MRI評價腎纖維化形態(tài)學變化的實驗研究

田小娟 邢 偉 陳 杰 張京剛 查婷婷 林英楠

腎纖維化是慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）終末期的常見結局[1]，也是腎移植失敗的最常見原因[2]。因此，早期診斷、治療纖維化對于減緩和逆轉(zhuǎn)慢性腎病的進程，改善腎臟功能，提高腎病患者的生活質(zhì)量具有重要意義。目前，多采用動物實驗的方法進行腎纖維化的相關研究，所用實驗動物包括大鼠、小鼠等[3-4]。兔腎較大，左腎位置低且表淺，較適合進行MRI掃描。本研究將探討腎纖維化兔模型的建立，以及采用MRI常規(guī)檢查T2WI評價梗阻側(cè)腎臟形態(tài)學變化，同時以病理學作為金標準探討不同時間段輸尿管梗阻發(fā)生的機制，為臨床提供客觀依據(jù)。

方法

1.實驗動物與分組

取健康新西蘭大白兔40只，雌雄不限，4～5月齡，體重2.4～2.7kg，完全隨機分為假手術組（n=8）和手術組（n=32）。手術組又以梗阻時間不同隨機分為2周、4周、6周及8周組，每組8只。所有兔均單籠放置，全價飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水。

2.動物模型的建立

手術組：3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)腹腔注射麻醉后，將實驗兔固定于手術臺上，左側(cè)臥位，術區(qū)剃毛、消毒，鋪無菌洞巾。行左側(cè)腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露腹腔，找到左側(cè)腎臟和輸尿管，用眼科鑷托起輸尿管上段部位并分離，分別在左側(cè)輸尿管近腎盂處用 4號絲線結扎兩處，兩處結扎間隔0.5cm，不離斷輸尿管。手術后將腎復原，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。

假手術組：不結扎輸尿管，其余步驟同手術組。

3.MRI設備及參數(shù)

采用 Siemens Verio 3.0T 磁共振掃描儀。所有實驗兔分別于建模前及建模后的2、4、6、8周行磁共振掃描，左側(cè)臥位，頭先進，6通道腹部線圈，范圍從左腎上極至左腎下極，中心線位于左腎門層面。掃描序列包括冠狀位、軸位T2WI。掃描參數(shù)：冠狀位T2WI：TR1400ms，TE93ms，層厚3.0mm，反轉(zhuǎn)角160°，F(xiàn)OV 154mm×219mm，分辨率126×256，層間距0.9mm，帶寬781 Hz/pixel；軸位T2WI：TR1000ms，TE 108ms，層厚4.0mm，反轉(zhuǎn)角138°，F(xiàn)OV130mm×130mm，分辨率179×256，層間距0.8mm，帶寬199 Hz/pixel。

4.圖像處理

正常腎臟在T2WI表現(xiàn)為內(nèi)髓高信號，外髓內(nèi)帶明顯低信號，外髓外帶稍高信號，皮質(zhì)稍低信號，各部位分界清楚，以外髓外帶為界以外為腎皮質(zhì)，以內(nèi)為外髓內(nèi)帶和內(nèi)髓。應用德國SiemenSyngo后處理站，在“viewing”界面打開軸位T2WI序列，由同1名高年資 MRI診斷醫(yī)師采用盲法閱片，對數(shù)據(jù)進行兩次測量取平均值。選取軸位T2WI腎門最大層面作為測量層面，按照腎皮質(zhì)、腎實質(zhì)走形手工繪制感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，在各ROI內(nèi)測量腎皮質(zhì)面積A1（cm2）、腎實質(zhì)面積A2（cm2）。

5.病理學檢查

掃描結束后采用耳緣靜脈注射空氣法處死實驗兔，立即取出雙腎，用37℃生理鹽水清洗后，觀察記錄腎臟大小、形態(tài)、顏色、積水程度等。于腎蒂層面正中橫剖腎臟，然后將標本置入10%的中性福爾馬林溶液中固定24h，行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片處理，并進行HE染色，光鏡觀察分析。

6.統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有計數(shù)資料以± s 表示。采用單因素方差分析比較假手術組和手術組腎臟各時間點A1值、A2值的差異，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. 腎臟各時間點T2WI圖像特點

假手術組各時間點和手術組建模前T2WI表現(xiàn)為腎臟體積正常，腎盂、腎盞無擴張，皮髓質(zhì)分界清楚。手術組建模后2周T2WI表現(xiàn)為梗阻側(cè)腎臟體積增大，腎盂及上段輸尿管擴張，腎實質(zhì)變薄，腎皮質(zhì)增厚；建模后4周T2WI表現(xiàn)為梗阻側(cè)腎臟腎盂明顯擴張，腎小盞擴張，腎實質(zhì)明顯變薄，腎皮質(zhì)較2周時變??；建模后6～8周T2WI表現(xiàn)為梗阻側(cè)腎臟腎盞明顯擴張并融合，腎實質(zhì)呈“殼”狀，腎皮質(zhì)明顯變薄（圖2）。

圖1 A1為腎皮質(zhì)面積，手術組于建模后2周時升高，4～8周時逐漸降低；假手術組無明顯變化。A2為腎實質(zhì)面積，手術組于建模后2～8周逐漸降低；假手術組無明顯變化。

2.腎臟各時間點A1值、A2值特點

假手術組各時間點的A1值、A2值差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。手術組各時間點A2值逐漸減小，A1值2周時升高，4～8周時逐漸降低，各時間點A1值、A2值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1，圖1）。

3.病理學檢查

圖2 A～D.分別為手術組建模后各時間點左腎T2WI圖像。A.建模后2周腎盂擴張積水，腎實質(zhì)變薄，腎皮質(zhì)增厚。B.建模后4周腎盂明顯擴張，腎實質(zhì)明顯變薄，腎皮質(zhì)較2周時變薄。C、D.建模后6～8周腎盞擴張并融合，腎實質(zhì)呈“殼”狀，腎皮質(zhì)明顯變薄。E～H.分別為手術組建模后各時間點左腎中心橫斷面圖。E.建模后2周左腎體積明顯增大，腎盂擴張。F～H.建模后4～8周腎盂腎盞明顯擴張，皮髓質(zhì)分界不清。I、L.分別為手術組建模后各時間點左腎腎皮質(zhì)病理學觀察（HE染色×200）； I.建模后2周腎皮質(zhì)增厚，J、K.建模后4～8周腎皮質(zhì)逐漸變薄。

表1 各組實驗兔建模前、后各時間點行MRI-T2WI掃描的A1值、A2值（ x± s ）

3.1 大體表現(xiàn)：假手術組和手術組建模前左腎體積正常，顏色鮮紅，腎臟剖面觀可見腎盂腎盞無明顯擴張，皮髓質(zhì)分界清楚。手術組建模后左側(cè)腎臟體積逐漸增大，呈蒼白色，梗阻以上輸尿管明顯擴張，腎臟剖面觀可見腎盂腎盞明顯擴張，皮髓質(zhì)分界不清，腎實質(zhì)面積逐漸減小（圖2）。

3.2 顯微鏡下表現(xiàn)：假手術組和手術組建模前左腎腎小球結構正常，腎小管管腔清晰，腎間質(zhì)無充血、水腫，無炎性細胞浸潤。手術組建模后2周左腎腎小球結構基本正常，腎小管明顯擴張，管腔增大伴上皮細胞腫脹；建模后4周腎小球腫脹，可見少量玻璃樣變性，腎小管部分萎縮，結構辨認不清；建模后6周腎小球明顯變性、壞死，腎小管萎縮加重、管腔內(nèi)可見條索狀纖維組織；建模后8周腎小球旁有條索狀纖維組織增生，腎小管幾乎萎縮消失，被纖維樣結構取代。建模后2周時，腎間質(zhì)增寬，炎癥細胞、成纖維細胞浸潤，后隨時間推移逐漸加重，纖維化逐漸形成。建模后2周時腎皮質(zhì)增厚，第4～8周逐漸變?。▓D2）。

討 論

腎纖維化是臨床上的常見病，是多種慢性腎臟疾病最終導致腎功能衰竭的主要病理改變和共同通路[5]。原發(fā)性腎小球疾病、慢性腎盂腎炎等疾病均可導致腎纖維化[6]。目前對于腎纖維化的診斷方法主要是腎活檢和腎功能血生化檢查。但腎活檢是有創(chuàng)性檢查，血生化檢查對于分腎功能以及腎纖維化的實際狀況評價價值有限，而MRI具有高軟組織對比、高分辨率、無創(chuàng)性等特點，可以清晰顯示輸尿管梗阻后腎臟形態(tài)學變化，如腎盂、腎盞、輸尿管的擴張等。因此本研究將T2WI用于腎纖維化的研究中，在不用對比劑的情況下評價腎纖維化的形態(tài)學變化。

腎纖維化模型制備方法有：單側(cè)輸尿管結扎（UUO）、腎切除動物模型、藥物誘導模型等。腎切除動物模型死亡率高，藥物誘導模型技術要求高，且對用此模型進行的相關研究的評價尚無統(tǒng)一標準[7]。目前UUO為較理想的實驗動物模型[8]。常用的腎纖維化動物模型多為大鼠和小鼠等，因鼠腎臟體積小，不利于MRI反復檢查，因此在本實驗中我們采用了新西蘭兔行左腎UUO模型法。

隨著輸尿管梗阻時間的延長，腎小球濾過率進行性降低，腎盂內(nèi)壓力持續(xù)上升[9]。本組實驗中腎實質(zhì)的面積隨著梗阻時間的延長逐漸減小，與單側(cè)輸尿管梗阻后腎盂內(nèi)壓力逐漸升高有關。其機理可分為兩方面：首先由于腎小管內(nèi)壓力升高，通過球-管反饋使腎內(nèi)縮血管物質(zhì)活性增強，導致腎組織缺血缺氧；其次由于縮血管物質(zhì)對出球微動脈的收縮作用強于入球微動脈，導致腎小球內(nèi)壓力升高，血液排入腎小管。以上兩方面原因?qū)е履I小球崩解，腎小囊萎縮變形，腎小管管腔閉合，最終導致整個腎單位的破壞、消失，因此隨著梗阻時間的延長，腎單位破壞逐漸增多，腎實質(zhì)萎縮逐漸加重[10]。同時國內(nèi)外研究表明單側(cè)輸尿管梗阻后對梗阻側(cè)腎臟的病理改變主要為腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)細胞凋亡導致的腎實質(zhì)萎縮和纖維化[11]，這與本實驗研究結果一致。

本實驗結果顯示，手術組建模后2周時腎皮質(zhì)增厚，主要因為該階段梗阻腎處于炎癥反應階段，病理上表現(xiàn)為腎小管擴張伴上皮細胞腫脹，腎間質(zhì)增寬、炎癥細胞浸潤。在該階段患者無不適癥狀，如規(guī)范治療，病情可完全逆轉(zhuǎn)。建模后4～8周時腎皮質(zhì)逐漸變薄，主要因為該階段梗阻腎處于纖維化形成階段，病理上表現(xiàn)為腎小球逐漸變性、壞死，腎小管管腔內(nèi)纖維組織增生，腎間質(zhì)內(nèi)纖維細胞增多、纖維化逐漸形成。在該階段患者腎功能受損，如持續(xù)規(guī)范治療，病情可出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，否則將最終導致腎功能衰竭。相關研究如韓文文等[12]觀測了犬輸尿管梗阻后1周，梗阻側(cè)腎小球結構基本正常，腎小管上皮細胞腫脹變性，腎間質(zhì)基本正常；梗阻后4周，腎小球出現(xiàn)少量萎縮、退化，腎小管明顯擴張，腎間質(zhì)內(nèi)炎癥細胞浸潤；梗阻后8周，腎小球上皮細胞內(nèi)纖維結締組織增生。以上研究表明輸尿管梗阻后腎臟經(jīng)歷炎性反應階段和纖維化形成階段，炎癥反應階段，腎皮質(zhì)增厚，后由于纖維化逐漸形成，腎皮質(zhì)逐漸變薄。

綜上所述，單側(cè)輸尿管梗阻可成功建立腎纖維化兔模型，T2WI能準確地反映單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化兔模型的形態(tài)學變化，為臨床觀察和診斷提供一種有效的影像學檢查方法。

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