紅棗核總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究

范艷麗，張博，李梓溢，仝瑤，張航，翟剛

（寧夏大學(xué)，寧夏銀川750021）

紅棗核總黃酮的提取工藝及抗氧化活性研究

范艷麗，張博，李梓溢，仝瑤，張航，翟剛

（寧夏大學(xué)，寧夏銀川750021）

采用Box-Behnken Design（BBD）開展響應(yīng)面試驗，研究料液比、乙醇濃度、浸提溫度、浸提時間和提取級數(shù)五因素及其互作效應(yīng)對紅棗核總黃酮提取率的影響，確定紅棗核總黃酮的最佳提取工藝條件為：料液比1∶70（g/mL），乙醇濃度40%，浸提溫度80℃，浸提時間4 h，提取級數(shù)3次，在此條件下黃酮提取率為16.64 mg/g。此外，以BHT和VC為陽性對照評價了提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明在一定濃度范圍內(nèi)紅棗核總黃酮對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、亞硝基離子自由基、ABTS自由基的最高清除率分別達(dá)到53%、85%、71%、68%、91%，總還原能力分別為BHT和VC的35%和36%，表明所提取的紅棗核黃酮具有較強的體外抗氧化活性。

紅棗核；黃酮；提??；抗氧化

紅棗又稱華棗、大棗，是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的果實，原產(chǎn)于我國，在日本和韓國也有少量種植，主要分布在北緯23°～42.5°，東經(jīng)76°～124°之間的廣大區(qū)域[1]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明，紅棗中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、脂肪、氨基酸等營養(yǎng)成分以及鐵、鋅、磷、鈣、硒等微量元素，還有多種維生素如VC、VP、VA、VB1、VB2等[2-3]。隨著人們對紅棗成分及其營養(yǎng)功效的深入研究，發(fā)現(xiàn)紅棗還含有一些具有顯著生理活性的特殊生物成分，包括紅棗多糖、黃酮、三萜類化合物、腺苷、生物堿和甾醇等[4]。不僅如此，研究表明棗核中同樣含有大量的多酚和黃酮類物質(zhì)，且具有良好的DPPH自由基清除能力[3]和有效抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及透明質(zhì)酸酶的活性[5-6]。目前，棗核作為紅棗加工及食用后的下腳料絕大多數(shù)以廢物的形式丟棄或作為燃料被燃燒掉，未能實現(xiàn)更高附加值的資源利用。本研究以棗核為研究對象，采用乙醇提取法制備總黃酮類化合物，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化工藝參數(shù)，并對其進行體外抗氧化活性研究，以此篩選具有較強抗氧化能力的天然抗氧化劑，提高紅棗核利用價值，為紅棗核的開發(fā)利用提供思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紅棗核：由寧夏盛康源紅棗酒業(yè)生物科技有限公司提供；蘆丁、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚、氯化亞鐵、氯化鉀、過二硫酸鉀，均為分析純試劑。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DL-5-A型臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；JDG-0.2型真空凍干試驗機：蘭州科近凍干技術(shù)有限公司；7230G可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紅棗核總黃酮的提取工藝研究

棗核清洗后，50℃真空干燥，粉碎過40目篩，避光貯存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取3.00 g棗核粉，以一定料液比加入乙醇溶液中，用膜封口，水浴攪拌浸提一定時間，離心取提取液，測定黃酮提取率。

1.2.1.1 響應(yīng)面試驗

選取5個單因素，分別為料液比、乙醇濃度、浸提溫度、浸提時間和提取級數(shù)，研究各單因素對黃酮提取率的影響，并確定各因素的適宜條件。根據(jù)各單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken Design（BBD）開展響應(yīng)面試驗，研究具有顯著影響的因素之間的交互作用，擬合出多元二次回歸模型并進行方差分析，最終確定紅棗核總黃酮的最佳提取工藝條件。

1.2.1.2 黃酮提取率的測定方法

參照徐紅艷等報道的方法[7]，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品，測定提取物總黃酮含量，按照公式（1）計算提取率（mg/g）。

1.2.2.2 清除羥基自由基的活性測定[9]

取5支比色管加入1mL，0.15mg/mL的鄰二氮菲溶液和2mL pH7.4的PBS緩沖溶液，混勻，之后加入0.2mg/mL的FeSO4溶液1mL搖勻。分別加入0.2mg/mL樣品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，混勻。同時做受損傷管和空白參照管。于37℃的水浴中恒溫1 h，并在波長536 nm測定受損傷管（A1）、空白參照管（A2）、樣品管（A3）和樣品參照管（A4）的吸光度值，以VC和BHT作陽性對照，計算清除率SR（%）。

1.2.2 紅棗核總黃酮的抗氧化活性研究

1.2.2.1 清除超氧陰離子自由基的活性測定[8]

取0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液（pH8.2）5mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min后，分別加入1mL不同濃度的試樣溶液，混勻后加入25℃預(yù)熱的3mmol/L鄰苯三酚溶液0.5mL，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8mmol/L鹽酸1mL終止反應(yīng)，在299 nm處測定溶液的吸光度Ai，同時測定空白對照組吸光度A0。以0.5mL的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，在299 nm處測得的吸光度為Aj，以VC和BHT為對照。由公式（2）計算清除率SR（%）。

1.2.2.3 清除DPPH自由基的活性測定[10]

準(zhǔn)確稱取DPPH 0.008 0 g，用無水乙醇定容于100mL的容量瓶，配制成2.0×10-4mol/L的溶液。量取2mL樣品溶液分別放于10mL比色管，加入2mL無水乙醇溶液混勻，避光靜置60min，在波長517 nm處測定其吸光度，其值記為Aj，再分別量取樣品溶液和DPPH溶液各2mL置于比色管，振蕩混勻避光靜置60min，在波長517 nm處測定其吸光度，其值記為Ai；然后再量取無水乙醇溶液和DPPH溶液各2mL置于比色管，混勻避光靜置60min，在波長517 nm處測定其吸光度，其值記為A0，以VC、BHT作陽性對照。由公式（3）計算得出其清除率SR（%）。

1.2.2.4 清除亞硝基離子的活性測定[11]

將0.2mg/mL的樣品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL分別加入比色管中，分別加入5μg/mLNaNO2溶液1mL，置于37℃水浴鍋中恒溫30min，加入0.4%對氨基苯磺酸1mL，充分混勻后靜置5min，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺0.5mL，混合均勻后加70%乙醇定容，靜置15min，在540 nm處測定各樣品管吸光度記為A1，以蒸餾水做空白測定吸光度值記為A0，同時以VC和BHT為陽性對照。由公式（4）計算得出清除率SR（%）。

1.2.2.5 清除ABTS自由基的活性測定[12]

將ABTS用蒸餾水配制成濃度為7mmol/L的溶液，然后與等體積的濃度為2.45mmol/L過硫酸鉀溶液混合均勻后，避光、4℃條件下放置12 h～16 h。用蒸餾水稀釋ABTS溶液使其在734 nm下的吸光值在0.7± 0.02之間，取ABTS溶液（吸光度在0.7±0.02內(nèi)）3.9mL加入到不同濃度的0.1mL樣品溶液中，搖勻，在室溫下放置6min，于734 nm波長處測定吸光度。用蒸餾水代替產(chǎn)物作為空白對照，同時以VC和BHT為陽性對照。由公式（5）計算得出其清除率SR（%）。式中：A0為空白管的吸光值；A1為產(chǎn)物吸光值。

1.2.2.6 總還原能力的測定[13]

分別量取1mL不同濃度的樣品溶液置于比色管中，分別加入0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 6.6）2.5mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5mL，充分混勻后將試管放于50℃水浴中恒溫20min，再向其中分別加入10%三氯醋酸溶液2.5mL，3 000 r/min離心10min。分別取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.5mL和0.1%FeCl3溶液1mL，振蕩混勻靜置10min，于波長700 nm處測定其吸光度，由吸光度的大小來判斷還原能力的強弱，吸光度越高，還原能力越強。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化紅棗核總黃酮提取工藝

2.1.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用料液比1∶70（g/mL）、提取級數(shù)3次，以乙醇濃度（X1）、浸提時間（X2）、浸提溫度（X3）3個因素作為自變量，黃酮的提取率作為響應(yīng)值（Y）。根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）試驗設(shè)計原理制定因素水平表（見表1）。

采用Design Expertv8.0.7.0軟件進行三因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）試驗設(shè)計。整個試驗設(shè)計在中心點處共有17組試驗，試驗隨機完成，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table1 Variables and levels in the response surface design

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Response surface Box-Behnken design arrangement and experimental results

2.1.2 二次多元回歸模型的建立與方差分析

響應(yīng)面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Table3 Variances analysis and significance test for the created regression model

續(xù)表3響應(yīng)面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Continue table3 Variances analysis and significance test for the created regression model

分別對X1、X2、X3各因素和響應(yīng)值Y進行回歸擬合，得到黃酮提取率（Y）的二次多元回歸方程如下：

由表3方差分析可知，提取率回歸模型P=0.020 2＜0.05表明模型是顯著的，一次項X2（浸提時間）=0.033 0＜0.05有顯著影響，二次項X3（浸提溫度）=0.000 6＜0.01有高度顯著影響，交互項對回歸模型影響不顯著，回歸模型失擬項P=0.193 1＞0.05不顯著，說明該回歸模型能夠很好的擬合試驗結(jié)果。此外，影響紅棗核總黃酮提取率的各因素按照影響大小排序依次為X2（浸提時間）＞X3（浸提溫度）＞X1（乙醇濃度）。

2.1.3 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

圖1～圖3分別為乙醇濃度、浸提溫度、浸提時間三因素交互作用對紅棗核總黃酮提取率的響應(yīng)曲面圖。

圖1 乙醇濃度與浸提溫度對紅棗核總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface reflecting the interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of total flavonoids from Chinese jujube seeds

圖2 乙醇濃度與浸提時間對紅棗核總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface reflecting the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on the yield of total flavonoids from Chinese jujube seeds

圖3 浸提溫度與浸提時間對紅棗核總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface reflecting the interactive effects of extraction temperature and extraction time on the yield of total flavonoids in Chinese jujube seed

當(dāng)浸提時間一定時，乙醇濃度與浸提溫度對紅棗核總黃酮提取率的交互影響如圖1所示?？梢钥闯?，當(dāng)乙醇濃度一定時，隨著浸提溫度的增加，紅棗核黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)浸提溫度低于80℃時，黃酮提取率隨著乙醇濃度的增大而增大；當(dāng)浸提溫度大于80℃時，黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而增大。而當(dāng)浸提溫度一定時，黃酮提取率隨乙醇濃度變化范圍不大。

當(dāng)浸提溫度一定時，乙醇濃度與浸提時間對紅棗核總黃酮提取率的交互影響如圖2所示?？梢钥闯觯?dāng)乙醇濃度一定時，隨著浸提時間的增加，黃酮提取率顯著增加；當(dāng)浸提時間一定時，黃酮提取率隨著乙醇濃度的增大僅有小幅變化，表明延長浸提時間，能夠有效提高紅棗核黃酮提取率。

當(dāng)乙醇濃度一定時，浸提溫度與浸提時間對紅棗核總黃酮提取率的交互影響如圖3所示。可以看出，當(dāng)浸提溫度一定時，隨著浸提時間的增加，紅棗核總黃酮提取率呈現(xiàn)上升趨勢，尤其在80℃附近顯著增加；當(dāng)浸提時間一定時，黃酮得率隨浸提溫度的升高先增加后降低。因此表明，一定程度上增加浸提時間并控制浸提溫度于80℃，能夠提高黃酮提取率。

2.1.4 最佳工藝參數(shù)的確定與模型驗證

通過紅棗核總黃酮提取率的二次多項數(shù)學(xué)模型，由軟件分析得到紅棗核總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度40.74%，浸提溫度為79.52℃，浸提時間3.54 h，黃酮理論提取率為16.550 2mg/g，95%置信區(qū)間為13.662 4mg/g～19.437 9mg/g?？紤]到實際操作問題，最終確定紅棗核總黃酮提取工藝條件為：乙醇濃度40%，浸提溫度80℃，浸提時間4 h。以此參數(shù)進行3組平行驗證試驗，測得黃酮提取率為16.64mg/g，與理論值基本一致，說明方程與實際情況擬合較好，所建模型適用于提取紅棗核黃酮的工藝條件。

2.2 紅棗核總黃酮的抗氧化活性評價

2.2.1 對超氧陰離子自由基的清除作用

紅棗核總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用見圖4。

圖4 紅棗核總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of total flavonoids from Chinese jujube seed on superoxide anion

試驗結(jié)果顯示，當(dāng)樣品濃度小于0.4mg/mL時，紅棗核總黃酮對超氧陰離子自由基的清除效果優(yōu)于BHT和VC。當(dāng)樣品濃度大于0.4mg/mL時，紅棗核黃酮和BHT對超氧陰離子自由基的清除率都趨于穩(wěn)定，而VC的清除率明顯增加。紅棗核黃酮對超氧陰離子自由基的最大清除率達(dá)53%。

2.2.2 對羥基自由基的清除作用

紅棗核總黃酮對羥基自由基的清除作用見圖5。

如圖5所示，紅棗核黃酮、VC和BHT對羥基自由基均具有顯著的清除作用，但紅棗核黃酮的清除作用較VC和BHT略低，但最大清除率仍達(dá)到85%。

2.2.3 對DPPH自由基的清除作用

紅棗核總黃酮對DPPH自由基的清除作用見圖6。

如圖6所示，在試驗濃度范圍內(nèi)，紅棗核黃酮對DPPH自由基的清除效果低于VC，但隨濃度的增加，紅棗核黃酮的清除效果趨近BHT的清除效果，對DPPH自由基的最大清除率達(dá)71%，表明紅棗核黃酮對DPPH自由基具有明顯的清除效果。

圖5 紅棗核總黃酮對羥基自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of total flavonoids from Chinese jujube seed on·OH

圖6 紅棗核總黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of total flavonoids from Chinese Jujube seed on DPPH radical

2.2.4 對亞硝基離子的清除作用

紅棗核總黃酮對亞硝基離子的清除作用結(jié)果見圖7。

圖7 紅棗核總黃酮對亞硝基離子的清除作用Fig.7 Scavenging effect of total flavonoids from Chinese jujube seed on nitrite ion

試驗表明（如圖7），在試驗濃度范圍內(nèi)BHT對亞硝基離子的清除率較低，紅棗核黃酮和VC對亞硝基離子具有顯著的清除效果。其中，VC對亞硝基離子的清除效果優(yōu)于紅棗核黃酮，紅棗核黃酮對亞硝基離子的最大清除率為68%。

2.2.5 對ABTS自由基的清除作用

紅棗核總黃酮對ABTS自由基的清除作用見圖8。

圖8 紅棗核總黃酮對ABTS自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of total flavonoids from Chinese jujube seed on ABTS radical

研究發(fā)現(xiàn)（如圖8），紅棗核黃酮、VC和BHT對ABTS自由基均具有顯著的清除作用。在試驗濃度內(nèi)，VC和BHT對ABTS自由基的清除效果優(yōu)于紅棗核黃酮，但紅棗核黃酮對ABTS自由基的清除率隨濃度的增加顯著增高。在0.5mg/mL時，紅棗核黃酮對ABTS自由基的清除率趨近于VC和BHT，達(dá)最大清除率91%。2.2.6紅棗核總黃酮的總還原能力

紅棗核總黃酮的總還原能力試驗結(jié)果見圖9。

圖9 紅棗核總黃酮的總還原能力Fig.9 Ferric reducing ability of total flavonoids from Chinese jujube seed

如圖9所示，紅棗核黃酮在試驗濃度范圍內(nèi)和VC、BHT一樣隨濃度的升高，總還原能力增強，但始終低于VC和BHT的總還原能力。當(dāng)紅棗核黃酮濃度達(dá)0.3mg/mL時，其總還原能力趨于穩(wěn)定，其總還原能力最大達(dá)到BHT的35%，VC的36%。

3 結(jié)論

1）以提取率（Y）為指標(biāo)，采用BBD試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法得出紅棗核黃酮提取工藝參數(shù)的回歸方程為：Y=16.05+0.097X1+1.05X2+0.38X3+0.017X1X2-0.62X1X3-0.11X2X3-0.78X12-0.16X22-3.18X32

對該模型進行方差和顯著性分析，最終得到最優(yōu)提取條件為：料液比1∶70（g/mL），乙醇濃度40%，浸提溫度80℃，浸提時間4 h，提取級數(shù)3次。在此工藝條件下黃酮提取率為16.64mg/g。

2）在一定濃度范圍內(nèi)紅棗核總黃酮對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、亞硝基離子自由基、ABTS自由基的最高清除率分別達(dá)到53%、85%、71%、68%、91%，總還原能力分別是BHT和VC的35%和36%，表明紅棗核總黃酮提取物具有較強的體外抗氧化能力。

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Study on Extraction Process and Anti-oxidative Activity of Total Flavonoids from Chinese Jujube Seeds

FAN Yan-li，ZHANG Bo，LI Zi-yi，TONG Yao，ZHANG Hang，ZHAI Gang
（Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

The extraction effects of solid to liquid ratio，ethanol concentration，extraction temperature，extraction time，extraction times and their interaction on total flavonoids from Chinese jujube seeds were studied using response surface methodology by Box-Behnken Design（BBD）.The optimum extracting condition of total flavonoids was ascertained as solid to liquid ratio1∶70（g/mL），ethanol concentration 40%，extraction temperature 80℃，extraction time 4 h and 3 times，and the extraction rate of total flavonoids on this condition was 16.64mg/g.Moreover，the antioxidant activity of the product was evaluated taking VCand BHT as positive controls.The results showed that the optimum scavenging rate of the product on oxygen free radical，hydroxyl radicals，DPPH free radicals，nitroso ion and ABTS radicals was 53%，85%，71%，68%and 91%respectively，and the total reductive ability was 35% of BHT and 36%of VC，revealing the significant antioxidant activity of the extracted flavonoids from Chinese jujube seeds in vitro.

Chinese jujube seeds；flavonoids；extraction；anti-oxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.021

2016-05-14

寧夏大學(xué)科學(xué)研究基金項目（ZR1437）

范艷麗（1980—），女（漢），副教授，博士，研究方向：生物資源利用與開發(fā)。