劉慧琳，陳曉默，倪天鴻，王靜

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學，北京，100048）

食源性羧甲基賴氨酸的研究進展

劉慧琳，陳曉默，倪天鴻，王靜

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學，北京，100048）

羧甲基賴氨酸[Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML]是美拉德產(chǎn)物之一，研究較多的是其在體內(nèi)的積累與慢性疾病并發(fā)癥的相關(guān)性。對于食源性CML的報道較少，本文從食源性CML的性質(zhì)、來源、潛在危害，形成途徑及檢測方法進行闡述，提供一定的理論基礎(chǔ)。

羧甲基賴氨酸；晚期糖基化終產(chǎn)物；形成途徑；檢測方法

美拉德反應(yīng)是食品加熱過程產(chǎn)生風味最重要的途徑之一，是指氨基與羰基化合物縮合形成席夫堿，通過Amadori重排形成中間產(chǎn)物，進一步降解形成活性羰基，如乙醛酮，二羰基化合物，還原酮等，活性羰基與氨基組化合物反應(yīng)生成類黑精或晚期糖基化終產(chǎn)物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）有20多種，其中包括羧甲基賴氨酸[Nε-（Carboxymethyl）lysine，CML]，羧乙基賴氨酸、戊糖素、吡咯素、丙烯酰胺等[1]。有大量研究表明，AGEs對人體具有潛在的危害性，在糖尿病及其并發(fā)癥包括心血管疾病、白內(nèi)障、腎衰竭和視網(wǎng)膜病等患者的血液、病變組織和尿液中都含有微量的晚期糖基化終產(chǎn)物[2-5]。

CML是目前研究最多的晚期糖基化終產(chǎn)物之一，Sharanya Reddy等證明由于CML的電荷密度和側(cè)鏈極性，使它暴露在絕大多數(shù)AGEs的表面[6]，而成為一個易于識別的抗原表位，目前已經(jīng)制備出CML的特異性單克隆抗體，用于AGEs的定位研究。因此，了解CML對認識AGEs有著重要的意義，研究CML的形成理論及檢測方法為最終有效控制AGEs的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

1 食源性CM L的性質(zhì)和來源

CML的化學式為C8H16O4N2，摩爾質(zhì)量為204.22 g/mol，CML沒有顏色，沒有熒光特性，沒有交聯(lián)性，具有酸穩(wěn)定性[7]，許多細胞表面都有其受體，CML可以通過這些受體影響細胞的功能。CML的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 食源性CM L可能的形成途徑Fig.1 The possible forming ways for food borne CML

大部分食品在加工過程中都會產(chǎn)生CML，尤其是在熱加工過程中所涉及到的高蛋白高糖類高油脂食品。George L JHull等測定了257種不同西方常見食物中CML的含量，其中包括，奶制品，肉制品，餅干，米飯，湯，調(diào)味料，咖啡，水果和蔬菜等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奶制品中的CML的量最多，其含量會受溫度、糖種類的影響，最高含量可達到5143.7mg/kg蛋白[8]。Pei-chun Chao等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過醬油調(diào)味的肉制品中CML的含量要明顯高于未經(jīng)處理的肉制品，其中未加工的肉制品CML的含量為10μg/100 g～76μg/100 g樣品，而加入醬料后肉制品中CML的含量為1400μg/100 g～2926μg/100 g樣品[9]。Jialiang He等測定了常見東方食品（包括，餅干、面包和油條）中CML的含量，其中，面包皮比面包心的CML的含量高，餅干中CML的含量最高達到117.53μg/100 g樣品[10]。當食品原料中含蛋白質(zhì)，糖類，油脂時有利于CML的形成，主要是因為這些成分是形成CML的前體物質(zhì)。

2 食源性CM L的潛在危害

動物實驗和臨床實驗表明，食源性CML對人體健康具有潛在的危害性。研究表明CML在人體內(nèi)的積累和一些疾病，如心血管疾病，骨骼肌衰老和腎衰竭等的發(fā)病機理有關(guān)[11-14]。Yi-Chieh Li等探索了馬兜鈴酸腎病與甲基乙二醛（形成CML的中間產(chǎn)物）和CML積累的關(guān)系。通過連續(xù)5天向C3H/He小鼠體內(nèi)注射馬兜鈴酸（10mg/kg）成功建立了馬兜鈴酸腎病小鼠模型。結(jié)果表明，腎臟勻漿中的甲基乙二醛的濃度比對照組高出了12倍（p＜0.01），通過免疫化學分析發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟小管中存在CML。而且與對照組相比，谷胱甘肽水平降低了0.32倍，體內(nèi)腎臟的抗氧化能力降低了0.54倍，說明馬兜鈴酸導致的腎損傷與甲基乙二醛和CML的增加和積累有關(guān)，在CML的形成過程中伴有自由基的生成，導致谷胱甘肽的氧化和腎臟抗氧化能力的降低[15]。

Wautier M P等探索了血清中AGEs的水平和CML含量的增加與Ⅱ型糖尿病并發(fā)癥的相關(guān)性。通過免疫分析法測量了患有Ⅱ型糖尿病且患病年限為（11±8）年，年齡在58±6.1之間的51名男性和26名女性，和沒有患有糖尿病的年齡在55.5±7.5之間的39名男性和21名女性的血清中AGEs的水平和CML的含量。結(jié)果表明Ⅱ型糖尿病人的血清中AGEs的水平和CML的含量明顯高于對照組（P＜0.000 1），表明CML的含量與Ⅱ型糖尿病血管并發(fā)癥有關(guān)[16]。

Casper G Schalkwijk等報道了CML與糖尿病并發(fā)癥心臟衰竭疾病的相關(guān)性，研究結(jié)果表明，高血糖癥會導致CML的增加，實驗組心臟組織中的CML的量是對照組中CML量的六倍，CML加合物大量存在于糖尿病患者的心肌內(nèi)的小動脈，糖尿病患者體內(nèi)的CML在心臟的積累可能導致心臟衰竭的風險增加[17]。

Katarina ?ebeková等分析了34個母乳喂養(yǎng)和25個配方奶粉喂養(yǎng)的6個月大的嬰兒中的血漿和尿液中CML的含量以及56種母乳和16種配方奶粉中CML的含量。結(jié)果表明，配方奶粉中的CML的含量高于母乳（28倍～389倍），特別是水解后的配方奶粉中CML的含量高于不水解的奶粉，配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒血漿中CML的水平高出母乳喂養(yǎng)嬰兒的46%，尿液中CML的排出量高于母乳喂養(yǎng)嬰兒的60倍，實驗證明來自配方乳中的食源性CML會隨食物參與到人體的吸收并進入血液循環(huán)系統(tǒng)[18]。

3 食源性CM L的形成理論

關(guān)于CML的形成路徑研究較多，通過整理和總結(jié)，食源性CML的形成途徑主要有以下五種，如圖1所示。

1）Hodge路徑：還原糖和氨基化合物（賴氨酸以及賴氨酸殘基）形成席夫堿，席夫堿重排形成Amadori產(chǎn)物，最后Amadori產(chǎn)物裂解產(chǎn)生CML[19]。

2）Namiki路徑：席夫堿裂解產(chǎn)生乙二醛（glyoxal，GO），GO與氨基化合物反應(yīng)形成CML[20]。

3）Fu路徑：脂質(zhì)氧化生成GO，GO與氨基化合物反應(yīng)形成CML[21]。

4）Wolf路徑：葡萄糖氧化生成GO，再和氨基化合物反應(yīng)形成CML[22]。

5）Dunn路徑：抗壞血酸和氨基化合物形成席夫堿，席夫堿重排形成Amadori產(chǎn)物，最后Amadori產(chǎn)物裂解產(chǎn)生CML[23]。

從反應(yīng)的底物來看，食源性CML來自三個方面，一方面來自AGEs—原料為糖和蛋白，另一方面為晚期脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物（Advanced lipid end products，ALES）—原料為油脂和蛋白，以及抗壞血酸途徑—原料為抗壞血酸和蛋白。蛋白和還原糖形成席夫堿重排形成ARPs（Amadori products）和HRPs（Heyns products），當還原糖為多羥基醛時重排形成ARPs，當還原糖為多羥基酮時重排形成HRPs，Chou Srey等發(fā)現(xiàn)，HRPS可能比ARPs產(chǎn)生更多的CML[24]。席夫堿可以裂解形成GO，還原糖和脂質(zhì)也可以氧化裂解形成GO，其中GO和ARPs是CML的直接中間產(chǎn)物。付全意[25]等利用同位素標記技術(shù)和多級動力學模型證明了這一觀點，ARPs的活化能Ea低于GO，因此ARPs更易轉(zhuǎn)化為CML。另外，選擇抗壞血酸和賴氨酸為原料時，Amadori產(chǎn)物為蘇阿糖賴氨酸[23]。韓立鵬等研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)可以氧化生成GO進而促進CML的形成，然而脂質(zhì)也可以通過促使反應(yīng)體系產(chǎn)生更多的·OH從而促進CML的生成[26]。

4 食源性CM L的檢測方法

食源性CML的檢測方法分為免疫法、儀器分析法和熒光傳感檢測法。免疫法主要是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）；儀器分析法包括：液相-熒光檢測法（high performance chromatography-fluorescence，HPLC-fluorescence）、氣相-質(zhì)譜檢測法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）、超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）等；熒光傳感檢測法是基于熒光納米材料開發(fā)的一系列快速傳感檢測方法，通常使用的熒光納米材料是指半導體量子點。

4.1 酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA法主要是利用抗原與抗體之間的特異性共價結(jié)合對抗原或者抗體進行定量的一種分析方法，Teresia Goldberg等利用CML的單克隆抗體（4G9）對250種食物中CML的含量進行了測定，結(jié)果表明，脂肪組的食物中CML的含量最高為（100±19）kU/g蛋白，其中食品CML的含量用kU/g蛋白或者kU/mL蛋白來表示[27]。Ralf Dittrich等也利用ELISA法測定了32位健康母親的血清和母乳中CML的含量，結(jié)果表明，CML可以通過血清轉(zhuǎn)移到母乳，其中CML的含量用ng/mL蛋白表示[28]。ELISA法操作簡單，特異性強，結(jié)果易于觀察，但是由于食品基質(zhì)化學成分復雜，會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，降低了準確性，所以對于食源性CML的檢測一般采用儀器法檢測。

4.2 高效液相色譜熒光檢測法

CML沒有熒光特性，直接用HPLC-熒光法無法檢測，但是如果將CML進行柱前衍生使其生成熒光物質(zhì)，再根據(jù)后生物的量就可以確定CML的量，S.Drusch等用HPLC-fluorescence測定了不同牛奶和奶酪樣品中CML的含量，將樣品進行硼氫化鈉還原后再進行酸水解之后，用鄰苯二胺（OPA）進行柱前衍生后上樣檢測，該方法的檢測限（LOD）是0.5 pmol，定量限（LOQ）為1.1 pmol，該方法的重現(xiàn)性為2.81%，有較高的靈敏度[29]。Pei-chun Chao等也用了HPLC-fluorescence法對醬制品以及醬制品處理的食物中CML的含量進行測定，結(jié)果表明，加入醬制品的食物中CML的含量會顯著升高[9]。HPLC-fluorescence法重現(xiàn)性好，但是必須進行柱前衍生，操作繁瑣，無法實現(xiàn)CML的即時定量。

4.3 氣相-質(zhì)譜檢測法

Jing Wang等利用GC-MS法測定了大菱鲆肌肉中CML的含量，首先對樣品進行前處理包括脫脂、還原、水解、凈化然后進行雙衍生，分別對羧基和氨基進行酯化和?；x擇SIM（選擇離子監(jiān)測）模式對CML進行定量，結(jié)果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面積與濃度在1μg/L～200μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，方法檢出限為1mg/kg，定量限為5mg/kg，與酶聯(lián)免疫方法相比，GC-MS法避免了酶聯(lián)免疫法的假陽性，能夠更加準確地對魚類肌肉中的CML進行定性和定量分析，靈敏度更高，檢測結(jié)果易與其它方法進行比較，是檢測大菱鲆肌肉中CML含量的較好方法[30]。

4.4 液相-質(zhì)譜檢測法

質(zhì)譜法選用多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，對食品中的CML進行定性定量，Jialiang He等利用LC-MS/MS的方法測定了不同谷物食品中CML的含量，得到CML的定量限為4 ng/g，能夠有效的檢測出較低含量的食源性CML，而且不需要復雜的衍生化過程即可檢測，保證了樣品中CML含量檢測的即時性[10]。孫曉華等利用UPLC-MS/MS測定了不同品種和來源的油條中CML的含量，選用電噴霧正離子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，儀器檢出限為1μg/L，定量限為3μg/L。應(yīng)用該方法測得15種不同來源的油條中CML含量為（69.3±8.2）mg/kg蛋白～（182.2±3.1）mg/kg蛋白（5.3± 0.5）mg/kg樣品～（15.4±0.3）mg/kg樣品。本方法操作簡便、快速、靈敏度高、精密度好，為進一步研究食品中CML的產(chǎn)生機理提供了有效的檢測方法[31]。

4.5 熒光傳感檢測法

基于半導體納米材料——量子點所建立的CML熒光傳感體系，是近年來所開發(fā)的簡單、快速、靈敏的檢測方法。Huilin Liu等以量子點為熒光核心，建立了CML分子印跡聚合物，以3-氨丙基-3-乙氧基硅烷為功能單體，四乙氧基硅烷為交聯(lián)劑，檢測了面包、牛奶及嬰幼兒配方奶粉中CML的含量。該方法線性范圍為5μg/L～400μg/L，檢出限為2.6μg/L。在此基礎(chǔ)上，為了提高CML的傳感吸附時間，該課題組將超薄且比表面積較大的納米材料石墨烯材料引入到CML熒光印跡傳感體系中，該研究表明，石墨烯敏化的熒光印跡傳感體系具有較好的吸附效果。該方法前處理簡單，不需要復雜的除雜質(zhì)過程，僅需將牛奶、奶粉等樣品用水稀釋，且可以同時檢測96個樣品，檢測快速，可以彌補儀器檢測方法的不足。但這種熒光傳感檢測方法的檢出限略高，對于實際樣品中痕量CML殘留的檢測能力還有待進一步提升[32]。

4 結(jié)論

食品加工過程中產(chǎn)生的化學危害物，通常是食品產(chǎn)業(yè)中長期存在的重大安全隱患，與人類多種慢性疾病和癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，是全人類需要解決的共性問題。AGEs是食品加工過程中產(chǎn)生的一類有害物質(zhì)，不僅降低了食品的營養(yǎng)價值而且與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)聯(lián)，CML是AGEs中從化學和生物學角度研究的最徹底的一種產(chǎn)物，本論文總結(jié)了食源性CML的基本性質(zhì)，主要來源，存在的危害，可以有效的從來源上減少CML的攝入，關(guān)于食源性CML形成機理目前尚不明確，需要更進一步的研究和模擬實驗，而且不同的檢測方法的檢測結(jié)果和檢測限會有所差異，需要確定一種有效的統(tǒng)一檢測標準，從而才能準確的比較不同食品中CML的含量，有效控制食源性CML的攝入量。

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Research Progress of Food-borne Nε-（Carboxymethyl）lysine

LIU Hui-lin，CHEN Xiao-mo，NI Tian-hong，WANG Jing
（Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology&Business University，Beijing 100048，China）

Nε-（Carboxymethyl）lysine（CML）is one of the most widely studied Maillard reaction products. There is a lot of research on the relationship between CML accumulation and many chronic diseases in vivo.But the report on food borne CML is less.In this paper，the nature and origin，the potential harm to the humans，the ways of formation，and the detection methods of the food borne CML were systematically expounded.It is a theoretical basis for the CML formation and control.

Nε-（Carboxymethyl）lysine；advanced glycation end products；formation pathways；detection methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.050

2016-10-21

劉慧琳（1987—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品安全。