸降低，然而HFB1和HFB2的濃度卻逐漸增加。和預(yù)想的一樣，與糞便樣相比，尿液中煙曲霉毒素稍微偏向于非水解態(tài)，但是從尿液樣本中可明顯地發(fā)現(xiàn)，隨著添加劑添加量的增加，尿液中的FB1和FB2的濃度逐漸降低?！酢?/p>

原題名：Assessing mycotoxin detoxification methods in feed(英文)

原作者：Heidi Schwartz-Zimmermann[自然資源與生命科學(xué)大學(xué)(BOKU)，維也納]

S816

C

1001-0769(2016)11-0004-03

萬(wàn)建美，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所博士研究生，主要研究方向: 家禽營(yíng)養(yǎng)，E-mail: fumei_yi@163.com。

穆雅東，賈慧君，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物

營(yíng)養(yǎng)研究所碩士研究生，主要研究方向：家禽營(yíng)養(yǎng)。