正交設(shè)計(jì)優(yōu)化平菇下腳料中麥角硫因的提取工藝

薛天凱，趙艷敏，林紀(jì)偉，劉岱琳，劉成航

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.武警后勤學(xué)院，天津300309；3.天津市河西區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，天津300211；4.天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，天津300457）

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化平菇下腳料中麥角硫因的提取工藝

薛天凱1，2，趙艷敏1，2，林紀(jì)偉3，劉岱琳2，*，劉成航4

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.武警后勤學(xué)院，天津300309；3.天津市河西區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，天津300211；4.天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，天津300457）

利用正交試驗(yàn)優(yōu)化平菇下腳料中麥角硫因的回流提取工藝。通過高效液相色譜法，Kromasil 100-5NH2柱（250mm× 4.60mm，5μm），流動(dòng)相乙腈-5mmol/L醋酸銨（80∶20，體積比），254nm下進(jìn)行檢測，建立麥角硫因的含量測定方法，以平菇下腳料中麥角硫因的含量及得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)方法L9（34）考察提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比對(duì)麥角硫因提取效果的影響。結(jié)果表明平菇下腳料中麥角硫因的最佳提取工藝條件為：提取溶劑10%乙醇，料液比1∶6（g/mL），提取時(shí)間為2h，提取2次。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，麥角硫因的總提取率可達(dá)87.45%，含量可達(dá)0.5%。

平菇下腳料；麥角硫因；正交試驗(yàn)；提取工藝

麥角硫因（巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽，ergothioneine，EGT）是1909年首次在麥角菌（Claviceps purpurea）中發(fā)現(xiàn)的一種天然稀有的手性氨基酸[1]。這種氨基酸是人體自身不能合成的，只能通過其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCTN1從飲食中攝取，且在特定的人體組織和細(xì)胞中富集。麥角硫因被認(rèn)為是一種與細(xì)胞質(zhì)醇及谷胱甘肽類似的天然的細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化性，能夠維持人體紅細(xì)胞的功能并在保護(hù)其免受氧化損傷方面起著重要作用[2]，此外還具有防止紫外線輻射損傷[3-4]等多種生物活性，因此在化妝品、功能食品和膳食補(bǔ)充劑等方面呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景而備受學(xué)者的關(guān)注。麥角硫因這種天然稀有氨基酸在大多數(shù)生物體中含量都較低，我們課題組前期對(duì)來自全國各地的二十余種蘑菇菌種中麥角硫因的含量進(jìn)行了調(diào)查[5-6]，其中榛蘑的菌傘中含量最高，可以達(dá)到0.2%，此外金針菇、雞腿菇、白玉菇、口蘑和平菇的含量都大于0.02%；但是這些蘑菇的價(jià)格高，麥角硫因的含量也較低，如果選取其作為原料進(jìn)行天然麥角硫因的提取，成本過高，將限制麥角硫因產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和未來的應(yīng)用。

目前我國已經(jīng)成為世界食用菌生產(chǎn)第一大國，栽培面積大，總產(chǎn)量高[7-8]。天津地區(qū)近年來也加大蘑菇種植產(chǎn)業(yè)的扶植力度，在西青區(qū)和薊縣地區(qū)已經(jīng)形成了蘑菇種植產(chǎn)業(yè)主要集中區(qū)，并建成了多個(gè)大型的食用菌的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化示范園區(qū)，生產(chǎn)雙孢菇、金針菇、平菇和白靈菇等多個(gè)品種，目前每個(gè)蘑菇種植基地都可以達(dá)到年產(chǎn)鮮菇上萬噸，有的地區(qū)單品年產(chǎn)值已經(jīng)突破億元。在蘑菇產(chǎn)品的采收加工過程中會(huì)有大批量的下腳料產(chǎn)生，這也是可以進(jìn)行充分利用的蘑菇資源?；谫Y源循環(huán)利用的原則，我們選取了產(chǎn)量較大，蘑菇子實(shí)體大，下腳料相對(duì)較多且麥角硫因含量適中的平菇下腳料作為原料，利用單因素考察和正交試驗(yàn)相結(jié)合，優(yōu)化平菇下腳料中麥角硫因的提取工藝，降低生產(chǎn)成本，顯著提高生產(chǎn)效率，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)天然的麥角硫因提取物提供數(shù)據(jù)支撐，研究結(jié)果也將促進(jìn)平菇下腳料的綜合開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平菇下腳料：購自天津市趙沽里農(nóng)貿(mào)市場，樣品標(biāo)本凍干后存放于武警后勤學(xué)院生藥學(xué)與藥劑學(xué)教研室。麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品（含量98%）：天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈：色譜純；冰醋酸、氨水、乙酸銨：試劑級(jí)；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀（泵型號(hào)LC-20AT型、紫外檢測器SPD-M20A、CTO-20柱溫箱）：日本Shimadzu公司；MT5百萬分之一電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；HH-2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋：常州市國華儀器有限公司；SHB-111循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗公司；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9000A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測定方法

1.2.1.1 色譜分析條件[5]

色譜柱：Kromasil100-5NH2柱（250mm×4.60mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-5mmol/L醋酸銨（80∶20，體積比）；流速：1.0mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液配制

精密稱取麥角硫因?qū)φ掌?.58mg，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得麥角硫因?qū)φ掌啡芤海?.158mg/mL）。分別取上述對(duì)照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液作為對(duì)照品溶液，置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 供試品溶液配制

精密稱取粉碎后的平菇下腳料樣品15 g于250mL容量瓶中，加入90mL蒸餾水，精密稱重后，于100℃下回流提取2 h，冷卻至室溫，用蒸餾水補(bǔ)齊重量后，搖勻，取2mL過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得供試品溶液，置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取上述對(duì)照品溶液0.5、2.5、5.0、7.5、10.0mL，置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容后進(jìn)行HPLC測定。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y為縱坐標(biāo)，麥角硫因的質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸方程計(jì)算，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5 樣品水分含量測定

精密稱取剪切成約0.5 cm×0.5 cm的平菇下腳料樣品各2.5 g，平鋪于干燥恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，在100℃～105℃干燥5 h。移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算樣品中的含水量（%），平行3次試驗(yàn)，確定原料中的水分，便于后續(xù)檢測提取工藝時(shí)計(jì)算收率。

1.2.2 平菇下腳料中麥角硫因的單因素提取工藝考察

通過預(yù)試驗(yàn)，確定溶劑回流提取為最優(yōu)的提取方法，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取4個(gè)因素各較優(yōu)的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)獲取最佳工藝參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.1.4項(xiàng)下的方法獲取了麥角硫因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.86×107X+368 952，R2=0.999 9，在濃度0.008mg/mL～0.158mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。對(duì)照品及平菇下腳料樣品的色譜圖如圖1所示。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液20μL重復(fù)進(jìn)樣5次，測定色譜峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD=0.69%，表明試驗(yàn)儀器精密度良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）和平菇下腳料樣品（B）的HPLC圖譜Fig.1 Chromatograms of reference substance（A）and sample（B）

2.2.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取平菇下腳料樣品5份，每份15 g，按1.2.1.3項(xiàng)下方法制備待測溶液，按1.2.1.1項(xiàng)下方法測定麥角硫因的峰面積，計(jì)算RSD=1.42%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、4、8、12、24 h精密吸取處理后的平菇下腳料提取液樣品溶液20μL進(jìn)樣，測定色譜峰面積，計(jì)算RSD為1.62%，結(jié)果表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知麥角硫因含量的平菇下腳料樣品15 g，分別加入相當(dāng)于樣品中麥角硫因含量的80%、100%、120%的對(duì)照品溶液，按1.2.1.3項(xiàng)下方法制備待測溶液，按1.2.1.1項(xiàng)下方法測定麥角硫因的峰面積，結(jié)果如表1所示。

表1 麥角硫因加樣回收率結(jié)果（n=3）Table1 The addition recovery of ergothioneine（n=3）

由表1可知，加樣回收率均在95%～105%之間，表明本方法的加樣回收率良好，符合要求。平均回收率為100.07%，RSD值為1.53%，回收率良好。

2.2.5 樣品水分含量測定[7]

按照1.2.1.5項(xiàng)下方法平行測定了5批平菇下腳料中的水分含量，其平均值為88.12%，RSD值為1.29%。

2.2.6 樣品中麥角硫因的含量測定[7]

按照1.2.1.3項(xiàng)下方法提取平菇下腳料提取物，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法測定各供試品中麥角硫因的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品溶液中麥角硫因的濃度，并利用公式計(jì)算各樣品的含量，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3次。

式中：C為供試品中麥角硫因的濃度，mg/mL；V為樣品的體積，mL；M為各樣品的質(zhì)量，g；W為各個(gè)樣品的水分含量，%。

式中：C1為供試品溶液中麥角硫因的濃度，mg/ mL；V1為樣品的體積，mL；M為各樣品的質(zhì)量，g；W為各個(gè)樣品的水分含量，%；A為平菇下腳料中麥角硫因的含量，%。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同提取溶劑對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響

按照1.2.1.3項(xiàng)下方法，選擇料液比1∶6（g/mL），回流提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)為1次，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，分別考察蒸餾水，10%乙醇水溶液，20%乙醇水溶液，30%乙醇水溶液對(duì)麥角硫因提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同濃度的乙醇水溶液對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響Fig.2 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different concentrations of ethanol

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，麥角硫因的提取率顯著下降，說明麥角硫因并不適于乙醇溶液進(jìn)行提取。因此提取溶液確定為水溶液。

2.3.2 pH值對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響

按照1.2.1.3項(xiàng)下方法，選擇料液比1∶6（g/mL），回流提取時(shí)間2h，提取次數(shù)為1次，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，分別考察pH值在4、5、6、7、8、9、10時(shí)純凈水溶液對(duì)麥角硫因提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH值對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響Fig.3 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different pH

由圖3可知，pH值對(duì)提取效果影響較大。當(dāng)水溶液的pH值＜7時(shí)，麥角硫因的提取效率較低，pH值為8時(shí)，麥角硫因的提取率最高，為81.2%，隨著pH值逐漸增加，當(dāng)pH值為10時(shí)，提取率顯著下降。因此確定pH值為8的弱堿性水溶液作為提取溶液。

2.3.3 不同料液比對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響

按照1.2.1.3項(xiàng)下方法，選擇pH值為8的水溶液作為提取溶劑，回流提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)為1次，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，分別考察料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）時(shí)對(duì)麥角硫因提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同料液比對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響Fig.4 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different material liquid ratio

由圖4可知，料液比不同對(duì)麥角硫因的提取率存在一定的影響。提取液中溶劑用量少時(shí)麥角硫因提取不完全，提取溶劑用量增大，會(huì)提高麥角硫因的提取率。但是提取溶劑繼續(xù)增加，對(duì)提取效果的幫助并不大，而且會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，增加后續(xù)溶劑回收成本。所以選取料液比為1∶6（g/mL）。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響

按照1.2.1.3項(xiàng)下方法，選擇pH值為8的水溶液作為提取溶劑，料液比1∶6（g/mL），提取次數(shù)為1次，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，分別考察提取時(shí)間為1、2、3、4 h時(shí)對(duì)麥角硫因提取效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響Fig.5 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different extract time

由圖5可知，麥角硫因的提前率隨提取時(shí)間的增加先增后降。說明適宜的時(shí)間可以促進(jìn)提取率的增加，當(dāng)提取時(shí)間過長會(huì)影響麥角硫因的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致提取率降低，因此選取提取時(shí)間為2 h。

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響

按照1.2.1.3項(xiàng)下方法，選擇pH值為8的水溶液作為提取溶劑，料液比1∶6（g/mL），回流提取2 h，按照1.2.1.1項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，分別考察提取次數(shù)為1次、2次、3次、4次時(shí)對(duì)麥角硫因提取效果的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同提取次數(shù)對(duì)提取平菇下腳料中麥角硫因的影響Fig.6 The effect on extract of ergothioneine from mushroom scraps with different extract times

由圖6可知，提取次數(shù)對(duì)麥角硫因的提取率具有一定的影響，但是當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到2次之后，提取率增加非常平緩，因此確定提取次數(shù)為2次。

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用L9（34）正交表，選取不同pH值的水溶液、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，以麥角硫因的含量為判斷指標(biāo)，對(duì)平菇下腳料中麥角硫因的提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)。各試驗(yàn)平行測定3次，取平均值。本正交試驗(yàn)應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析，以四因素三水平進(jìn)行了正交試驗(yàn)，因素與水平、結(jié)果與分析以及方差分析結(jié)果分別如表2、表3、表4。

表2 正交試驗(yàn)L9（34）因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 Results and analysis of orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table4 Variance analysis results of orthogonal test

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，根據(jù)R值的差異，對(duì)平菇下腳料中麥角硫因提取率的影響因素的主次順序?yàn)镈（提取次數(shù)）>B（料液比）>A（提取溶劑）>C（提取時(shí)間），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定的提取方法為D1B1A2C2，即最佳提取條件為pH=8的純凈水回流提取，料液比為1∶6（g/ mL），提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2次。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按2.4項(xiàng)下方法優(yōu)選出的最佳條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，麥角硫因的提取率分別為86.31%、87.13%、88.91%，平均值為87.45%，RSD為1.52%；麥角硫因的含量分別為：0.52%、0.51%、0.52%，平均值為0.517%，RSD為1.12%。與正交試驗(yàn)1號(hào)所得含量0.53%相比，由最佳提取條件所得的提取率高于單因素水平獲得的產(chǎn)品提取率，且通過最佳工藝的提取，獲得的提取物中麥角硫因的含量也相對(duì)較高，因此綜合分析將D1B1A2C2確定為最佳提取工藝。

3 結(jié)論

本研究采用加熱回流提取法對(duì)平菇下腳料中麥角硫因的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。分別以麥角硫因的提取率和麥角硫因的含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，考察了提取溶劑、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素對(duì)麥角硫因提取工藝的影響，最終確定平菇下腳料中麥角硫因的最優(yōu)工藝為：提取溶劑為弱堿性水溶液（pH=8），料液比1∶6（g/mL），提取時(shí)間為2 h，提取2次。通過驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該提取工藝的提取效率大幅度增加，且提取率達(dá)到了87.45%。該提取工藝具有提取率高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，為麥角硫因提取物的工業(yè)化大生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)與參考，同時(shí)也促進(jìn)了平菇下腳料的綜合利用，提升農(nóng)產(chǎn)品廢棄物的附加值，促進(jìn)地區(qū)循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

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Optimization of the Extraction Technique of Ergothioneine from Mushroom Scraps by Orthogonal Method

XUE Tian-kai1，2，ZHAO Yan-min2，LIN Ji-wei3，LIU Dai-lin2，*，LIU Cheng-hang4
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Logistics University of People's Armed Police Force，Tianjin 300309，China；3.Tianjin Hexi District Health Supervision Institute，Tianjin 300211，China；4.Tianjin Chroma-standard Medical Science&Technology Development Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

mushroom scraps；ergothioneine；orthogonal experiment；extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.010

2016-07-27

天津市科技支撐項(xiàng)目（12ZCZDNC01500）

薛天凱（1991—），男（漢），碩士，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

*通信作者：劉岱琳（1973—），女（漢），教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

Abstract：The extraction technique for ergothioneine from mushroom scraps of Pleurotus ostreatus（Fr.）Kummer was optimized.The analysis were performed on Kromasil 100-5NH2column with mobile phase consisted of acetonitrile-5mmol/L ammonium acetate solution（80∶20，volume ratio）.The detected wavelength was set at 254 nm.The content and the extraction yield of ergothioneine were used as index to evaluate the technologies based on single factor test，in which three factors were considered the concentration of extraction time，extraction times and solid-liquid ratio by orthogonal design.The best extraction conditions were as follows：ethanol concentration of10%，twice，extraction time of two hours and ratio of liquid to solid of1∶6（g/mL）.The optimized extraction rate could reach 87.45%，the content of ergothioneine was 0.5%.